用于亲和色谱法的冲洗溶液和方法

专利名称：用于亲和色谱法的冲洗溶液和方法
用于亲和色谱法的冲洗溶液和方法
背景技术：
基于目标蛋白与固相如凝胶基质靶标的优先结合，亲和色谱法可以从分子混合物如细胞采集物纯化所述目标蛋白。该固相组分通常被制成柱子，供施加含有目标蛋白的混合物从中通过。在此初始步骤(称为捕获步骤)中，目标蛋白特异性地与固相靶标结合而混合物中的其它组分流过柱子。然而，混合物中的某些组分，包括高分子量物(HMW)、低分子量物(LMW)和宿主细胞蛋白(HCP)，可能作为杂质与目标蛋白一起保留在柱子内。因此，通常进行一个或多个冲洗步骤，该步骤中将一种或多种冲洗溶液施加 在柱子上以去除这些杂质同时保持目标蛋白与固相的结合。最后，在通过冲洗步骤去除杂质之后，通过洗脱步骤从柱子中回收目标蛋白，该步骤中将破坏目标蛋白与固相靶标的结合的洗脱溶液施加在柱子上并且在洗脱液中回收目标蛋白。因此，亲和色谱法在纯化目标蛋白中的有效性在很大程度上取决于确定可以高效去除杂质(例如HMW、LMW、HCP)同时不破坏目标蛋白与固相靶标的结合或另外不具有不希望的影响的冲洗条件。一种特别有用的亲和色谱法类型是用于纯化含有免疫球蛋白Fe段的蛋白质如抗体和Fe融合蛋白的蛋白A色谱法。已经描述有多种冲洗溶液用于从蛋白A柱去除杂质，包括含有以下之一的冲洗溶液疏水性电解质(例如PH为5. 0-7. O的氯化四甲铵、氯化四乙铵、氯化四丙铵或氯化四丁铵)、溶剂(例如5-20%异丙醇或聚丙烯/己二醇)、脲(例如浓度为1-4M)、洗涤剂(例如O. 1-1%吐温20或吐温80)、聚合物(例如5-15%聚乙二醇，如PEG400或PEG8000)或pH在5. O和7. O之间的浓度为O. 8-2. OM的高浓度缓冲溶液如Tris、HC1、醋酸盐、硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液(参见例如Shukla，A.A.和Hinckley, P.(2005) Biotechnol. Prog. 24:1115-1121 ；Blank 的美国专利第 6，127，526 号和第 6，333，398号；和Breece等的美国专利第6，870，034号)。然而，这些化学制剂许多都有一种或多种缺点，包括但不限于毒性、腐蚀性、可燃性、不稳定性、作为危险废物的高处置成本和/或在冲洗步骤期间去除污染物的低效率。还描述了单独含有盐(如氯化钠)或与洗涤剂(例如吐温20)、溶剂(例如己二醇)或聚合物(例如聚乙二醇)组合的蛋白A色谱法冲洗缓冲液(Breece等的美国专利第6，870，034 号)。Barron等描述了用于蛋白A色谱法的中间冲洗溶液(intermediate washsolution)，其在pH为5· 0-7. 5的磷酸盐/醋酸盐缓冲液中含有O. 5至2. OM精氨酸(最佳为IM精氨酸，pH为5. O的O. IM磷酸盐/醋酸盐缓冲液)。该精氨酸冲洗步骤据报道用于去除HCP污染物。作者还测试了 pH为5. 0-7. 5含有O. 5-2. OM氯化钠的中间冲洗溶液，但是报告NaCl冲洗未显不HCP的显著减少(Barron等，“ Improving Purity on Protein AAffinity Media Through Use of an Arginine Intermediate Wash Step”，http://www.priorartdatabase. com/IPCQM/000127319)。Sun等也描述了亲和色谱柱(如蛋白A柱)的冲洗，使用含有精氨酸或精氨酸衍生物、浓度为O. 1-2. OM并且pH为4. 5-8. O的冲洗缓冲液(美国专利公布第20080064860号和第 20080064861 号；PCT 公布第 WO 2008/031020 号)。
精氨酸还被用于从亲和色谱柱和其它类型的纯化柱洗脱蛋白质。例如，Arakawa等描述了使用含有O. 5-2. OM精氨酸、pH为4. 1-5. O的洗脱缓冲液从蛋白A柱洗脱抗体的方法(Arakawa 等，(2004) Protein Expression and Purification 36:244-248 Tsumoto,K.等，(2004)Biotechnol. Prog.迪1301-1308 ;美国专利公布第 20050176109 号)。此外，Ejima等的美国专利第7，501，495号描述了使用含有盐酸精氨酸的展开液从凝胶过滤柱洗脱蛋白质的方法。Ghose等描述了使用精氨酸梯度作为洗脱剂从未衍生化二氧化硅洗脱目标蛋白的方法(Ghose, S.等，(2004)Biotech. Bioeng. 87:413-423)。