专利名称：甘蓝型油菜核不育恢复基因BnaC.Tic40及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于油菜育种技术领域。具体涉及一个油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40 (BnMs3)的分离克隆、功能验证和应用。本发明涉及的显性基因BnaC. Tic40是隐性核基因BnaA. Tic40-1 (Bnms3)的功能获得性变异的同源基因。恢复基因BnaC. Tic40的克隆、验证和应用可以加快油菜等作物隐性细胞核雄性不育系和临保系的选育，从而在繁殖制种时获得100%不育的群体。
背景技术：
植物在有性繁殖的过程中不能产生正常花粉的遗传现象称为雄性不育，它涉及到花器中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等很多环节。雄性不育可以分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不育为人类所知已有100多年的历史，并且在水稻、玉米、油菜等作物中广泛的用于生产杂交 种。目前，世界上可以用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogiukos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统(傅廷栋，杂交油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000)，但是波里马不育系育性受到温度的影响表现不稳定，制种风险较大，其应用受到了一定的限制。细胞核雄性不育系由于育性表现稳定，易于回交转育获得新的不育系，并且一般不受恢保关系的限制，近年来受到育种家的广泛关注。目前国内外利用的油菜核不育系主要有以下四种类型显性核不育、两对隐性基因控制的核不育、互作型核不育和转基因核不育。四川省宜宾地区农科所(1972)发现的宜3A是显性核不育系的典型代表，目前还没有选育出大面积推广的双低杂交组合。美国和加拿大利用烟草的TA29基因的启动子和核糖核酸水解酶(barnase)基因构建成融合基因转化甘蓝型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械化作业。但是该系统的不足之处是必须对不育系和恢复系都进行转基因，该系统目前也受到专利的保护。S45A(潘涛等，1988)和117A(侯国佐等，1990)是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有“蜀杂6号” “蜀杂7号”、“油研7号”、“油研8号”和“油研9号”等。这类系统主要缺点是不育系中存在50%的可育株，在制种时需要在初花期拔掉50%的可育株，由此不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。9012A (陈凤祥等，1998)和7365A(Huang et al.，2007)均属于隐性上位互作型核不育系，以其为材料选育的品种中，已审定的杂交种有“皖油14号”、“皖油18号”(陈凤祥等,2002 ；2003)和“沪油杂I号”(孙超才等，2004)等组合，该系统通过引入临保系犾得100%的全不育系，在油菜核不育系统研究领域取得了重大进展。但是这个系统遗传基础复杂、临保系选育困难，不利于选育强优势组合。克服隐性上位互作型核不育这个缺点的可行性策略是建立不育恢复基因和上位基因的分子标记体系，克隆恢复基因和上位基因，利用分子标记实现不育系的临保系的定向选择。而且，开展核不育恢复基因的克隆和功能研究，对促进核不育杂种优势利用，具有重大的理论意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的在于克隆一个甘蓝型油菜核不育恢复新基因BnaC. Tic40，利用该基因恢复甘蓝型油菜隐性核不育系7365A、9012A的育性，或作为新的核不育系和临保系选育的分子标记，以加快甘蓝型油菜核不育系和临保系的选育。申请人:通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到一种甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。分离得到一种甘蓝型油菜隐性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所不；该基因编码的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO 4所不。
可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，米用PCR(polymerase chain reaction)技术,也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。本发明为甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良提供了新用途，其中包括作为恢复甘蓝型油菜核不育系的育性；或作为新核不育系与临保系选育的分子标记。在本发明的实施例部分，申请人阐述了隐性基因BnaA. Tic40_l和显性基因BnaC.Tic40的分离、功能验证和应用过程以及这两个基因的特点。
