专利名称：一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法。
背景技术：
迷迭香(Rosmarinus offoconalis L.)为唇形科迷迭香属植物，富含多种高效、 安全的抗氧化成分。迷迭香提取物是一类新型优良的天然抗氧化剂，能够有效清除体内自 由基，防止食品变质，并且具有消炎、抗肿瘤、抗艾滋病毒等功效([1]杨燕.迷迭香抽提物 的性质与应用[J]·中国食品工业，1999，(3) :38-39. [2]OffordEA, MaceK, Avanti 0，et al. Cancer Letters [J], 1997,114(12) :275-281.)。鼠尾草酸(Carnosic Acid, CA)是迷迭 香脂溶性抗氧化剂中最主要的有效成分，不仅具有抗氧化活性，而且具有抗癌特性，在化妆 品、药物和保健品等领域有广泛的应用。目前国内外对分离鼠尾草酸的研究中主要存在以下难点1、鼠尾草酸在众多溶剂 中稳定性很差，易被氧化，溶剂分离方法几乎不可能获得高含量产品；2、普通硅胶柱层析方 法分离鼠尾草酸的时间均较长，鼠尾草酸组分流出慢，效率低；3、大多数分离的后续步骤包 含重结晶过程中，鼠尾草酸不仅溶剂稳定性差，而且热稳定性同样不好；4、成本高，不具有 实际经济效益。因此，国际国内市场上能够提供的鼠尾草酸标准品的最高含量为92%。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种从迷迭香叶提取物中分离 鼠尾草酸的方法，利用该方法鼠尾草酸组分流出快，时间短，且含量高。为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤(1)将柱层析硅胶分散在由无水乙醇磷酸=200 2. 5 200 7. 5v/v制成的 磷酸-乙醇溶液中，所述磷酸硅胶为1 40 3 40v/w，抽真空，再超声浸润，然后回收 乙醇，烘干得到磷酸-硅胶固定相；(2)将迷迭香叶提取物溶于乙酸乙酯中，将迷迭香叶提取物磷酸-硅胶固定相 =1 4 1 6w/w，加入磷酸-硅胶固定相，充分搅拌后回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香 叶提取物的固定相；(3)将步骤(1)的磷酸-硅胶固定相填充至已通入高纯氮气保护的层析柱管中，得 到磷酸-硅胶层析柱；(4)将步骤O)的吸附迷迭香叶提取物的固定相加入到步骤(3)的磷酸-硅胶层 析柱中进行分离，采用乙酸乙酯正己烷=5 95 18 82v/v的混合溶液作为洗脱液， 收集洗脱组分；(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，冷藏至晶体析出，倾出溶剂，晶体经真空 干燥后，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸。优选地，所述步骤(1)中磷酸硅胶为2 40。
优选地，所述步骤O)中迷迭香叶提取物磷酸-硅胶固定相=1 5。如果磷 酸-硅胶固定相过少，迷迭香叶提取物超出硅胶的担载量，分离的色带易重叠，影响分离效 果；过多，会造成磷酸-硅胶固定相的浪费，因此，迷迭香叶提取物磷酸-硅胶固定相= 1 5最为适宜。用少量磷酸-硅胶固定相来吸附迷迭香叶提取物，提高了鼠尾草酸在样品 处理过程中的利用率。优选地，所述步骤(4)中乙酸乙酯正己烷=10 90v/v，乙酸乙酯含量过多，洗 脱液极性太大，会使洗脱速度过快，鼠尾草酸和其他较高极性的物质不能得到很好的分离； 乙酸乙酯含量过少，洗脱速度过慢，分离时间长导致鼠尾草酸被氧化，因此，乙酸乙酯正 己烷=10 90v/v最为适宜。和现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果本发明使用磷酸-硅胶固定相来分离鼠尾草酸，通过酸性环境在一定程度上保持 了鼠尾草酸的稳定性；只需一次过柱就将鼠尾草酸单独分离出来，过柱时间短，鼠尾草酸在 第一个色带前已出峰，即在分离时组分最先流出，可以节省洗脱液的用量，提高经济效益； 操作时间短，有效地提高了鼠尾草酸的纯度，通氮气保护结晶后含量可达92%，抗氧化活性 好，达到市售标准品含量指标。
具体实施例方式以下结合具体实施例来详细说明本发明。以下实施例所用试剂与仪器如下柱层析硅胶Q00-300固，青岛海洋化工厂)、正己烷、乙酸乙酯、磷酸(均为市售分 析纯试剂)、石英双蒸水(由申请人实验室自制)、含60%鼠尾草酸的迷迭香叶提取物(市
佳)
口 乂 OLC-10AT vp plus高效液相色谱仪(日本岛津公司)由两台LC-10AT vp plus 输液泵、一台SPD-10A vp plus紫外检测器、一台CBM-10A vp plus系统控制仪、一只 77251六通进样阀和Lcsolution lite色谱工作站组成；色谱柱DELTAPAKC18 (5 μ m, 150x 3. 9mmID, Waters)。操作条件为80%甲醇(B溶液)和20%含0. 5%磷酸的磷酸溶液(A溶 液)等度洗脱，流量为lml/min。检测波长^4nm。进样量20 μ 1。 RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。实施例1从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤(1)在500ml圆底烧瓶内加入200ml无水乙醇和2. 