专利名称：用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对rgm a蛋白质的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本申请描述了用于在视网膜神经纤维层变性(RNFL)治疗中使用的RGM A结合蛋白，特别是单克隆抗体，且特别是其CDR移植、人源化形式，其具有与RGM A结合且阻止RGM蛋白质与RGM A受体和其他RGM A结合蛋白结合的能力，并且因此中和RGM A的功能，以及针对RNFL变性在治疗或预防上治疗哺乳动物的方法。
背景技术：
在哺乳动物中枢神经系统(CNS)内的损伤、炎症攻击或神经变性疾病后的轴突再生几乎一直是不可能的；结果取决于在CNS中的神经纤维再生长的固有能力和在CNS内定位于病损或损害部位的微环境中的抑制因子之间的平衡，所述抑制因子活跃阻止再生长，并且因此阻止受损纤维束的再生。已确定由少突胶质细胞生成的CNS髓磷脂和病损瘢痕是关于在损伤早期中轴突生长的最相关的不允许结构，通过在体外以及在体内促使生长锥坍塌和神经突生长抑制，从而导致轴突再生长的直接抑制。RGM蛋白质，在CNS髓磷脂和瘢痕组织上的主要抑制因子已得到鉴定(Monnier 等人，Nature 419 :392 - 395, 2002 ；Schwab 等人，Arch. Neurol.62 :1561 - 8，2005a ;Schwab 等人及/r. J. Neurosci. 21 :1569 - 76，2005 b ;Hata 等人 J.Cell Biol. 173 :47 - 58，2006 ;关于综述，參见Mueller 等人，Philos. Trans. R. Soc.Lond. B Biol. Sci. 361 :1513 - 29, 2006 ;Yamashita 等人 Ci/rr. Opin. Neurobiol. 17:29 - 34,2007)。RGM蛋白质在死于脑外伤或缺血损伤的人中的损害或病损部位处是上调的(Schwab等人，ArcA. Neurol. 62 :1561 - 8, 2005a),并且在具有脊髓损伤的大鼠中的病损部位处是上调的(Schwab等人及/r. J. Neurosci. 21 1569 - 76, 2005 b ;Hata等人J. Cell Biol. 173 :47 - 58，2006，关于综述參见Mueller 等人，Philos. Trans. R. Soc.Lond. B Biol. Sci. 361 :1513 - 29, 2006 ;Yamashita 等人 Ci/rr. Opin. Neurobiol. 17:29 - 34,2007)。此外，使用来自多发性硬化患者和健康人的临床样品的第一手数据暗示人RGM A在患有MS的患者的脑脊髓液中是上调的(数据未显示)。为了评估RGM A特异性多克隆抗体的再生促进潜力，在中重度脊髄损伤模型中施用抗体，其中在胸椎水平9/10的约60%脊髄被横切。组织学检查掲示此类病损切断皮质脊髓束的所有背侧和外侧纤維。经由泵局部给予2周的RGM A特异性多克隆抗体诱导受损神经纤维的长距离再生(Hata等人，プCell BioL 173 :47 - 58，2006)。数百根神经纤维延伸经过病损部位，并且最长的纤维再生超出病损多过10 mm,而在对照抗体处理的动物中未发现病损远侧的再生纤维。与对照抗体处理的、脊柱受损的大鼠比较，抗RGM A处理的大鼠的功能恢复得到显著改善，从而证明RGM A是有力的神经再生抑制剂和用于在特征在于轴突损害或神经纤维损伤的适应症中刺激恢复的有价值靶(Hata等人，プ Cell Biol. 173 :47 - 58,2006 ;Kyoto 等人Tfes. 1186 :74 - 86，2007)。 此外，用功能阻断多克隆抗体中和RGM A蛋白质不仅刺激在脊柱受损大鼠中损害神经纤维的再生长，还增强其突触形成，从而使得能够再形成或恢复损害神经元回路(Kyoto等人Brain Res. 1186:74 - 86,2007)。rgm基因家族涵盖3种不同基因，其中2种，a和6在CNS产生RGM A和RGMB蛋白质的哺乳动物中表达，而第三个成员，rgm c在外周中表达(Mueller等人，Philos.Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361 :1513 - 29，2006)，其中 RGM C 在铁代谢中起重要作用。在体外，RGM A通过与Neogenin结合抑制神经突长出，所述Neogenin已鉴定为RGM 受体(Rajagopalan 等人舱ヵ Cell Biol. :6 (8)，756 - 62，2004)。Neogenin 首先被描述为netrin结合蛋白(Keino-Masu等人CWム87 (2) :175 - 85，1996)。这是重要发现，因为Netrin-I与Neogenin或其紧密相关受体DCC (在结肠直肠癌中是缺失的)的结合已报道为刺激而不是抑制神经突生长(Braisted等人プNeurosci. 20 :5792 - 801，2000)。阻断RGM A因此通过使得Neogenin能够结合其神经突生长刺激配体Netrin而释放RGM介导的生长抑制。