Coffman 等的美国专利公布第20030050450号描述了从含Fe分子和蛋白A的复合物分离含Fe分子的方法，其中将Fe/蛋白A复合物施加在疏水作用柱(HIC)上并且用含有精氨酸的缓冲液冲洗柱子。发明概述本发明提供用于亲和色谱法的高效而耐用的冲洗溶液以及使用该溶液的冲洗方法。该冲洗溶液在洗脱步骤之前的冲洗步骤中应用，其使用产生从亲和基质洗脱的高产率和高浓度的目标蛋白，同时有效地从施加到基质的起始物料去除高分子量物(HMW)和宿主细胞蛋白(HCP)。冲洗溶液的特征在于同时存在精氨酸(或精氨酸衍生物)和非缓冲盐，如 卤盐。冲洗溶液优选处于8. O以上的高pH。精氨酸(或精氨酸衍生物)和非缓冲盐的所述组合比单独含有精氨酸或盐的冲洗溶液去除明显更多的杂质并且产生与回收的目标蛋白的高浓度相关的陡峭的洗脱峰。因此，在一个方面，本发明提供使用供目标蛋白结合的亲和色谱(AC)基质制备纯化的目标蛋白的方法，所述方法包括在从AC基质洗脱目标蛋白之前用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种或多种冲洗溶液冲洗AC基质。优选地，在用一种或多种冲洗溶液冲洗之前将目标蛋白上样到AC基质上，并且在用一种或多种冲洗溶液冲洗(具体来讲)以从AC基质去除杂质之后从AC基质洗脱目标蛋白。在一个优选实施方案中，所述AC基质是蛋白A柱。在多种其它实施方案中，AC基质可以例如选自由以下组成的组蛋白G柱、蛋白A/G柱、蛋白L柱、固定化金属尚子未和色谱(IMAC)柱、钙调素树脂柱、MEP HyperCel 柱、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱、结合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的柱和结合Strep-Tag II的柱。虽然与本文中描述的亲和基质结合的其它蛋白质也适用于根据本发明方法的纯化，但是在一个优选实施方案中，所述目标蛋白是与AC基质如蛋白A柱结合的抗体或抗体片段。在一个优选实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液包含盐酸精氨酸，浓度优选在
O.05-2. OM的范围，更优选在O. 05-0. 85M的范围，最优选在O. 1-0. 5M的范围。在具体的实施方案中，盐酸精氨酸存在的浓度为0. IM或约0. 1M、0. 25M或约0. 25M，或0. 5M或约0. 5M。在其它实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液包含精氨酸衍生物，如选自由以下组成的组的衍生物乙酰基精氨酸、N-α - 丁酰基-精氨酸、胍丁胺(agmatine)、arginic acid和Ν-α-特戊酰基(pyvaloyl)精氨酸。虽然也涵盖D-精氨酸，但是所述精氨酸或精氨酸衍生物优选包含L-精氨酸。在一个优选实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液中的非缓冲盐是氯化钠(NaCl)，浓度优选在0. 1-2. OM的范围。在具体的实施方案中，NaCl存在的浓度为0. 75M或约0. 75MU.0M或约1.011，或1.2511或约I. 25M。在其它实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液中的非缓冲盐选自由氯化钾、氯化钙和氯化镁组成的组。
在一个具体实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH大于8. O,优选至少为8. 1，更优选至少为8. 5并且更优选至少为8. 9。在一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在8. 1-9. 5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在
8.5-9. 5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH为约9. O。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的PH为9. O。本文中描述的精氨酸和非缓冲盐冲洗组合优选在含有两种组分的单一冲洗溶液中应用(即用同时包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种冲洗溶液冲洗所述AC基质)。或者，可以在先后的冲洗中使用两种冲洗溶液，一种含有精氨酸或精氨酸衍生物(优选PH大于8. O)并且另一种含有非缓冲盐。