专利名称：用于miRNA抑制剂和模拟物的化学修饰基序的制作方法
技术领域：
本发明涉及微小RNA (miRNA或miR)抑制剂及模拟物的化学基序，且尤其是涉及化学修饰的miRNA有义和反义多核苷酸，当施用于患者时，所述多核苷酸在效力、稳定性和/或毒性方面具有优势。
背景技术：
微小RNA(miR)涉及多种生物过程，包括心脏功能的调节和维持(参见 Chien KR， Molecular Medicine MicroRNAs and the tell-tale heart, Nature 447，389-390 (2007) ) 因此，miR代表了一类相对新的用于诸如心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管损伤以及病理性心脏纤维化等病症的治疗靶标。miRNA是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白编码RNA，其通过以下方式作为靶mRNA的阻遏剂发挥作用当它们的序列精确互补时促进靶mRNA的降解，或当它们的序列含有错配时则抑制翻译。成熟的miRNA链掺入RNA诱导沉默复合物(RISC)中，在这里其通过碱基对互补性而与其靶RNA关联。可通过反义多核苷酸或通过模拟miRNA功能的多核苷酸(“miRNA模拟物”)治疗性地靶向miRNA功能。然而，当将多核苷酸引入完整细胞时，它们受到核酸酶的攻击并降解，从而导致活性的损失。尽管已制备了多核苷酸类似物试图避免它们的降解，例如通过2’取代的方式(B. Sproat 等，Nucleic AcidsResearch 17 (1989), 3373-3386),但修饰通常影响多核苷酸预期生物作用的效力。在每种情况下，此类降低的效力可能是由于该修饰的多核苷酸不能与靶RNA形成稳定的二聚体，和/或丧失了与细胞机制的相互作用。需要用于改进miRNA抑制剂和miRNA模拟物的稳定性、效力和/或毒性概况的化学模式或基序，用于有效地靶向治疗背景中的miRNA功能。发明概述本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相对于它们作为miRNA抑制剂或miRNA模拟物的用途而言提供改进的稳定性、效力和/或毒性的化学模式。本发明还提供了包含该多核苷酸的药物组合物或制剂，以及治疗患有miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。在一个方面，本发明提供了具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，和至少一个末端或“帽”修饰的多核苷酸。该化学修饰基序可消除对完全硫代磷酸酯连接的多核苷酸和/或全长反义或有义miRNA序列的需求。该多核苷酸是miRNA抑制剂或miRNA模拟物，并且如本文所显示的那样，其提供了与未修饰的多聚核糖核苷酸相比和/或与其他可能的多核苷酸修饰相比经改进的效力。例如，该多核苷酸可以是具有如本文所述2’修饰之一或组合的miRNA抑制剂或miRNA模拟物，诸如选自O-烷基(0-alkyl)(例如，0-甲基或“OMe”)、卤素(例如，氟)、脱氧(H)和锁核酸(locked nucleic acid)的那些，以及在一些实施方案中,基本上所有、或所有的核苷酸2’位置均被修饰。在一些实施方案中，末端或帽修饰可以是5’和/或3’硫代磷酸酯单磷酸酯(phosphorothioate monophosphate)和/或无碱基部分,或本文描述的其他帽结构。该多核苷酸不需要完全是硫代磷酸酯连接的，但是在此类连接存在时，此连接可例如置于5’末端的两个末端核苷酸和3’末端的两个末端核苷酸之间。该核苷酸序列相对于成熟miRNA而言可以是全长的，或全长反义miRNA (成熟形式)，但在一些实施方案中，该多核苷酸包含截短的miRNA序列或截短的miRNA反义序列。此类修饰的截短序列可显示出高水平的效力，甚至当与更长的(未修饰或常规修饰的)对应物相比也如此。该多核苷酸可以是具有与miR-15b、miR-21、miR-208a或本文描述的其它(的全部或部分)互补的反义序列的antagomir。在第二个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸和可药用载剂的药物组合物或制剂。可将该药物组合物配制为各种可药用形式，包括胶体分散体系、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子、水包油乳剂、胶束、混合胶束或脂质体。该组合物可包括与胆固醇和其他 分子(诸如靶向配体)的缀合物，用于将该多核苷酸递送至靶标哺乳动物细胞。在第二方面，本发明提供了用于治疗具有miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。例如，该病症可以是心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管损伤以及病理性心脏纤维化的一种或多种。此类病症通过施用本发明的多核苷酸或组合物而得以治疗、预防或改善。因此，本发明提供了本发明的经修饰的多核苷酸和组合物用于治疗miRNA相关或mRNA表达相关病症的用途。