5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶 液，称取100克柱层析硅胶分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅胶颗粒间的 空气，防止过柱过程中鼠尾草酸被氧化，再超声浸润20min，置于旋转蒸发仪内回收乙醇，于 120°C烘干8小时得磷酸-硅胶固定相，备用；(2)称取2克含60%鼠尾草酸的迷迭香叶提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷 酸-硅胶固定相，充分搅拌，于旋转蒸发仪内回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固 定相；(3)空柱管通以高纯氮气将其中空气排出，在通氮保护的条件下按下述步骤装柱 称取90克磷酸-硅胶固定相，加入500ml无水正己烷，超声浸润20min，再抽真空15min，得
4到磷酸-硅胶正己烷分散液，备用；将磷酸-硅胶正己烷分散液搅拌，使磷酸-硅胶固定相 均勻悬浮在正己烷中(装柱过程均保持分散状态)，缓慢倒入层析柱管中，打开柱管旋塞， 使溶剂均勻流下。在磷酸-硅胶固定相完全沉积前加入后续磷酸-硅胶正己烷分散液，保 证柱床层致密均勻。磷酸-硅胶固定相形成理想床层后保证磷酸-硅胶固定相上部至少有 Icm以上的正己烷，不使柱头变干，从而得到磷酸-硅胶层析柱；(4)将吸附迷迭香叶提取物的固定相用无水正己烷分散，按装柱方法装于柱床层 的上部，在样品上部用少量脱脂棉固定；用含5%乙酸乙酯的正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱液流量每分钟3_5ml。 当色层距滤板约3cm时开始收集，每IOOml收集一次。用含5%乙酸乙酯的正己烷洗脱色层 至无色后，增加乙酸乙酯的比例至15%，继续洗脱，至鼠尾草酸的检测为阴性。对每批接收 液，采用高效液相色谱法分析鼠尾草酸的最高含量为83%。(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，添加少量脱气溶剂，冷藏至晶体析出，倾 出溶剂，晶体经40°C真空干燥后，转入样品瓶，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸，晶体重0. 5 克，HPLC测定鼠尾草酸含量为85 %。实施例2从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤(1)在500ml圆底烧瓶内加入200ml无水乙醇和5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶 液，称取100克柱层析硅胶分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅胶颗粒间的 空气，防止过柱过程中鼠尾草酸被氧化，再超声浸润20min，置于旋转蒸发仪内回收乙醇，于 120°C烘干8小时得磷酸-硅胶固定相，备用；(2)称取2克含60%鼠尾草酸的迷迭香叶提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷 酸-硅胶固定相，充分搅拌，于旋转蒸发仪内回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固 定相；(3)空柱管通以高纯氮气将其中空气排出，在通氮保护的条件下按下述步骤装柱 称取90克磷酸-硅胶固定相，加入500ml无水正己烷，超声浸润20min，再抽真空15min，得 到磷酸-硅胶正己烷分散液，备用；将磷酸-硅胶正己烷分散液搅拌，使磷酸-硅胶固定相 均勻悬浮在正己烷中(装柱过程均保持分散状态)，缓慢倒入层析柱管中，打开柱管旋塞， 使溶剂均勻流下。在磷酸-硅胶固定相完全沉积前加入后续磷酸-硅胶正己烷分散液，保 证柱床层致密均勻。磷酸-硅胶固定相形成理想床层后保证磷酸-硅胶固定相上部至少有 Icm以上的正己烷，不使柱头变干，从而得到磷酸-硅胶层析柱；(4)将吸附迷迭香叶提取物的固定相用无水正己烷分散，按装柱方法装于柱床层 的上部，在样品上部用少量脱脂棉固定；用含10%乙酸乙酯的正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱液流量每分钟 3-5ml。当色层距滤板约3cm时开始收集，每IOOml收集一次。用含10%乙酸乙酯的正己烷 洗脱色层至无色后，增加乙酸乙酯的比例至12%，继续洗脱，至鼠尾草酸的检测为阴性。对 每批接收液，采用高效液相色谱法分析鼠尾草酸的最高含量为89%。(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，添加少量脱气溶剂，冷藏至晶体析出，倾 出溶剂，晶体经80°C真空干燥后，转入样品瓶，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸，晶体重0. 6 克，HPLC测定鼠尾草酸含量为92 %。