因此，在冲洗方法的另一个实施方案中，用第一冲洗溶液和第二冲洗溶液这两种冲洗溶液冲洗AC基质。在一个实施方案中，所述第一冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物，所述第二冲洗溶液包含非缓冲盐。在另一个实施方案中，第一冲洗溶液包含非缓冲盐，第二冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。本发明的冲洗方法可有效去除各种杂质，包括高分子量(HMW)物和宿主细胞蛋白 (HCP) ο在另一个方面，本发明提供使用蛋白A柱制备纯化的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括(a)将包含所述抗体或抗体片段的混合物上样到蛋白A柱上；(b)用包含(i)浓度在O. 05-2. OM(更优选O. 05-0. 85M，最优选O. 1-0. 5M)范围的盐酸精氨酸和(ii)浓度在O. 1-2. OM范围的氯化钠的冲洗溶液冲洗所述蛋白A柱，其中所述冲洗溶液从蛋白A柱中去除杂质；和(c)从所述蛋白A柱洗脱所述抗体或抗体片段。在具体的实施方案中，盐酸精氨酸存在的浓度为O. IM或约O. 1M、0. 25M或约O. 25M,或O. 5M或约O. 5M。在具体的实施方案中，NaCl存在的浓度为O. 75M或约O. 75M、1. OM或约I. 0Μ，或I. 25Μ或约I. 25Μ。在多种实施方案中，冲洗溶液的PH大于8. 0，优选至少为8. 1，更优选至少为8. 5，更优选为9. 0，在
8.1-9. 5的范围，或在8. 5-9. 5的范围。发明详述本发明提供用于亲和色谱法如蛋白A色谱法的新型冲洗溶液，其在洗脱目标蛋白之前被施加到柱上以去除杂质。所述新型冲洗溶液由精氨酸或精氨酸衍生物和非缓冲盐组成。通常所述冲洗溶液是水溶液。本文中使用的术语“非缓冲盐”是指存在于所述冲洗溶液中的其类型和浓度使得它在应用条件(如高pH)下添加酸或碱时对保持冲洗溶液的pH大体上没有帮助的盐。通常，所述非缓冲盐是离子盐。非缓冲盐包括卤盐，包括包含Cl或BH更优选Cl)的卤盐，具体来讲是包含碱金属或碱土金属(包括Na、K、Ca和Mg，更优选Na或K)的卤盐。术语“非缓冲盐”不包括在应用条件下大体上有助于保持冲洗溶液的PH的缓冲盐，如醋酸钠、磷酸钠和Tris。在一个优选实施方案中，所述非缓冲盐是卤盐(例如包含Cl或Br)。在另一个实施方案中，非缓冲盐是包含钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)或镁(Mg)(更优选为钠(Na)或钾(K))的卤盐。在又一个实施方案中，非缓冲盐选自由NaCUKCl、CaCl2和MgCl2组成的组。在一个特别优选的实施方案中，非缓冲盐是氯化钠(NaCl)。通常所述非缓冲盐在至少IM的“高”浓度使用。其它合适的浓度和浓度范围在下面进一步描述。冲洗组分的该新型组合比常用的工序去除更多的杂质而不影响回收率。此外，该冲洗条件产生与洗脱液中的目标蛋白的较高浓度相关的陡峭的洗脱峰，这对提高其它下游纯化过程的效能是有利的。杂质(包括宿主细胞蛋白(HCP)和产物相关的杂质如高分子量(HMW)物和低分子量(LMW)物)的高效去除在目标蛋白的下游加工期间是关键的因素。亲和色谱法常被用作用于目标蛋白(例如抗体)的多阶段纯化过程的第一阶段，并且亲和色谱法之后的目标蛋白的纯度显著地影响随后的纯化步骤的种类和数目。亲和色谱法的另一个重要作用是浓缩产物，这允许在随后的纯化步骤中使用相应减小的、成本更低的柱子。因此，优化在亲和色谱法步骤期间的杂质去除是特别重要的。低pH条件(通常介于pH 3 - 4之间)对于从亲和基质洗脱结合了的目标蛋白是必要的，但具有潜在地诱导聚集的缺点。历史上，更宽松的条件(如PH 5-5.5)已经用于从柱上冲洗非特异性结合的杂质，同时保持目标蛋白和亲和基质之间的相互作用。然而，由于在这些条件下，特别是在高上样密度操作时目标蛋白的部分洗脱，目标蛋白的回收率往往降低。因此，在一个优选实施方案中，本发明提供的冲洗溶液可在大于8. O的高pH有利地使用，这在允许杂质去除的同时保持目标蛋白与亲和基质的结合。