基于这些观察，中和RGM A可以假定为在人脊髄损伤的模型中优于中和Neogenin。除RGM A与Neogenin结合和诱导神经突生长抑制外，RGM A或B与骨形态发生 蛋白BMP-2和BMP-4的结合可以代表关于成功神经再生和功能恢复的另ー个障碍(Mueller等)K, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361 :1513 - 29，2006)。RNFL是视网膜的最内层，并且主要由来自组成视神经的神经节细胞神经元的轴突组成。在RNFL内的轴突直到它们经过眼的筛板才是有髓的。RNFL的这个结构特征使得它成为检查在CNS内的神经变性过程的理想组织，因为RNFL厚度反映轴突的贡献，而无髓磷脂变性的潜在结构效应(Frohman等人，Arch. Neurol. 65 (I) :26 - 35，2008)(还參见
图19)。Frisen, L.和Hoyl，W. F.首次报道了在具有多发性硬化(MS)的患者中RNFL的变薄(Fris6n,L.和 Hoyl, W. F. , Arch. Opthalmol. 92:91 - 97,1974)。在健康个体中，RNFL到15岁时仅约110-120 Mm厚，并且最正常的个体在视网膜厚度中将丧失约0，017 % /年，这经过60年等于约10-20 Mm (Kanamori. A.等人，Ophthalmologica 217 :273 - 278，2003)。与这相反，已经历急性视神经炎(AON)的具有MS的约75%患者显示在最初炎症事件后，在仅约3-6个月的时期内10 - 40 Mm RNFL厚度丧失。还报道低于约75 Mm水平的RNFL变薄引起视觉功能的衰退(Costello等人，Ann.Neurol. 59 :963 - 969，2006)。由Frohman等人提出了 RNFL用于建模响应MS治疗的神经保护用途的潜在效用，其还描述了允许测量RNFL厚度的作为重现性成像技术的光学相干断层扫描(OTC) (Frohman 等人，參见上文；和 Frohman 等人；Nature Clinical PracticeNeurology 4:12,664 - 675,2008)。RNFL的变性在众多其他疾病的过程期间也观察到，如糖尿病视网膜病、缺血性视神经病、X染色体连锁视网膜劈裂症、药物造成的视神经病、视网膜营养不良、年龄相关的黄斑变性、特征在于视神经乳头玻璃疣的眼病、特征在于光感受器变性的遗传决定子的眼病、常染色体隐性遗传视锥视杆营养不良、线粒体病症伴视神经病、i.p.弗里德赖希(Friedreich’s)共济失调、阿尔茨海默氏病、轻度认知损害(MCI)、帕金森氏病和朊病毒病、i.p.克雅病(i.p. Creutzfeld-Jakob),瘙库病(Scrapie), BSE (还參见 Sakata LM 等人Clin. Experiment Ophtalmol. 2009,37 90 - 99 ；Morris 例等kOptometry 2009,80,83-100 ；Kallenbach K. & Frederiksen J. Eur. J. Afearo7. 2007,14 :841-849 ;Trick 等人 J. Neuroophtthalmol. 2006,26 :284-295 ；Tantri A.等)^Surv. Ophtalmol. 49 :214-230)。本领域存在关于允许直接治疗RNFL变性的治疗方法的需要。待由本发明解决的问题因此是提供允许如在大量疾病状况中观察到的RNFL变性的直接治疗特别是神经保护治疗的方法。发明概述
本发明的一个实施方案涉及使用能够结合RGM A的抗体神经保护治疗如在大量疾病状况中观察到的RNFL变性。另ー个实施方案涉及单克隆抗体用于治疗RNFL变性的用途，所述单克隆抗体阻断RGM A且阻止RGM A及其受体和/或结合蛋白即Neogenin和BMP-2、BMP-4之间的相互作用。 另ー个实施方案是治疗RNFL变性的方法，其包括给有此需要的哺乳动物施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含能够结合RGM A的抗体。附图简述
图IA显示了在ELISA测定中与hRGM A结合的单克隆抗体。图IB描述了与HEK 293细胞中表达的hRGM A结合的单克隆抗体。图IC描述了与HEK 293细胞中表达的大鼠RGM A结合的单克隆抗体。图2显示了全长RGM A与Neogenin的结合。MAB 5F9抑制全长fc偶联的hRGM A与Neogenin的结合。图3描述了全长RGM A与BMP-4的结合。MAB 5F9抑制fc偶联的全长hRGM A片段(47- 422)与BMP-4的结合。图4描述了 RGM A片段0与BMP-4的结合。MAB 5F9抑制fc偶联的hRGM A片段