实施例3从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤(1)在500ml圆底烧瓶内加入200ml无水乙醇和7. 5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶 液，称取100克柱层析硅胶分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅胶颗粒间的 空气，防止过柱过程中鼠尾草酸被氧化，再超声浸润20min，置于旋转蒸发仪内回收乙醇，于 120°C烘干8小时得磷酸-硅胶固定相，备用；(2)称取2克含60%鼠尾草酸的迷迭香叶提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷 酸-硅胶固定相，充分搅拌，于旋转蒸发仪内回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固 定相；(3)空柱管通以高纯氮气将其中空气排出，在通氮保护的条件下按下述步骤装柱 称取90克磷酸-硅胶固定相，加入500ml无水正己烷，超声浸润20min，再抽真空15min，得 到磷酸-硅胶正己烷分散液，备用；将磷酸-硅胶正己烷分散液搅拌，使磷酸-硅胶固定相 均勻悬浮在正己烷中(装柱过程均保持分散状态)，缓慢倒入层析柱管中，打开柱管旋塞， 使溶剂均勻流下。在磷酸-硅胶固定相完全沉积前加入后续磷酸-硅胶正己烷分散液，保 证柱床层致密均勻。磷酸-硅胶固定相形成理想床层后保证磷酸-硅胶固定相上部至少有 Icm以上的正己烷，不使柱头变干，从而得到磷酸-硅胶层析柱；(4)将吸附迷迭香叶提取物的固定相用无水正己烷分散，按装柱方法装于柱床层 的上部，在样品上部用少量脱脂棉固定；用含12%乙酸乙酯的正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱液流量每分钟 3-5ml。当色层距滤板约3cm时开始收集，每IOOml收集一次。用含12%乙酸乙酯的正己烷 洗脱色层至无色后，增加乙酸乙酯的比例至15%，继续洗脱，至鼠尾草酸的检测为阴性。对 每批接收液，采用高效液相色谱法分析鼠尾草酸的最高含量为86%。(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，添加少量脱气溶剂，冷藏至晶体析出，倾 出溶剂，晶体经80°C真空干燥后，转入样品瓶，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸，晶体重0. 5 克，HPLC测定鼠尾草酸含量为87%。
权利要求
1.一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将柱层析硅胶分散在由无水乙醇磷酸=200 2. 5 200 7. 5v/v制成的磷 酸-乙醇溶液中，所述磷酸硅胶为1 40 3 40v/w，抽真空，超声浸润后回收乙醇，烘 干得到磷酸-硅胶固定相；(2)将迷迭香叶提取物溶于乙酸乙酯中，按迷迭香叶提取物磷酸-硅胶固定相为 1 4 1 6w/w的比例，加入步骤(1)的磷酸-硅胶固定相，充分搅拌后回收乙酸乙酯， 得到吸附迷迭香叶提取物的固定相；(3)将步骤(1)的磷酸-硅胶固定相填充至已通入高纯氮气保护的层析柱管中，得到磷 酸-硅胶层析柱；(4)将步骤O)的吸附迷迭香叶提取物的固定相加入到步骤(3)的磷酸-硅胶层析柱 中进行分离，采用乙酸乙酯正己烷=5 95 18 82v/v的混合溶液作为洗脱液，收集 洗脱组分；(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，冷藏至晶体析出，倾出溶剂，晶体经真空干燥 后，充高纯氮气保存，即得。
2.根据权利要求1所述的从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，其特征在于，所 述步骤⑴中磷酸硅胶为2 40。
3.根据权利要求1所述的从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，其特征在于，所 述步骤O)中迷迭香叶提取物磷酸-硅胶固定相=1 5。
4.根据权利要求1所述的从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，其特征在于，所 述步骤中乙酸乙酯正己烷=10 90v/vo全文摘要
本发明公开一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括将柱层析硅胶分散在磷酸-乙醇溶液中，抽真空，再超声浸润，然后回收乙醇，烘干得磷酸-硅胶固定相；磷酸-硅胶固定相装填至已通入高纯氮气保护的层析柱管中，得到磷酸-硅胶层析柱；将迷迭香叶提取物溶于乙酸乙酯中，加入磷酸-硅胶固定相，充分搅拌后回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固定相，将吸附迷迭香叶提取物的固定相加入到磷酸-硅胶层析柱中，洗脱，收集馏分并真空干燥后得到鼠尾草酸。本发明只需一次过柱就将鼠尾草酸单独分离出来，过柱时间短，纯度可达92％，有利于产品在市场中的应用。
文档编号C07C51/42GK102115442SQ20111000101
公开日2011年7月6日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者左雄军, 曾健青, 粱钰, 陈瞾 申请人:广州和博生物科技有限公司