本发明提供的用于亲和色谱法的新型冲洗溶液是基于精氨酸(或精氨酸衍生物)和非缓冲盐的混合物，优选在高pH使用。存在于一般的采集物或细胞萃取液中的杂质的广泛的生物物理多样性导致产生与色谱介质的固相和/或结合了的目标蛋白的相互作用的非常多样的方式。杂质的强度高低不同的束缚可能是两个分子之间的非共价分子间相互作用的结果，如氢键、静电相互作用、疏水性和范德华力或这些相互作用类型的组合。因此，用以去除杂质的若干不同机理的组合很可能比基于去除杂质的单一机理的方法更有效。基于本文中的分析数据，就非缓冲盐在冲洗溶液中的作用而论，介于目标蛋白和亲和基质的配体之间的高亲和相互作用不被高非缓冲盐浓度下的冲洗破坏，而被非特异性地束缚到固定化配体或结合了的目标蛋白的带电残基上的带电污染物可被高效地去除。因此，虽然不希望受机理限制，仍认为在冲洗溶液中使用的非缓冲盐能够破坏介于被非特异性地束缚到亲和色谱基质的一种或多种组分(例如，基质的化学载体如树脂，固定在基质上的亲和配体和/或与固定在基质上的配体结合的目标靶标)的带电残基上的带电污染物(杂质)之间的离子相互作用，而不破坏结合靶标与固定化配体的特异性结合。就精氨酸在冲洗溶液中的作用而论，据报道精氨酸能够增溶某些析出的蛋白质(Umetsu, M.等，(2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 328:189-197; Tsumoto, K.等，(2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 312:1383-1386)，减少聚集体的形成(Arakawa, T.等，(2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:148-152),并且减少蛋白质非特异性吸附到表面上(Ejima，D.等，(2005) J. Chromatogr. A. 1094:49-55) 虽然不希望受机理限制，仍认为蛋白质聚集的减少可能源自对蛋白质上与精氨酸相互作用的疏水补丁(hydrophobicpatch)的掩蔽。该相互作用可在精氨酸上的胍基和蛋白质上的色氨酸基之间发生，或经由精氨酸群集引起的疏水补丁的形成而发生，或可以是这些作用的组合。就在冲洗溶液中使用大于8. O的pH而论,碱性pH可以使HCP和HMW部分变性,而包括单体抗体的稳定蛋白质不受这些条件影响。虽然不希望受机理限制，仍认为污染物蛋白质的变性可以表现为轻微的结构变化，其可能足以减弱非特异性结合。因此，冲洗溶液的高pH对于通过使杂质与结合了的目标蛋白或亲和基质的固体载体的相互作用失稳来提高杂质的去除可能是有益的。
因此，在一个方面，本发明提供使用供目标蛋白结合的亲和色谱法(AC)基质制备纯化的蛋白质的方法，所述方法包括在从AC基质洗脱目标蛋白之前用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种或多种冲洗溶液冲洗AC基质。本文中使用的术语“亲和色谱基质”或“AC基质”意图指固相介质，通常是凝胶或树脂，其允许生物化学混合物的分离，基 于在目标蛋白和AC基质之间的高特异性结合相互作用，如在受体和配体、酶和底物或抗原和抗体之间。因此，所述固相介质包含目标蛋白能够可逆地固着(取决于缓冲条件)的靶标。可以包含AC基质的固定化或固相介质的非限制性实例包括凝胶基质如琼脂糖微球(如可商购的S印harose基质)和玻璃基质如多孔玻璃微球(如可商购的ProSep基质)。目标蛋白与AC基质的结合通常通过柱色谱法实现。即，将AC基质制成柱子，使含有目标蛋白的生物化学混合物流过所述柱子，随后通过使一种或多种冲洗溶液流过柱子来冲洗柱子，随后通过使洗脱缓冲液流过柱子来从柱子洗脱目标蛋白。或者，目标蛋白与AC基质的结合可以通过分批处理实现，其中使所述含有目标蛋白的生物化学混合物与所述AC基质一起在容器中孵育以允许目标蛋白与AC基质结合，从容器中去除固相介质(例如通过离心)，冲洗固相介质以去除杂质并且再回收(例如通过离心)以及从固相介质洗脱目标蛋白。在又一个实施方案中，可以使用分批处理和柱色谱法的组合。例如，目标蛋白与AC基质的最初的结合可以通过分批处理实现并且随后可以将固相介质装填到柱子中，随后冲洗柱子并且从柱子洗脱目标蛋白。特定的固相基质的性质(具体来讲是附着于固相的靶标的结合性质)决定了可以使用该固相基质纯化的蛋白质的类型。例如，在本发明的一个优选实施方案中，AC基质是蛋白A柱，其包含作为附着于固相的靶标的细菌细胞壁蛋白(蛋白A)，其特异性地结合在某些免疫球蛋白的Fe段内的CH2和CH3结构域。蛋白A的结合性质在本领域中是已确立的。因此，在本发明的一个优选实施方案中，目标蛋白(待纯化)是抗体或包含Fe段的抗体片段。此外，可以使用蛋白A色谱法纯化的其它蛋白质包括Fe融合蛋白。就能够与蛋白A基质特异性结合的任何蛋白质而言，其均可以根据本发明的方法来纯化。多种蛋白A树脂在本领域是熟知的并且适于在本发明中使用。