专利名称：筛选抑制tm4sf5功能的抗癌化合物和含有查耳酮化合物的抗癌组合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗癌化合物的方法，具体涉及一种筛选已知TM4SF5介导的肿瘤形成、发展和转移的化合物的方法。而且，本发明涉及使用该方法筛选的作为抗癌物质的查耳酮(苯丙烯酰苯)化合物，和包括查耳酮化合物作为有效成分的抗癌组合物。
背景技术：
跨膜4L6家族成员5 (TM4SF5或者L6H)是与作为跨膜4L6超家族的一个成员的肿瘤相关抗原L6(TM4SF1)同源的蛋白质。跨膜4L6超家族进一步包括IL-TMP和 L6D。L6抗原(TM4SF1)在结肠、肺部、乳房和卵巢癌中高表达。与L6抗原(TM4SF1)同源的TM4SF5蛋白质(L6H)也在一些类型的癌症中高表达，这些癌症包括胰腺癌、胃癌，结肠癌和肝癌(MulIer-Pillasch, F.等人，Gene, 208 :25,1998 ；Pascual-Le Tallec, L.等人，J.Clin· Endocrinol. Metab. ,87 :501,2002)。与 L6 抗原(TM4SF1)相比，TM4SF5mRNA 在胃癌组织中以更低水平表达，但在肝癌和胃癌细胞系中过表达(Kaneko，R.等人， Am. J. Gastroenterol.，96(12) :3457,2001)。基于研究结果，TM4SF5近来已经被登记为新的癌基因，如在美国专利US6，350，581 Bl中公开的那样，其中TM4SF5被命名为人肿瘤相关抗原(TUAN)。通过在C0S7细胞中表达 TM4SF5，本发明的发明人近来发现，在Tyr925处的TM4SF5介导的肌动蛋白重组、粘着斑形成和粘着斑激酶(FAK)磷酸化作用经整合蛋白- α 2亚单位被诱导，并通过用含有细胞生长因子的血清处理而被调节(抑制)(Lee, S. Y.等人，Exp. Cell Res.，312 :2983,2006)。但是，TM4SF5介导的肿瘤生成的分子机理缺乏理解。TM4SF5在分子水平的功能是未知的，并且用于TM4SF5的致癌作用的证据在生物化学和细胞生物学水平上没有被发现。另一方面，查耳酮广泛分布在食用植物中并已知为类黄酮或者异类黄酮 (isoflavonoid)的前体。所述查耳酮的衍生物构成植物的黄色颜料，影响植物的颜色并保护植物不受有害紫外线照射(Methodology of Natural Product Chemistry, W. S. Woo, Seoul National University Press)。查耳酮衍生物在作为紫菀科的一种的金鸡菊植物中含量丰富。有代表性的查耳酮包括2' ,6' - 二羟基-4'-甲氧基查耳酮和红花素，存在于植物中，包括肉桂、红花和胡椒。二羟基查耳酮主要包含在Rosaceae和Ericaceae科的一些植物物种内。根皮苷为在苹果皮中最初发现的二羟基查耳酮，并负责苹果树抗病性。已经知道所述查耳酮衍生物具有各种药物活性，诸如抗原生动物活性(Liu，Μ.等人，J.Med. Chem. ,44 :4443,2001)抗炎症活性(Babu，Μ. Α.等人，Bioorg. Med. Chem. , 10 4035,2003)、免疫调制(Barfod, L.等人，Int. Immunopharmaco 1.，2 :545，2002)、一氧化氮产生的抑制(Rojas, J.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.，12 1951，2002)、抗癌活性(Kumar,S. K.等人，J. Med. Chem. ,46 :2813,2003)以及 anti-HIV 活性(Artico, M.等人，J.Med. Chem. ,41 :3984,1998)。另外，韩国专利公开号10-2003-0036993公开了查耳酮化合物具有对降解基底膜成分的基质金属蛋白酶(MMP)的抑制活性，(Park,K. H.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.，15 5514,2004)。在这些查耳酮化合物中，磺胺基或磺基取代的查耳酮衍生物已经被报道具有在天然产生的查耳酮中没有显示的特定生物学特性。特别是，本发明的发明人发现，磺胺查耳酮衍生物对α -葡萄糖苷酶具有强烈的抑制活性(Park，K. H.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.， 15 :5514,2004 ；Korean Patent Publication 10-0751899)。本发明的发明人近来还报道磺基查耳酮衍生物作为选择性K (+)通道阻断剂(Park, K. H.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.， 2007)。但是，没有报道陈述磺胺或者磺基查耳酮衍生物通过抑制癌基因TM4SF5蛋白质的机制而具有抗癌活性。在这一点上，本发明的发明人进行了深入全面的研究，从而发现在人类癌细胞中显示的TM4SF5的癌基因潜能是由于其刺激上皮-间叶细胞转移(EMT)的能力，导致接触抑制丧失。而且，本发明的发明人发现，TM4SF5的癌基因功能经过新途径被介导，该途径包括一系列步骤，包括粘着斑激酶(FAK)磷酸化作用和细胞液p27kipl聚集，导致MioA活性抑制并改变细胞形态。基于这以发现，本发明的发明人付出了许多努力来筛选抑制TM4SF5介导的肿瘤形成、发展和转移的抗癌物质，从而完成本发明。
发明内容
因此本发明的一个目的在于提供筛选抑制TM4SF5介导的肿瘤形成、发展和转移的抗癌化合物的方法。本发明的另一目的在于提供使用上述方法筛选的抗肿瘤化合物，优选为磺胺或者磺基查耳酮化合物，以及包括抗肿瘤化合物作为有效成分的抗癌组合物。为了实现上述目的，本发明提供了筛选抗癌化合物的方法，所述方法包括(a)培养表达序列号2的多肽的癌细胞，并使用抗癌候选物处理癌细胞；(b)在用抗癌候选物处理的癌细胞中检测下列中至少一种(i)在编码粘着斑激酶(FAK)的氨基酸序列的第577位色氨酸(Tyr577)的磷酸化作用，(ii)将FAK结合到 Rho-GTPase活化蛋白质(IihoGAP)或者将FAK结合到与FAK有关的GIPase调节子(GRAF)， (iii)细胞液p27Kipl的表达水平和稳定性，(ivWhoA活性，和(v) Racl活性；和(c)当下列事件发生时，与当没有用抗癌候选物进行处理时相比较，确定抗癌候选物是否能够作为抗癌物质(i)降低Tyr577上FAK的磷酸化作用，(ii)抑制FAK结合到 RhoGAP或者FAK结合到GRAF，(iii)减少细胞液p27Kipl的表达和稳定性，(iv)增强IihoA活性，或者(ν)降低Racl活性。在本发明的方法中，步骤(b)进一步包括检测选择下组中至少一种包括细胞形态，在细胞粘着形成中涉及的蛋白质的表达，细胞-细胞接触模式或者接触生长，α-平滑肌肌动蛋白(a-SM)或者波形蛋白的表达，E-钙粘蛋白的表达和上皮-间叶细胞转移 (EMT)；并且步骤(c)进一步包括下列事件细胞形态从杆状变化成多边形，降低了在细胞