图I是示出了示范性miRNA修饰模式的表格。所示序列是成熟miR15b的反义序列(全长或截短的)。简写的描述提供于表3中。每一示例性RNA的“别名”包括:miRNA靶标(例如，15b) ;2’结构(0-甲基、“OMe”;或0-甲基和氟、“Me/F”;或0-甲基和脱氧、“Me/!1”;或锁核酸“11^”)；多核苷酸的大小(代表全长的FL或16-聚体)；以及在末端或内部的连接的结构，包括P0为磷酸二酯连接的，PS为硫代磷酸酯连接的，PS EO为每隔一个为硫代磷酸酯连接的，PS EC为硫代磷酸酯末端-帽，无碱基，以及POS为5’和3’硫代磷酸酯单磷酸酯。图2显示了应用双-萤光素酶测试法在Hela细胞中两个浓度即10nM(每一组中的左柱)和0. InM(每一组中的右柱)的图I中修饰的多核苷酸的体外测试结果。萤光素酶比率越大，抑制剂的效力越好。通过长度即16-聚体和全长对结果分组。高性能的化学物显不于表4中。图3显示了在双萤光素酶测试法中，IOnM(每组的左柱)和0. InM(每组的右柱)的硫代磷酸酯单磷酸酯修饰的多核苷酸与磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架直接相比较的结果。PO是磷酸二酯连接的，PS是硫代磷酸酯连接的，以及PO POS是在3’和5’末端均有末端硫代磷酸酯单磷酸酯的磷酸二酯连接。图4显不了在小鼠中用来自表5的多核苷酸5-14敲低miR_15b。测定了肝脏(每组的左柱)和心脏(每组的右柱)中的miR-15b丰度，并与用盐水注射的小鼠相比较。
图5显示了在新生大鼠心肌细胞中用修饰的反义多核苷酸抑制miR_208a。图5中的结果是PMHC表达的定量PCR。左柱显示了 IOOnM抑制剂的结果，以及右柱显示了 InM抑制剂的结果。图6显示了在双萤光素酶测试法中通过具有各种修饰的反义多核苷酸抑制miR-21。图7显示了以所示剂量注射大鼠后4种不同的修饰的miR_15b反义多核苷酸的体内组织分布。发明详述本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相对于它们作为miRNA抑制剂或miRNA模拟物的用途而言提供改进的稳定性、效力和/或毒性的化学模式。本发明还提供了包含该多核苷酸的药物组合物或制剂，以及治疗患有miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。 修饰的多核苷酸该多核苷酸具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，以及至少一个末端修饰或“帽”，如下文所示。该多核苷酸是miRNA抑制剂或miRNA模拟物，并且展示出与未修饰的多聚核糖核苷酸相比、和/或与其他可能的多核苷酸修饰相比的经改进的效力。如本文所述,“miRNA抑制剂”是具有与成熟单链miRNA或其部分反义(互补或如本文所述部分互补)的序列的多核苷酸。“miRNA模拟物”是具有相应于(相同或如本文所述基本相同)成熟单链miRNA或其部分的序列的多核苷酸。该多核苷酸具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰(就2’羟基而言)。掺入2’修饰的核苷酸(例如在反义寡核苷酸中)可增加寡核苷酸对核酸酶的抗性以及它们与互补RNA的热稳定性二者。在2’位置处的各种修饰可独立地选自提供了升高的核酸酶敏感性、而不影响与RNA靶标或细胞机制的分子相互作用的那些。此类修饰可基于它们在体外或体内升高的效力而进行选择。本文描述了用于确定miRNA抑制的升高效力的示例性方法(例如，IC50)。在一些实施方案中，2’修饰可独立地选自0-烷基(其可以是被取代的)、卤素、脱氧(H)和锁核酸。在某些实施方案中，基本上所有、或所有的核苷酸2’位置均是被修饰的，例如，独立地选自0-烷基(例如，0-甲基)、卤素(例如，氟)、脱氧(H)和锁核酸。例如，2’修饰可每一个独立地选自0-甲基和氟。在示例性实施方案中，每一个嘌呤核苷酸具有2’OMe，并且每一个嘧啶核苷酸具有2’-F。在某些实施方案中，剩下I至约5个2’位置、或约I至约3个2’位置未修饰(例如，2’羟基)。根据本发明的2’修饰可包括小烃取代基。该烃取代基包括烷基、烯基、炔基和烷氧烧基，其中烧基(包括烧氧基的烧基部分)、稀基和块基可以是被取代的或未被取代的。该烷基、烯基和炔基可以是Cl至ClO烷基、烯基或炔基，诸如C2或C3。该烃取代基可包括一个或两个或三个非碳原子，其可独立地选自N、0和/或S。该2’修饰可进一步包括烷基、烯基和炔基，如0-烷基、0-烯基和0-炔基。根据本发明的示例性2’修饰包括2’ -0-烷基(C1-3烷基，诸如2’ OMe或2’ OEt) >2 1 _0_ 甲氧乙基(2' _0_M0E) >2 1 _0_ 氣丙基(2' _0_AP) >2 1 _0_ _■甲基氣乙基C -0-DMA0E),2/ -0-二甲基氨丙基C -0-DMAP)、2' -0-二甲基氨乙基氧乙基(2' -0-DMAE0E)或 2' -O-N-甲基乙酰氨基(2' -0-NMA)。2’修饰可以是在所有核苷酸残基上、或在所有嘌呤核苷酸上的OMe。在某些实施方案中，该多核苷酸含有至少一个2’ -卤素修饰(例如，替代2’羟基)，诸如2’-氟、2’-氯、2’-溴和2’ -碘。