可商购的蛋白A 树脂的非限制性实例包括 MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、rProtein ASepharose FF、rmpProtein A Sepharose FF、Protein A Sepharose CL-4B 和 nProteinA Sepharose 4 FF (均可商购自 GE Healthcare) ；ProSep A> ProSep-vA High Capacity、ProSep-vA Ultra and ProSep-Va Ultra Plus(均可商购自 Millipore) ；Poros A 和Mabcapture A(均可商购自 Poros) ;IPA_300、IPA-400 和 IPA-500 (均可商购自 RepliGenCorp.) ；Affigel protein A 和 Affiprep protein A (均可商购自 Bio-Rad) ；MABsorbentAlP 和 MABsorbent A2P (均可商购自 Affinity Chromatography Ltd.) ；Protein ACeramic Hyper D F(可商购自 Pall Corporation) ；Ultralink Immobilized protein A和 Agarose protein A (均可商购自 PIERCE);以及 Protein A Cellthru 300 和 Protein AUltraflow(均可商购自 Sterogen Bioseparations)。除了蛋白A色谱法之外，本发明的冲洗方法可以应用于其它亲和色谱系统。例如，在另一个实施方案中，AC基质可以是蛋白G柱、蛋白A/G柱或蛋白L柱，其中每个也都是具有本领域中确定的结合性质的免疫球蛋白结合细菌蛋白。因此，AC基质即蛋白G基质、蛋白A/G基质或蛋白L基质可以用于纯化抗体、包含Fe段的抗体片段和Fe融合蛋白。AC基质和它们可有效纯化的蛋白质类型的其它非限制性实例包括以下固定化金属离子亲和色谱(IMAC)柱(用于纯化对金属离子具有亲和力的蛋白质，如组氨酸标签蛋白)、钙调素树脂柱(用于纯化带有钙调素结合肽(CBP)标签的蛋白质)、MEP HyperCel 柱(选择性地结合免疫球蛋白的纤维素基质)、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱子(如选择性地结合带有MBP标签的蛋白质的Dextrin Sepharose 树脂)、结合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的柱子(如选择性地结合带有GST标签的蛋白质的Glutathione Sepharose 树脂和结合Strep-Tag II的柱子(如选择性地结合带有Strep-Tag II标签的蛋白质的Strep-Tactin Sepharose树脂)。此外,免疫亲和基质(其包含作为固着到固相上的革巴标的抗体)可用于纯化与固着到固相上的抗体特异性结合的目标抗原。
虽然本文具体地针对使用蛋白A色谱法的抗体的纯化来描述目标发明，但是就本领域已知的与特定的AC基质选择性结合的任何蛋白质而言，该蛋白质可接受使用本文中描述的冲洗方法来纯化。本发明的冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。在本发明中可以使用的精氨酸可以是天然氨基酸精氨酸(例如L-精氨酸)、D-精氨酸或精氨酸衍生物。精氨酸衍生物的非限制性实例包括酰化精氨酸，如乙酰基精氨酸和N- α - 丁酰基-精氨酸、胍丁胺、arginicacid和N-α-特戊酰基精氨酸。精氨酸或精氨酸衍生物可以以酸加成盐的形式使用。可以形成酸加成盐的酸的实例包括盐酸等。在冲洗溶液中的精氨酸或精氨酸衍生物的浓度通常在O. 05Μ和2. OM之间(例如 O. 05Μ、0. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 35Μ、0. 4Μ、0· 45Μ、0. 5Μ、0· 55Μ、0. 6Μ、0· 65Μ、
0.7Μ、0· 75Μ、0. 8Μ、0· 85Μ、0. 9Μ、0· 95Μ、1· 0Μ、1· 1Μ、1· 15Μ、1· 20Μ、1· 25Μ、1· 30Μ、1· 35Μ、
