专利名称：一种抗原蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种抗原蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性高致死性兔传染病。本病具有病死率高、死亡快，而且传播迅速等特点，对养兔业的健康发展造成了严重威胁，因而被国际兽疫局正式列为“国际动物保健编目”B类传染病，我国农业部也将之列为二类动物疫病。兔病毒性出血症是1984年由我国学者首次发现并报道，随后欧洲、大洋洲、北非、澳洲、美洲和亚洲等世界各主要养兔国也纷纷爆发报道了 RHD疫情。目前，RHD已蔓延至我国25个省、市和地区，给养兔业造成了严重经济损失，被视为养兔业的“头号杀手”。在兔病毒性出血症的临床诊断方面，当前国内外普遍采用人的“0”型红细胞进行的红细胞凝集试验(HA)和血凝抑制试验(HI)。这些检测方法虽然简单、实用。但是也存在一些实际问题，如(1)人的“0”型红细胞来源及采集都不方便，且不能长期保存，限制了该方法的临床应用；( 结果的判定容易受主观性因素影响，极易产生偏差。例如，意大利和德国学者通过对HA和ELISA进行比较，发现HA可产生8%的假阳性或假阴性，敏感性较差；⑶最近的研究发现，有些RHDV分离株并不产生血凝现象，因此不能使用HI或HA方法进行检测；(4) HA和HI法使用传染性极高的RHDV，这给操作者和周围环境带来潜在的生物安全风险。由此可见，研发出一种敏感、特异、安全、使用方便、适合于基层使用的诊断检测的器具，对家兔免疫水平进行实时监控和建立科学、灵活的家兔RHDV的免疫程序，以及对疫病的预防和控制有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种抗原蛋白，该抗原蛋白能够和兔出血症病毒抗体特异性接合， 具有很高的特异性和敏感性，且为非全病毒抗原，安全性好。一种抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明还提供了一种上述抗原蛋白的制备方法，包括利用RT-PCR扩增位于兔出血症病毒VP60基因上的目的区域(7讨_1四9)，将扩增产物酶切后与表达载体重组，转入宿主菌并进行基因表达，分离纯化表达的产物。RT-PCR包括逆转录PCR和实时PCR两个过程，其中逆转录PCR所采用RNA模板可以从患病毒性兔出血症的死兔肝组织中提取，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR所采用引物分别可以为5，端引物5，-GGGCCATGGGCAATGACAACAGGTGGA-3，3，端引物5，-TTTCTCGAGTTAGGCGCTGGCGTTTGGA-3‘5’端引物引物引入Nco I酶切位点，3’端引物引入B10 I酶切位点(参见加粗斜体碱基)。对扩增产物进行测序，可以得到目的基因的碱基序列。
扩增产物酶切后与载体重组，重组载体转入宿主菌，转化子经ITPG诱导表达，产物在宿主菌内堆积形成包涵体，破碎后离心可得到抗原蛋白，经QIAGEN公司的蛋白纯化系统纯化可以较快得到纯品。本发明提供了一种编码上述抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示， 该基因可以通过上述方法得到。本发明提供了上述抗原蛋白在检测兔出血症病毒抗体中的应用。本发明提供了一种含上述抗原蛋白的检测兔出血症病毒抗体的试剂盒，尤其是 ELISA试剂盒。ELISA试剂盒一般包括抗体检测板、阳性对照、阴性对照、酶标二抗贮存液、底物贮存液、洗涤液以及终止液。抗体检测板包被了上述抗原蛋白，包被量优选为0. 1 1 μ g/孔。酶标二抗为辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG结合物，最佳工作浓度为0. 1-0. 25μ g/ml，所述的底物贮存液为四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜(DMSO)溶液，最佳工作浓度为0. 16mg/ml。本发明抗原蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与血清中兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体特异结合，不与家兔其它疫病阳性血清发生交叉反应，灵敏度和特异性较高。本发明抗原蛋白通过基因工程手段克隆表达得到，在表达过程中抗原蛋白以包涵体形式在宿主菌种堆积，易分离纯化，可以进行工业化生产。本发明试剂盒操作简便快速，检测时样品无需预处理，样品需求量少，无需另配其它试剂，在2小时内即可完成检测。结果判定形象、准确、灵活，既可定性，亦可定量。