7粘着形成中涉及的蛋白质的表达，细胞-细胞接触的保持，细胞生长的接触抑制，降低了 α-SMA或者波形蛋白的表达，增加了 E-钙粘蛋白的表达和或者降低了上皮-间叶细胞转移 (EMT)。另外，步骤(b)进一步包括检测选自下组的至少一种，包括在细胞外基质或者血清的存在下细胞转移或者运动，侵入到包括细胞外基质的胶原凝胶中，侵入到作为细胞外基质复合物的Matrigel中，和基质金属蛋白酶(MMP)活性；并且步骤(c)进一步包括下列事件在细胞外基质或者血清的存在下降低细胞转移或者运动，降低侵入到胶原凝胶中，降低侵入到Matrigel中，或者MMP活性的降低。本发明还提供了使用上述方法筛选并由下列化学式1或2表示的抗癌查耳酮化合物，以及包括查耳酮化合物作为有效成分的抗癌组合物，以及用于治疗并预防癌症的查耳酮化合物的用途。化学式1
权利要求
1. 一种由下列化学式1或2表示的抗癌查耳酮化合物，其特征在于，化学式1O戶2Ri-S-N H其中，R2和R3为独立的氢或者羟基；R4为(C1-C5)烷基或者具有选自下组的一个或多个取代基的(C6-C10)芳基，该组包括氢、卤素、氮和(C1-C5)烷基，O其中，R2和R3为独立的氢或者羟基；R4为(C1-C5)烷基或者具有选自下组的一个或多个取代基的(C6-C10)芳基，该组包括氢、卤素、氮和(C1-C5)烷基。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤查耳酮化合物，其特征在于，查耳酮化合物为选自下组的至少一种，该组包括4' -(ρ-甲苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 4' -(P-甲苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮； 4' -(P-甲苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮； 3' -(ρ-甲苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 2' -(ρ-甲苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 4' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 4' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮； 4' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮； 3' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 3' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮； 3' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮； 2' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 2' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮； 2' -(ρ-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮； 4' -(m-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 4' - (m-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮； 4' - (m-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮； 3' -(m-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮； 3' -(m-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮； 3' -(m-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮； 2' -(m-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；化学式22'-(m-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮；2'-(m-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮；4'-(ρ-氟苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(ο-氟苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(ρ-硝基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(ο-硝基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(ρ-氨基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(ο-氨基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'_(苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'_(甲磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酸)-4-羟基查耳酮；4'-(ρ-氟苯基磺酸)-4-羟基查耳酮；4'- (m-氟苯基磺酸