在一些实施方案中，2’卤素修饰是氟。该多核苷酸可含有I至约20个2’ -卤素修饰(例如，氟)、或I至约10、或I至约5个2’ -卤素修饰(例如，氟)。在一些实施方案中，该多核苷酸全部含有2’ -氟核苷酸、或在所有嘧啶核苷酸上含有2’-氟。在某些实施方案中，2’-氟基团独立地是二甲基化、三甲基化或未甲基化的。多核苷酸可具有一个或多个2’ -脱氧修饰(例如，2’羟基的H)，但可含有I至约20个2’ -脱氧修饰，或I至约10、或I至约5个2’ -脱氧修饰。在一些实施方案中，该多核苷酸全部含有2’ -脱氧核苷酸。 在某些实施方案中，多核苷酸含有一个或多个“构象上被约束的”或二环糖核苷修饰(BSN)，其赋予含有BSN的多核苷酸与他们的互补微小RNA靶标链之间形成的复合物以增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个锁核酸(LNA)残基。LNA例如描述于美国专利6，268，490、美国专利6，316，198、美国专利6，403，566、美国专利6，770，748、美国专利6，998，484、美国专利6，670，461以及美国专利7，034，133中，所有这些专利均通过引用全文并入本文。“锁核酸”(LNA)是经修饰的核苷酸或核糖核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之间含有额外的桥联，从而导致“锁住的”构象。在一个实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个具有如结构A所示结构的LNA。在另一实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个具有如结构B所示结构的LNA。在再另一实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个具有如结构C所示结构的LNA。
H0\ /T
AB
.______
!
-I .f f = 、 d'x6 c其他可用于本发明的多核苷酸中的合适BSN修饰包括在美国专利6，403, 566和美国专利6，833，361中描述的那些，这两个专利均通过引用全文并入本文。在某些实施方案中，该多核苷酸包括约I至约10个锁核酸，或约2至约5个锁核酸。在示例性实施方案中，该多核苷酸含有如2’ OMe那样修饰的2’位置。备选地，嘌呤核苷酸在2’位置如2’ OMe那样修饰，而嘧啶核苷酸在2’位置如2’ -氟那样修饰。
该多核苷酸进一步包含至少一个末端修饰或“帽”。该帽可以是5’和/或3’帽结构。术语“帽”或“末端帽”包括在多核苷酸任一端(就末端核糖核苷酸而言)的化学修饰，并且包括在5’末端最后两个核苷酸以及3’末端最后两个核苷酸之间连接处的修饰。本文描述的帽结构增加了寡核苷酸对核酸外切酶的抗性，而不影响与RNA靶或细胞机制的分子相互作用。此类修饰可基于它们在体外或体内升高的效力而进行选择。本文描述了用于确定miRNA抑制的升高效力的示例性方法(例如，IC50)。帽可存在于5 ’ -端(5 ’ -帽)或3 ’ -端(3 ’ -帽)，或可存在于两端。在某些实施方案中，5’ -和/或3’帽独立地选自硫代磷酸酯单磷酸酯、无碱基残基(部分)、硫代磷酸酯连接、4’ -硫核苷酸、碳环核苷酸、二硫代磷酸酯连接、翻转核苷酸(inverted)或翻转无碱基部分(2’ -3’或3’ -3’ )、二硫代磷酸酯单磷酸酯以及甲基膦酸酯部分。当作为帽结构的一部分时，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接通常位于5’末端两个末端核苷酸以及3’末端两个末端核苷酸之间。在某些实施方案中，除了一个或多个上述2’修饰之外，多核苷酸还具有至少一个末端硫代磷酸酯单磷酸酯。该硫代磷酸酯单磷酸酯可通过抑制外切核酸酶的作用从而支持 miRNA抑制剂和miRNA模拟物的更高的效力，并且在一些实施方案中，消除对完全硫代磷酸酯(phosphorotioate)连接的多核苷酸和/或全长抑制剂的需求。硫代磷酸酯单磷酸酯可位于寡核苷酸的5’和/或3’末端。硫代磷酸酯单磷酸酯由以下结构定义，其中B是碱基，以及R是如本文所述2’修饰
权利要求
1.具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，以及至少一个末端帽结构的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含miRNA或miRNA反义核苷酸序列。
2.权利要求I的多核苷酸，其中所述末端帽结构包含硫代磷酸酯单磷酸酯(phosphorothioate monophosphate)或末端无喊基残基。
3.权利要求I或2的多核苷酸，其中所述一种或多种在2’位置的核苷酸修饰独立地选自0-甲基、氟、脱氧和锁核酸。
4.权利要求1-3中任一项的多核苷酸，其中基本上所有核苷酸2’位置均经修饰。
5.权利要求4的多核苷酸，其中每个核苷酸2’修饰独立地选自0-甲基和氟。
6.权利要求4的多核苷酸,其中每个核苷酸2’修饰是0-甲基。
7.权利要求4的多核苷酸，其中每个嘌呤核苷酸具有2’0_甲基，并且每个嘧啶核苷酸具有2’ -F。