图1为本发明目的基因凝胶电泳分离图谱；图2为目标蛋白SDS-PAGE分析图谱(M.为蛋白质Marker，1为重组大肠杆菌诱导前菌体蛋白，2为重组大肠杆菌诱导4h表达产物)；图3为表达产物VP60-H蛋白的^festern blot鉴定图谱；图4为HI和ELISA法各自检验结果；图5为HI和ELISA法Kappa检测结果。
具体实施例方式获得目的蛋白取感染兔出血症病毒RHDV JX97 (全基因组序列GENBANK登录号DQ205345)的死兔肝组织，用UNIQ-10柱式TRIzoI总RNA提取试剂盒(上海生工)提取病毒RNA，具体操作参照说明书进行。以提取的病毒总RNA为模板进行逆转录，逆转录体系20 μ L如下病毒RNA IOyL ；5 XM-MLV Buffer 4 μ L，dNTP (1 Ommo 1/L) 1 μ L ； RNaseinhibitior (20U/L) 0. 5 μ L ；M-MLV 1 μ L VP60 基因下游引物(5，-GCAAGTCCCAATCCGA TGAAT-3，) 1 μ L, ；DEPC 补足体积至 20 μ L。反应条件如下70°C水浴lOmin，移入42°C恒温水浴箱中保温lh，然后在冰中冷却2min，即获得VP60cDNA 第一链。以VP60cDNA为模板进行PCR扩增，所用引物如下5，端引物5，-GGGCCATGGGCAATGACAACAGGTGGA-3，3，端引物5，-TTTCTCGAGTTAGGCGCTGGCGTTTGGA-3‘5’端引物引物引入Nco I酶切位点，3’端引物引入B10 I酶切位点(参见加粗斜
体碱基)。PCR反应体系为IOXLA PCR Buffer 5 μ L ;dNTP (2. 5mmol/L) 6 μ L ;5，端引物 2yL;3，端引物 2 μ L ；VP60cDNA 1 μ L ;LA Taq 0. 5 μ L ；去离子水 33. 5 μ L。PCR反应条件为94°C预变性 5min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C 2min，30 个循环；72°C延伸 lOmin。 反应结束后，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示。用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆方法直接将PCR产物连接于 MD18-T载体上，连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，分别进行酶切鉴定和DNA序列测定，目的基因碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。阳性质粒和pET30a载体分别经Nco I.Xho I双酶切后，回收目的片段及线性化载体片断，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET/H，转化DH5 α感受态细胞，提取重组质粒进行双酶切鉴定和序列鉴定。经鉴定的重组质粒转入宿主菌Ecoli BL21 (DE3),挑取单克隆接种到含有50 μ g/ ml卡钠霉素LB培养基中，37°C培养过夜，按1 100的比例将培养物接种于LB培养基中， 250rpm震荡培养2小时左右，使OD600 = 0 . 6，按1 100的比例加入IOOmMIPTG诱导培养 3小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的IX上样缓冲液，采用12%的SDS-PAGE鉴定，产物VP60-H蛋白表达量可占菌体总蛋白30-40% (见图2)。经大肠杆菌菌株(Ecoli)BL21 (DE3)表达的VP60-H蛋白以包涵体的形式存在，菌体经超声波破碎后，离心可以得到VP60-H蛋白包涵体，沉淀用进一步用Ni-NTA蛋白纯化系统 (QIAGEN公司)可以较快的得到VP60-H蛋白纯品，经测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所