0(47-168)与 BMP-4 的结合。图5描述了全长RGM A与BMP-2的结合。MAB 5F9抑制fc偶联的全长hRGM A片段(47- 422)与BMP-2的结合。图6是显示在NTera细胞神经突长出测定中RGM A片段的mAb5F9中和的显微照片组合。在具有人Ntera聚集体的神经突生长测定中，MAB 5F9中和fc缀合的、有力hRGM A抑制剂片段的长出抑制活性。A.对照培养，在层粘连蛋白上的Ntera神经元生长，B.在层粘连蛋白-hRGM A 片段(47 - 168)底物上，C. - E.在 0. I 吒/ml MAB 5F9(C.)、1 吒/mlMAB 5F9 (D. )、10 l^g/ml MAB 5F9 (E)的存在下，在层粘连蛋白-hRGM A 片段(47 - 168)底物上。图7显示了 NTera2测定结果的定量分析。在具有人Ntera聚集体的神经突生长测定中，MAB 5F9剂量依赖性中和fc缀合的、有力hRGM A抑制剂片段(片段0，47 - 168)的长出抑制活性。图8显示了 SH-SY5Y条纹测定的定量分析。MAB 5F9在条纹膜地毯(stripemembrane carpets)中中和通过条纹诱导的排斥,所述条纹由人神经元细胞的全长人RGM A组成。在不存在MAB 5F9的情况下(A)或在低MAB浓度的存在下，SH-SY5Y神经元优先避免RGM A条纹。这种行为通过增加浓度的MAB 5F9得到逆转(B至D)。在最高的MAB浓度下(10 l^g/ml) CE),与胶原I条纹比较，SH-SY5Y神经元显示对于RGM A条纹的强优先。图9概括了 mABs 5F9和8D1结合特征的定量分析。mABs 5F9和8D1在不同浓度下在 hRGM A - neogenin、hRGM A - BMP-2 和 hRGM A - BMP-4 结合测定中进行评估。图10显示了在SH-SY5Y趋化现象测定中关于人源化5F9抗体(h5F9. 21、h5F9. 23、h5F9. 25)的hRGM A的化学排斥活性的中和活性。图11显示了在视神经损伤的动物模型中局部5F9应用的体内神经再生活性。在视神经压伤的大鼠动物模型中MAB 5F9的局部应用中和RGM A且刺激损害视神经轴突的再生生长。在5F9处理的动物(A)中，与不与大鼠RGM A结合的对照MAB 8D1 (B)比较，许多GAP-43阳性纤维延伸超过压伤部位。图12A和图12B显示在视神 经损伤的动物模型中局部5F9应用的定量分析。(A)5F9而不是对照MAB 8D1显著增加再生GAP-43阳性纤维的数目。在距离200 Mm、400 Mm和600 Mm处，在用5F9处理的动物中观察到显著更多的纤维(p < 0. 05)，并且在1200 Mm处的纤维仅在5F9处理的动物而不是对照动物中发现。(B)与对照抗体8D1和媒介物(vehicle)对照PBS比较，5F9显著增加在视神经病损部位处的GAP-43阳性面积。使用Axiovision软件(Zeiss)测量再生生长的面积(GAP-43阳性面积)。图13显示了在视神经损伤的动物模型中全身性5F9应用的体内神经再生活性。动物在第0天和第21天时分别用2 mg/kg和10 mg/kg的5F9治疗。抗体或媒介物腹膜内或静脉内给予。大鼠视神经的复合图像。在5F9处理的动物(A)中，与用PBS处理的对照动物(B)比较，许多GAP-43阳性纤维延伸超过压伤部位。压伤部位定位于左侧边缘处，并且再生纤维用针对GAP-43的抗体染色。在5F9处理的动物而不是PBS动物中在视神经的上和下边上观察到许多纤維。图14 A和图14 B显示了在视神经损伤的动物模型中全身性5F9应用的定量分析。图15显示了在视神经损伤的动物模型中全身性5F9应用的体内髓鞘再生活性。动物在第0天和第21天时分别用2 mg/kg和10 mg/kg的5F9治疗。抗体或媒介物腹膜内或静脉内给予。大鼠视神经的复合图像。使用针对髓磷脂标记髓磷脂碱蛋白MBP的抗体显现髓鞘形成。压伤部位定位于复合神经的中间，并且该区域在媒介物处理的对照动物中是空的(A和B)。在5F9处理的动物中(C和D)，在视神经的中间区域(压伤中心)观察到许多MBP阳性结构。图16显示了在视神经损伤的动物模型中全身性5F9应用对髓鞘再生的定量作用。图17举例说明了抗体5F9对来自具有视神经压伤的动物眼的RNFL的优良保护作用。在用5F9全身性处理的动物的视网膜中观察到显著更高密度的神经纤维束。图18举例说明了抗体5F9对来自具有视神经压伤的动物眼的视网膜内神经元的影响。在用5F9抗体全身性处理的动物的视网膜中观察到显著更高数目的萌芽视网膜内神经元。图19举例说明了视网膜神经纤维层(RNFL)，这是与玻璃球(vitreous bulb)直接相邻的层。它由视网膜神经节细胞的轴突形成。其他的层是内丛状层(IPL)，其中无长突和双极神经元与视网膜神经节细胞形成突触接触。光感受器、水平神经元和双极神经元在外丛状层(OPL)中形成突触。光感受器(视杆和视锥)定位于光感受器层(PRL)中。RPE是视网膜色素上皮(方案来自Frohman等人ArcA. Neurol. 65,26-35,2008)。发明详述 I.术语定义除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应是明确的，然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。进一歩地，除非上下文另有要求，単数术语应包括复数，并且复数术语应包括単数。在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。此外，术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。此外，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过ー个亚单位的元件和组分，除非另有具体说明。—般地，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知且如各种一般和更具体的參考文献中所述的常规方法执行，所述參考文献在本说明书自始至终引用且讨论，除非另有说明。酶促反 应和纯化技术根据制造商的说明书执行，如本领域通常完成的或如本文描述的。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学結合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送、和患者的治疗。如本说明书和附加权利要求自始至终使用的，下述术语具有下述含义