1.40Μ、I. 45Μ、I. 5Μ、I. 55Μ、I. 6Μ、I. 65Μ、I. 7Μ、I. 75Μ、I. 8Μ、I. 85Μ、I. 9Μ、I. 95Μ 或 2. 0Μ)，更优选在O. 05和O. 85Μ(这是精氨酸在20°C水中的上限溶解度)之间(例如O. 05Μ、0· 1Μ、O. 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 35Μ、0. 4Μ、0· 45Μ、0. 5Μ、0· 55Μ、0. 6Μ、0· 65Μ、0. 7Μ、0· 75Μ、0. 8Μ或 O. 85Μ)，最优选在 O. I 和 O. 5Μ 之间(例如 O. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 35Μ、0. 4Μ、O. 45Μ或O. 5Μ)。在多种实施方案中，精氨酸或精氨酸衍生物的浓度可以是例如O. 05Μ、O. 1Μ、0· 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 4Μ、0· 5Μ、0· 6Μ、0· 7Μ 或 O. 8Μ，或在 O. IM 和 O. 5Μ 之间。在某些实施方案中，在冲洗溶液中精氨酸或精氨酸衍生物的浓度是O. 25Μ或更大。在具体的实施方案中，精氨酸存在的浓度为O. IM或约O. 1Μ、0· 25Μ或约O. 25Μ，或O. 5Μ或约O. 5Μ。本发明的冲洗溶液还包含非缓冲盐(如上所述)，其类型和浓度使得足以破坏在杂质和亲和基质的一种或多种组分之间的离子相互作用。在一个优选实施方案中，非缓冲盐是卤盐。在一个特别优选的实施方案中，非缓冲盐是氯化钠(NaCl)。在其它实施方案中，非缓冲盐可以是例如氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)。在冲洗溶液中的非缓冲盐浓度通常在 O. IM 和 2. OM 之间(例如 O. 1Μ、0· 15Μ、0. 2Μ、0· 25Μ、0. 3Μ、0· 35Μ、0. 4Μ、
0.45Μ、0. 5Μ、0· 55Μ、0. 6Μ、0· 65Μ、0. 7Μ、0· 75Μ、0. 8Μ、0· 85Μ、0. 9Μ、0· 95Μ、1· 0MU. 1Μ、1· 15Μ、
1.20Μ、I. 25Μ、I. 30Μ、I. 35Μ、I. 40Μ、I. 45Μ、I. 5Μ、I. 55Μ、I. 6Μ、I. 65Μ、I. 7Μ、I. 75Μ、I. 8Μ、
I.85Μ、1· 9Μ、1· 95Μ 或 2. 0Μ)，或在 O. 5Μ和 I. 5Μ 之间(例如 O. 5Μ、0· 55Μ、0· 6Μ、0· 65Μ、0· 7Μ、
O.75Μ、0. 8Μ、0· 85Μ、0. 9Μ、0· 95Μ、I. 0MU. 1Μ、I. 15Μ、I. 2Μ、I. 25Μ、I. 3Μ、I. 35Μ、I. 4Μ、I. 45Μ或 I. 5M)，或在 IM 和 2M 之间(例如 1M、I. 1M、I. 15M、I. 2M、I. 25M、I. 3M、I. 35M、I. 4M、I. 45M、
1.5Μ、1· 55Μ、1· 6Μ、1· 65Μ、1· 7Μ、1· 75Μ、1· 8Μ、1· 85Μ、1· 9Μ、1· 95Μ 或 2Μ)。在某些实施方案中，在冲洗溶液中的非缓冲盐的浓度是IM或更大。在具体的实施方案中，在冲洗溶液中的非缓冲盐存在的浓度为O. 75Μ或约O. 75Μ、I. OM或约I. 0Μ,或I. 25Μ或约I. 25Μ。虽然更低的pH也适用于本发明的冲洗溶液，但是本发明的冲洗溶液的pH通常大于8. O。在一个具体的实施方案中，pH大于8. 0，优选至少为8. 1，更优选至少为8. 5或8. 9。在一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的PH在8. 1-9. 5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在8. 5-9. 5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的PH为约9. O。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH为9. O。或者，取决于待纯化的目标蛋白，可以使用更低的PH值，例如在pH 5. 0-8. O范围的pH，或7. 5或7. O或6. 5或5. O的pH。取决于待纯化的蛋白质的性质，本领域的一般技术人员可以选择冲洗溶液的适当的PH值。因此，所述冲洗溶液可以含有用于调节和/或保持pH的 一种或多种缓冲液。在冲洗溶液中可以包括的典型缓冲液的非限制性实例包括Tris (三(羟甲基)甲胺)、双-Tris、双-Tris丙烷、组氨酸、三乙醇胺、二乙醇胺、甲酸盐、醋酸盐、MES (2-(N-吗啉基)乙烷磺酸)、磷酸盐、HEPES (4-2-羟乙基-I-哌嗪乙烷磺酸)、柠檬酸盐、MOPS(3-(N-吗啉基)丙烷磺酸)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙烷磺酸)、Bicine (N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、Tricine (N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TES (2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙烷磺酸)、PIPES (哌嗪-N，N’ -双(2-乙烷磺酸)、二甲胂酸盐(cacodylate) ( 二甲基胂酸)和SSC (盐水朽1檬酸钠)。