7J\ ο抗原蛋白特异性试验样品经10%胶浓度SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂乳4°C封闭过夜，PBST漂洗易次，浸入1 100稀释的RHDV阳性兔血清中，37°C作用lh，PBST洗三次， 再将膜浸入1 5000稀释的HRP标记的羊抗兔酶标二抗，37°C作用lh，PBST洗三次，最后用DAB显色，膜上可见一 20kDa棕色条带(见图3)。制备抗体检测板用pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液作包被液，将复性的VP60-H蛋白稀释为5 μ g/ml， 按100 μ 1/孔加入可拆96孔酶标板，4°C包被过夜，用含5%脱脂乳的PH7. 4的0. OlM磷酸盐缓冲液(PBS)37°C封闭2小时，再以含0. 05%吐温-20的0.0IM磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次甩干，真空干燥后，装入含干燥剂的包装袋中置4°C保存。制备100 X浓缩酶标二抗贮存液以辛酸-硫酸铵沉淀法粗提羊抗兔IgG，再经kphadex G200凝胶层析和DEAE纤
5维素离子交换层析进一步纯化，用KPL公司SureLINKTM HRP交联试剂盒标记纯化的羊抗兔 IgG,利用方阵试验确定最佳工作浓度，再以含0. 2% BSA, 0. 1 %吐温-20，0. 02%硫柳汞钠， PH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释至200倍工作浓度，加等量甘油混勻，-20°C保存，用于兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体检测试剂盒100X浓缩酶标二抗贮存液。配制样品稀释液、洗涤液、终止液样品稀释液含0. 05 %吐温-20的0. OlM磷酸盐缓冲液(KH2PO4O. 2g， Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, NaCl 8g，定容至 1000ml, ρΗ7· 4，再加 0. 5ml 吐温-20)；洗涤液10X浓缩洗涤液为含0. 5%吐温-20的0. IM磷酸盐缓冲液(KH2P042g， Na2HPO4 · 12H20 29g, NaCl 80g，定容至 1000ml, ρΗ7· 4，再加 5ml 吐温-20)；终止液2M硫酸溶液，即量取111. 2ml浓硫酸稀释定容至1000ml。制备阳性对照和阴性对照将经RHDV组织灭活疫苗免疫新西兰兔获得的高免阳性血清用含0. BSA、 0. 01%硫柳汞钠和0. 05%吐温-20的0. OlM磷酸盐缓冲液(pH7. 4)稀释100倍后分装即为阳性对照(OD45tlnm ^ 0. 8)；同样将经筛选获得的非RHDV免疫兔血清用含0. 1 % BSA、0. 01% 硫柳汞钠和0. 05%吐温-20的0. OlM磷酸盐缓冲液(pH7. 4)稀释100倍后分装即为阴性对照(OD45tlnm 彡 0. 2)。配置100X浓缩底物贮存液和底物缓冲液称取Ig四甲基联苯胺(TMB)，用100ml DMSO溶解后避光保存，即得到100 X浓缩底物贮存液。0. 2M Na2PO4液257ml，0. IM柠檬酸液M;3ml，0. 5g氧化氢尿素，加蒸馏水定容至1000ml，即得到底物缓冲液。ELISA试剂盒的使用方法1)将IOX浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍即为洗涤液；2)将待检血清用样品稀释液作1 100稀释，按100 μ 1/孔加入抗体检测板中，同时设空白(只加100 μ 1样品稀释液)、阴性对照和阳性对照每孔各100 μ 1，37°C孵育45分钟，甩干；3)每孔加洗涤液200μ 1，洗涤3次，每次间隔1分钟，拍干；4)用洗涤液将100Χ浓缩酶标二抗贮存液稀释100倍至工作浓度，每孔加 100 μ 1，37 °C孵育45分钟，甩干；5)每孔加洗涤液200μ 1，洗涤3次，每次间隔1分钟，拍干；6)用底物缓冲液将100Χ浓缩底物贮存液稀释100倍至工作浓度，每孔加 100 μ 1，37 °C避光孵育10分钟；7)加50 μ 1终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD45tlnm值)。结果判定标准以待检样本OD45tl值与标准阴性OD45tl值比值(P/N)作为判定标准。在阳性对照孔 OD450大于0. 8，阴性对照孔OD45tl小于0. 2的前提下，样品孔OD45tl/阴性对照孔OD45tl彡2. 