术语“受体”和“受体抗体”指提供或编码ー个或多个构架区的至少80 %、至少85至少90 %、至少95 %、至少98 %或100 %氨基酸序列的抗体或核酸序列。在某些实施方案中，术语“受体”指提供或编码ー个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另外ー个实施方案中，术语“受体”指提供或编码ー个或多个构架区和一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在ー个具体实施方案中，术语“受体”指人抗体氨基酸或核酸序列，其提供或编码ー个或多个构架区的至少80 %、特别是至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或100 %氨基酸序列。依照这个实施方案，受体可以含有至少I、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基，其在人抗体的ー个或多个具体位置上不出现。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可以例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体、或商购可得的抗体)。如本文使用的，术语“抗体”泛指由4条多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生，其保留Ig分子的基本表位结合特征。此类突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。如果抗体能够与分子特异性反应，以从而结合分子与抗体，那么它被说成“能够结合”分子。术语“抗体缀合物”指结合蛋白，例如与第二种化学部分例如治疗剂或细胞毒剂化学连接的抗体。术语“试剂”指示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物学材料制成的提取物。特别地，治疗剂或细胞毒剂包括但不限于百日咳毒素、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化こ啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、ニ羟基炭疽菌素ニ酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。如本文使用的，术语“抗体构建体”指包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的本发明的ー个或多个抗原结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的2个或更多个氨基酸残基，并且用于连接ー个或多个抗原结合部分。此类接头多肽是本领域众所周知的(參见例如，Hol Iiger，P 等人(1993)Natl. Acad. Sci. USA90 :6444 - 6448 ；Poljak，R. J.等人(1994)泣ァ此如ァ吆1121 - 1123)。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的且在表I中表示。表I :人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
权利要求
1.一种用于在视网膜神经纤维层(RNFL)变性治疗中使用的对于人RGM A的结合蛋白。
2.用于如权利要求I中定义使用的结合蛋白，其中所述治疗是治疗或预防、神经再生或神经保护、局部或全身性治疗。
3.用于如权利要求I或2中定义使用的结合蛋白，其中作为所述治疗的结果 a).观察到视网膜神经元萌芽；和/或 b).在视网膜中的RGC(视网膜神经节细胞)轴突保护免于变性。
4.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其中所述RNFL变性与选自下述的疾病相关 糖尿病视网膜病、缺血性视神经病、X染色体连锁视网膜劈裂症、药物造成的视神经病、视网膜营养不良、年龄相关的黄斑变性、特征在于视神经乳头玻璃疣的眼病、特征在于光感受器变性的遗传决定子的眼病、常染色体隐性遗传视锥视杆营养不良、和线粒体病症伴视神经病。
5.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其以IX 10_7 M或更少的Kd和IX IO-2 s—1或更少的I^ff速率常数与人RGM A解离，两者都通过表面等离振子共振測定。