8.权利要求1-7中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有至少一个末端硫代磷酸酯单磷酸酯。
9.权利要求8的多核苷酸，其中所述多核苷酸在3’末端和5’末端二者均具有末端硫代磷酸酯单磷酸酯。
10.权利要求1-7中任一项的多核苷酸,其中所述多核苷酸具有至少一个末端无碱基核苷酸。
11.权利要求10的多核苷酸，其中所述多核苷酸在3’末端和5’末端二者均具有末端无碱基核苷酸。
12.权利要求1-11中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸不含内部硫代磷酸酯连 接。
13.权利要求1-11中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有一个或多个内部硫代磷酸酯连接。
14.权利要求13的多核苷酸,其中所述多核苷酸仅在5’末端的两个末端核苷酸和3’末端的两个末端核苷酸之间含有内部硫代磷酸酯连接。
15.权利要求13的多核苷酸，其中所述硫代磷酸酯连接与磷酸二酯连接交替。
16.权利要求1-15的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含截短的成熟miRNA序列或截短的成熟miRNA反义序列。
17.权利要求1-15中任一项的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含全长成熟miRNA序列或全长成熟miRNA反义序列。
18.权利要求16或17的多核苷酸，其中所述多核苷酸为5至25个核苷酸长。
19.权利要求18的多核苷酸，其中所述多核苷酸为12至18个核苷酸长。
20.权利要求18的多核苷酸,其中所述多核苷酸为约16个核苷酸长。
21.权利要求16或17任一项的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含miRNA反义序列,其中所述反义序列与选自以下miR的成熟miRNA序列至少约75%互补l、133a、133b、143、.145、15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、424 和 486。
22.权利要求21的多核苷酸，其中所述miRNA反义序列与选自以下miR的成熟miRNA序列 100% 互补l、133a、133b、143、145、15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、.424 和 486。
23.权利要求16或17的多核苷酸，其中所述反义序列与成熟miR-15b、miR-21或miR-208a 互补。
24.权利要求23的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有图I或表6所示的序列和/或结构。
25.权利要求16或17任一项的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含miRNA序列,其中所述miRNA序列与选自以下miR的成熟miRNA序列至少约75%相同1、133a、133b、143、145、.15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、424 和 486。
26.权利要求25的多核苷酸，其中所述miRNA序列与选自以下miR的成熟miRNA序列.100%相同:l、133a、133b、143、145、15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、424和 486。
27.包含权利要求1-26中任一项的多核苷酸和可药用载剂的药物组合物。
28.权利要求27的药物组合物，其中所述组合物配制为胶体分散体系、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子、水包油乳剂、胶束、混合胶束或脂质体。
29.权利要求27或28的药物组合物，其中所述组合物配制用于皮内递送、皮下递送、肌内递送、腹膜内或静脉内递送。
30.权利要求27或28的药物组合物，其中所述组合物配制为通过心脏导管系统施用。
31.用于治疗具有miRNA表达相关病症的患者的方法，包括向所述患者施用权利要求.27-30中任一项的药物组合物。
32.权利要求31的方法，其中所述病症是心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管损伤和病理性心脏纤维化中的一种或多种。
33.权利要求31或32的方法，其中所述组合物通过心脏导管施用。
全文摘要
本发明提供了具有化学模式的多核苷酸，其提供了相对于它们作为miRNA抑制剂或miRNA模拟物的用途而言的改进的稳定性、效力和/或毒性。本发明还提供了包含该多核苷酸的药物组合物和制剂，以及治疗患有miRNA或mRNA表达相关病症的患者的方法。
文档编号C07H21/04GK102803284SQ201080035109
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者C.亚马达, W.S.马沙尔 申请人:米拉根医疗公司