)-4-羟基查耳酮；4'- (ρ-硝基苯磺酸)-4-羟基查耳酮；4'-(ρ-氨基苯磺酸)-4-羟基查耳酮；4'_(苯磺酸)-4-羟基查耳酮；4'_(甲磺酸)-4-羟基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_3，4-二羟基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_2，3-二羟基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_2，4-二羟基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_2，5-二羟基查耳酮；3'-(P-甲苯磺酰胺)_3，4-二羟基查耳酮；2'-(P-甲苯磺酰胺)_3，4-二羟基查耳酮；4'-(ρ-羟基苯磺酰胺4'-(ρ-羟基苯磺酰胺4'-(ρ-羟基苯磺酰胺4'-(ρ-羟基苯磺酰胺3'-(ρ-羟基苯磺酰胺3'-(ρ-羟基苯磺酰胺3'-(ρ-羟基苯磺酰胺3'-(ρ-羟基苯磺酰胺2'-(ρ-羟基苯磺酰胺2'-(ρ-羟基苯磺酰胺2'-(ρ-羟基苯磺酰胺2'-(ρ-羟基苯磺酰胺4'_(m-羟基苯磺酰胺-3，4-二羟基查耳酮 -2，3-二羟基查耳酮 -2，4-二羟基查耳酮 -2，5-二羟基查耳酮 -3，4-二羟基查耳酮 -2，3-二羟基查耳酮 -2，4-二羟基查耳酮 -2，5-二羟基查耳酮 -3，4-二羟基查耳酮 -2，3-二羟基查耳酮 -2，4-二羟基查耳酮 -2，5-二羟基查耳酮 -3，4-二羟基查耳酮4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,3-二羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,4-二羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,5-二羟基查耳酮；3'-(m-羟基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；3'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,3-二羟基查耳酮；3'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,4-二羟基查耳酮；3'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,5-二羟基查耳酮；2'-(m-羟基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；2'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,3-二羟基查耳酮；2'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,4-二羟基查耳酮；2'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,5-二羟基查耳酮；4'_(p-氟苯磺酰胺)-3，4-二.羟基查耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-3，4-二.羟基查耳酮；4'-(0_氟苯磺酰胺)-3，4-二.羟基查耳酮；4'_(p-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'-(o-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'_(p-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'-(ο-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'-(苯磺酰胺)_3，4-双羟基查耳酮；4'-(甲磺酰胺)_3，4_:二羟基查耳酮；4'_(p-甲苯基苯磺酰胺)-2-氯-4-羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-4-羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-3-羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2-羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-2,3-二羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-2,4-二羟基查耳酮；4'_(p-羟基苯磺酰胺)-2,5-二羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-3,4-二羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,3-二羟基查耳酮；4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,4-二羟基查耳酮；和4'-(m-羟基苯磺酰胺)-2,5-二羟基查耳酮。
3. 一种抗癌组合物，其特征在于，包括根据权利要求1或2所述的查耳酮化合物作为有效成分。
4.根据权利要求1或2所述的查耳酮化合物在治疗和预防癌症中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种筛选抗癌化合物的方法和使用该方法筛选的抗癌化合物，具体涉及一种筛选抗癌化合物的方法，所述方法包括培养表达癌基因蛋白跨膜4L6家族成员5(TM4SF5)的癌细胞，其表达为序列号2的多肽，使用抗癌候选物处理癌细胞，并且当候选物显示对肿瘤形成和转移的拮抗活性时基于通过TM4SF5的分子机理的一些事件确定抗癌候选物。本发明还涉及使用该方法筛选的具有抗癌活性的查耳酮化合物，以及包括该化合物作为有效成分的抗癌组合物。
文档编号C07C311/44GK102199113SQ201110081180
公开日2011年9月28日 申请日期2007年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者朴基宪, 李申爱, 李重元, 柳永裴, 柳炯元 申请人:庆尚大学校产学协力团, 首尔大学校产学协力财团