6.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，如在标准体外測定中測定的，其与人RGM A结合且中和人RGM A的神经突长出抑制活性。
7.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其为人源化抗体。
8.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其包含抗原结合结构域，所述结合蛋白能够结合RGM分子的表位，所述抗原结合结构域包含选自下述的至少ー个CDR a)由SEQID NO 59和65组成的⑶R-H3组氨基酸序列，和与所述序列之一具有至少50 %序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列； 和/或 b)由SEQID NO 62和68组成的⑶R-L3组氨基酸序列，和与所述序列之一具有至少50 %序列同一性的修饰的⑶R氨基酸序列。
9.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其进ー步包含选自下述的至少ー个 CDR a).由SEQID NO 57和63组成的⑶R-Hl组的氨基酸序列；和/或 b).由SEQID NO 60和66组成的CDR-Ll组的氨基酸序列；和/或 c).由SEQID NO 58和64组成的⑶R-H2组的氨基酸序列；和/或 d).由SEQID NO :61和67组成的CDR-L2组的氨基酸序列； 和与所述序列之一具有至少50 %序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。
10.用于如权利要求9中定义使用的结合蛋白，其包含选自由下述组成的可变结构域⑶R组的至少3个⑶Rs VH5F9 组I:[: VH5F9CDR-Hl SEQIDN0. : 34 的残基 31-35SEQIDN0:57 VH5F9CDR-H2 SEQIDN0. : 34 的残基 50-66SEQIDN0:58 VH5F9CDR-H3 SEQIDN0. : 34 的残基 99-104 SEQIDN0:59 VL5F9 组 VL5F9CDR-LI SEQIDN0. : 10 的残基 24-39SEQIDN0:60 VL5F9CDR-L2 SEQIDN0. : 10 的残基 55-61SEQIDN0:61 VL5F9CDR-L3 l|EQIDN0. : 10 的残基 94-102 [SEQIDN0:62 :
11.用于如权利要求10中定义使用的结合蛋白，其包含至少2个可变结构域⑶R组。
12.用于如权利要求11中定义使用的结合蛋白，其中所述至少2个可变结构域CDR组选自 VH 5F9组和VL 5F9组；和 VH 8D1 组和 VL 8D1 组。
13.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其进ー步包含人受体构架。
14.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其包含选自SEQID NO :35,36,37、38、39、40、41、42和43的至少ー个重链可变结构域；和/或选自SEQ ID N0:44、45和46的至少ー个轻链可变结构域。
15.用于如权利要求13和14中任ー项中定义使用的结合蛋白，其中所述人受体构架包含在关键残基处的至少ー个构架区氨基酸置換，所述关键残基选自 (重链序列位置):1、5、37、48、49、88、98 ; (轻链序列位置)2、4、41、51。
16.前述权利要求中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含具有选自下述的氨基酸序列的至少ー个(构架突变的)可变结构域 (重链序列)SEQ ID NO :47、48、49、50 ;和 (轻链序列)SEQ ID NO :51、52、53 和 54。
17.用于如前述权利要求中任ー项中定义使用的结合蛋白，其是选自5F9和8D1的抗体。
18.ー种用于治疗RNFL变性的方法，其包括给有此需要的哺乳动物施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含分离的如权利要求1-17中任一项中定义的结合蛋白。
19.权利要求18的方法，其中所述治疗是治疗或预防、神经再生或神经保护、局部或全身性治疗。
全文摘要
本申请描述了用于在视网膜神经纤维层(RNFL)变性治疗中使用的RGM A结合蛋白，特别是单克隆抗体，且特别是其CDR移植、人源化形式，其具有与RGM A结合且阻止RGM蛋白质与RGM A受体和其他RGM A结合蛋白结合的能力，并且因此中和RGM A的功能，以及描述了针对RNFL变性在治疗或预防上治疗哺乳动物的方法。
文档编号C07K16/22GK102656190SQ201080055275
公开日2012年9月5日 申请日期2010年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者K. 米勒 B. 申请人:雅培股份有限两合公司