本文中描述的精氨酸和非缓冲盐冲洗组合优选在含有两种组分的单一冲洗溶液中应用。或者，可以在先后的冲洗中使用两种冲洗溶液，一种含有精氨酸或精氨酸衍生物(优选在高pH)并且另一种含有非缓冲盐。因此，在冲洗方法的另一个实施方案中，在洗脱目标蛋白之前，用第一冲洗溶液和第二冲洗溶液这两种冲洗溶液冲洗AC基质。在一个实施方案中，第一冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物(优选在大于8. O的pH)，第二冲洗溶液包含非缓冲盐。在另一个实施方案中，第一冲洗溶液包含非缓冲盐，第二冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物(优选在大于8. O的pH)。用于冲洗溶液的合适的精氨酸衍生物和非缓冲盐以及优选浓度、浓度范围和PH条件的实例如上所述。本发明的冲洗方法可有效去除各种杂质，包括高分子量(HMW)物和宿主细胞蛋白(HCP)。如在实施例中详细描述，本发明的冲洗溶液可有效减少洗脱液中的HMW物和HCP两者，同时实现在洗脱液中目标蛋白的高百分比产率和在洗脱液中目标蛋白的高浓度。例如，在多种实施方案中，使用本文中描述的冲洗方法产生大于95%的目标蛋白的百分比产率，更优选大于96%，更优选大于97%。就洗脱液中HMW物的减少(可以表示为洗脱液中的HMW%)而论，在多种实施方案中使用本文中描述的冲洗方法产生小于10%的在洗脱液中的HMW%，或小于5%，或小于2. 0%，或小于1%或小于O. 5%。就洗脱液中HCP的减少(可以表示为对数减少值(LRV))而论，在多种实施方案中使用本文中描述的冲洗方法产生至少为I. I的对于洗脱液中HCP的LRV，或至少为I. 3，或至少为I. 5，或至少为2. 0，或至少为2. 3，或至少为
2.5，或至少为2. 7。虽然本文针对在亲和色谱法期间的冲洗步骤来描述本发明，但是对本领域一般技术人员显而易见的是，在冲洗步骤前后进行其它步骤以实现从亲和色谱基质纯化目标蛋白。例如，在冲洗步骤之前，本发明的方法可以包括平衡步骤，其中将亲和色谱基质用上样缓冲液平衡；和上样或捕获步骤，其中将含有目标蛋白的生物化学混合物(例如细胞采集物)施加到AC基质上。用于平衡和上样缓冲液的合适的条件将取决于AC基质和待纯化的目标蛋白的性质而不同，并且本领域一般技术人员可以使用本领域已确立的方法和信息容易地确定这些条件。用于在蛋白A柱上纯化抗体的平衡和上样缓冲液的非限制性实例在实施例I和2中阐述。此外，在如上所述的冲洗步骤之后，本发明的方法可以包括使用普通冲洗溶液的一个或多个其它冲洗步骤，和/或洗脱步骤，其中将洗脱缓冲液施加到亲和色谱基质上以从基质洗脱目标蛋白。用于洗脱缓冲液的合适的条件将取决于AC基质和待纯化的目标蛋白的性质而不同，并且本领域一般技术人员可以使用本领域已确立的方法和信息容易地确定这些条件。通常，在酸性PH进行目标蛋白从AC基质的洗脱。用于在蛋白A柱上纯化抗体的洗脱缓冲液的非限制性实例在实施例I和2中阐述。在另一个方面，本发明提供在抗体的蛋白A纯化期间用于从含抗体混合物去除杂质的优选方法。因此，本发明提供使用蛋白A柱制备纯化的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括
a)将包含抗体或抗体片段的混合物上样到所述蛋白A柱上；b)用包含⑴和(ii)的冲洗溶液冲洗蛋白A柱(i)浓度在O. 05-2. OM的范围(更优选在O. 05-0. 85M的范围，最优选在O. 1-0. 5M的范围)的盐酸精氨酸，和(ii)浓度在O. 1-2. OM的范围的氯化钠，其中所述冲洗溶液从蛋白A柱中去除杂质；和c)从蛋白A柱洗脱所述抗体或抗体片段。优选地，冲洗溶液在大于8. O的pH。盐酸精氨酸的优选浓度和浓度范围如上所述。例如，在一个优选实施方案中，盐酸精氨酸的浓度为约O. 25M或O. 25M。氯化钠的优选浓度和浓度范围如上所述。例如，在一个优选实施方案中，氯化钠的浓度为约IM或1M。优选的pH和pH范围同样如上所述。例如，在一个实施方案中，冲洗溶液的pH在8. 1-9. 5的范围。在另一个实施方案中，冲洗溶液的PH是8. 5或更大。在另一个实施方案中，冲洗溶液的pH为 9. O。通过以下实施例进一步说明本发明，不应当将以下实施例视为进一步的限制。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请均明确地以全文引用的方式并入本文。