1 判定为阳性，反之为阴性。如果阳性对照孔OD45tl小于0. 8，或阴性对照孔OD450大于0. 2，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。为了检验本发明试剂盒在田间实际应用中的效果，我们分别对浙江省6个实验兔场(余姚、瓶窑、上虞、金华、省农科院、兰溪)实验兔的免疫情况进行了调查，6个场共采样1168份(有效样)，采样方式主要是兔耳动脉血2ml，均分为抗凝和不抗凝两种，其中抗凝血用于RT-PCR法活体检测RHDV病毒，不抗凝血用于HI法和ELISA法检测样品RHDV疫苗免疫抗体效价。各场的数量分别是兰溪70份，上虞316份，瓶窑415份，余姚221份，金华64 份，农科院82份。HI、ELISA法检测结果如图4和图5所示。 通过对两种方法的比较中，我们可以看出ELISA法检测结果的合格率明显高于HI 法。以ELISA检测法为金标准的U检验中，Kappa值(P < 0. 01)在年度的比较中分别为 0. 77,0. 783,0. 828,0. 696，在场间的比较中分别是金华0. 775、兰溪0. 959、农科院0. 864、 瓶窑0. 838、上虞0. 829和余姚0. 71。年度间检测结果的一致性较好，场内年度间检测结果的一致性较高，说明该方法较为可靠。HI虽然价格低廉，但操作复杂，结果的判定与观察者的经验有很大关系，而ELISA与其相比有明显的优势，操作过程简单化，结果可以用用仪器精确测定，准确性高，适用于实验室大规模的病毒检测。酶联免疫吸附试验(ELISA)在某种程度上可取代血凝试验(HA)，国外研究表明ELISA比HI的假阳性率要低。该法通常以抗 RHDV的多克隆血清或针对RHDV衣壳蛋白上不同表位的单克隆抗体包被ELISA板进行检测， 并可用于病毒抗原特性的研究。
权利要求
1.一种抗原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.权利要求1所述的抗原蛋白的制备方法，包括利用RT-PCR扩增位于兔出血症病毒VP60基因上的目的区域，将扩增产物酶切后与表达载体重组，转入宿主菌并进行基因表达，分离纯化表达的产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述RT-PCR中逆转录PCR采用的引物碱基序列如SEQ ID NO. 5所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述RT-PCR中实时PCR采用的上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌(Ecoli.) BL21 (DE3)，基因表达所用诱导物为IPTG。
6.一种编码权利要求1所述抗原蛋白的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
7.权利要求1所述的抗原蛋白在检测兔出血症病毒抗体中的应用。
8.一种包含权利要求1所述的抗原蛋白的检测兔出血症病毒抗体的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于包括包被所述抗原蛋白的抗体检测板、 阴性对照、阳性对照、酶标二抗贮存液、底物贮存液和终止液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述抗原蛋白包被量为0.1 1 μ g/孔。
全文摘要
本发明公开了一种抗原蛋白及其编码基因与应用，该抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明抗原蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与血清中兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体特异结合，不与家兔其它疫病阳性血清发生交叉反应，灵敏度和特异性较高。本发明抗原蛋白通过基因工程手段克隆表达得到，在表达过程中抗原蛋白以包涵体形式在宿主菌种堆积，易分离纯化，可以进行工业化生产。
文档编号C07K14/08GK102174088SQ20111002090
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者云涛, 余斌, 倪征, 刘光清, 华炯钢, 李双茂, 梁华丽, 陈柳 申请人:浙江省农业科学院