实施例实施例I :精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液与其它冲洗溶液的比较在本实施例中，比较了多种冲洗溶液在亲和色谱法期间从含抗体溶液去除杂质的有效性。更具体地讲，比较了三种冲洗溶液一种不含精氨酸和非缓冲盐pH为5. 0，第二种含有非缓冲盐但不含精氨酸PH为7. O，第三种同时含有非缓冲盐和精氨酸pH为9. O。通过深层过滤采集含有介于I. 5和2. 5g/L之间抗体的澄清、哺乳动物细胞培养上清液并且使用ALC柱(具体来讲是蛋白A柱(GE Healthcare))纯化，根据以下表I中描述的条件进行表I蛋白A柱的操作条件
权利要求
1.一种使用供目标蛋白结合的亲和色谱(AC)基质制备纯化的目标蛋白的方法，所述方法包括在从所述AC基质洗脱所述目标蛋白之前，用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和( )非缓冲盐的一种或多种冲洗溶液冲洗所述AC基质。
2.根据权利要求I所述的方法，其中用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种冲洗溶液冲洗所述AC基质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述冲洗溶液包含盐酸精氨酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述非缓冲盐是氯化钠(NaCl)。
5.根据权利要求I所述的方法，其中用第一冲洗溶液和第二冲洗溶液这两种冲洗溶液冲洗所述AC基质，其中 (a)所述第一冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物，所述第二冲洗溶液包含非缓冲盐；或 (b)所述第一冲洗溶液包含非缓冲盐，所述第二冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是与蛋白A柱结合的抗体或抗体片段。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种冲洗溶液从所述AC基质中去除杂质。
8.一种使用蛋白A柱制备纯化的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括 a)将包含所述抗体或抗体片段的混合物上样到所述蛋白A柱上； b)用包含(i)浓度在O.05-0. 85M范围的盐酸精氨酸和(ii)浓度在O. 1-2. OM范围的氯化钠的冲洗溶液冲洗所述蛋白A柱，其中所述冲洗溶液从所述蛋白A柱中去除杂质；和 c)从所述蛋白A柱洗脱所述抗体或抗体片段。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述盐酸精氨酸的浓度为O.25M或约O.25M。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述氯化钠的浓度为IM或约1M。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述一种或多种冲洗溶液的pH大于8. O。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一种或多种冲洗溶液的pH在约8. 5-9. 5的范围内。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述另一冲洗溶液的pH是9.O。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述杂质包含高分子量(HMW)物。
15.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述杂质包含宿主细胞蛋白(HCP)。
全文摘要
本发明提供一种用于亲和色谱法的冲洗方法，其中包含精氨酸或精氨酸衍生物和非缓冲盐的优选在大于8.0的高pH的冲洗溶液可有效去除杂质如高分子量物和宿主细胞蛋白，同时还提高洗脱液中的产物浓度并且保持回收产物的高百分比产率。
文档编号C07K16/00GK102725304SQ201080057457
公开日2012年10月10日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月18日
发明者A·弗劳恩舒, K·比尔 申请人:诺瓦提斯公司