序列表SEQ ID NO :1.本发明分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40的核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的可育株7365B。序列表SEQ ID NO :2.本发明分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的可育株7365B。序列表SEQ ID NO :3.本发明分离的甘蓝型油菜隐性核不育基因BnaA. Tic40_l的序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的不育株7365A。序列表SEQ ID NO :4.本发明分离的甘蓝型油菜隐性核不育基因BnaA. Tic40_l编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的不育株7365A。图I.本发明鉴定、分离、克隆并验证甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40和它的基因功能的流程图。图2.覆盖甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40区段的物理图谱。图中空心线表示BnaC. Tic40基因精细定位的遗传图谱；分子标记下面的数字表示在近等基因系群体中检测到的BnaC. Tic40位点与分子标记之间发生重组交换的单株数；连接分子标记和BAC克隆的竖虚线表示通过序列比较分析证实了相对应的分子标记和BAC克隆具有同源性；实线表示细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆和拟南芥染色体；线上的椭圆代表相应区域拟南芥基因组图谱上注释的基因；线上的黑点代表根据BAC序列预测的甘蓝型油菜基因。图3.候选基因启动子分析载体的结构。RB和LB =T-DNA的右侧和左侧边界；NOS-pro :N0S启动子APTII(Kanlr):新霉素磷酸转移酶II基因；N0S_ter :N0S终止子；(；US 葡萄糖醛酸糖苷酶基因。图4.拟南芥TO代遗传转化植株花蕾⑶S染色结果。只有恢复基因BnaC. Tic40的启动子分析载体PBIP4-GUS转化后的TO代遗传转化植株花蕾可看到明显的GUS着色信号。图5.甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pC2300_BnaC. Tic40的构建图。图6.具有7365A遗传背景的TO代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与7365A和7365B表型的比较。7365A遗传转化TO代植株携带显性基因BnaC. Tic40的候选基因，表现为花丝伸长，育性恢复，花粉KI染色正常。图7.甘蓝型油菜隐性核不育系7365A半薄切片显微解剖结构。b、d、e、g、i、k和 m分别是正常花药花粉母细胞时期、减数分裂前期与减数分裂后期、四分体时期、单核早期、单核靠边期和成熟期半薄切片显微照片，a、C、e、h、j、I和n分别是不育花药对应时期的半薄切片显微照片。MC:小孢子母细胞。T :绒毡层。TCW:绒毡层细胞壁。MMC:花粉母细胞。PCW:胼胝质壁。TE:四分体。M :小孢子。PW:花粉外壁。图8.甘蓝型油菜隐性核不育系7365A超薄切片显微解剖结构。a、c分别是正常花药减数分裂后期和四分体时期绒毡层细胞结构；b、d分别是不育花药对应时期的绒毡层细胞结构。T :绒毡层细胞。N :细胞核。P:质体。TCW:绒毡层细胞壁。ER:内质网。图9 :甘蓝型油菜隐性核不育系7365A胼胝质观察。D、E、F分别是正常花药花粉母细胞时期、四分体时期和单核期用苯胺蓝染色后观察胼胝质荧光的显微照片。A、B、C分别是不育花药对应时期的胼胝质荧光的显微照片。图10 :甘蓝型油菜隐性核不育系7365A胼胝质脂类物质合成。A、C、E和G分别是正常花药减数分裂时期、四分体时期、单核早期和单核靠边期用苏丹黑B染色后的显微照片，颜色越深说明脂类物质含量越高。B、D、F和H是不育花药对应时期苏丹黑B染色后的显微照片.
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验室指南》(New York Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。实施例I :构建含甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40区段的物理图谱并精细定位不育恢复基因BnaC. Tic40aI.实验材料本实验所用的材料为甘蓝型油菜隐性核不育两型系7365AB (Huang et al. ,TheorAppl Genet. ,2007,115 :113-118)，其中不育株称为 7365A，可育株称为 7365B。材料 7365AB经过多代的兄妹交(25代以上)保存。另一个甘蓝型油菜隐性核不育两型系750AB(Huanget al. ,Mol Breeding, 2010, DOI10. 1007/sl 1032-010-9536—8)材料来源将 7365A 的核不育基因导入到新型甘蓝型油菜750中，后代自交，选择不育系作供体亲本，并用750作为轮回亲本，通过多代回交然后兄妹交后得到的近等基因系750AB。
隐性核不育基因的定位群体7365AB和750AB是由其对应的不育株和可育株兄妹交后构建的近等基因系群体(Huang et al. , Theor Appl Genet. , 2007,115 :113-118 ；Huang et al. ,Mol Breeding, 2010,D0I10. 1007/sll032-010-9536_8)，2007 年秋播种于武汉，2008年春天提取2135个来源于7365AB近等基因系和5022个来源750AB近等基因系的不育单株的DNA (提取DNA的方法参见Stewart and Via，1993，14 (5) :748-749)，用于基因的精细定位。2.精细定位不育恢复基因BnaC. Tic40根据初步定位的结果该基因位于油菜N19连锁群的SCAR (Sequencecharacterized amplified region)标记 AR23 和 AR48 之 间(He et al. , Theor ApplGenet.，2008，117 :11-18)。即 BnaC. Tic40 位点位于 AR23 和 AR48 之间。设计的引物的核苷酸序列如下所示AR23F 正向引物 ITGTTCGCAAATGGITITTC，AR23R 反向引物 TATGGCCATCTCCAGACTGA ；AR48F 正向引物 ITCAACTCTCTCCGGAACCTG，AR48R 反向引物 CGGTAGCGGTTGCTTCTGIT。为了进一步缩小目标基因区域的范围，基于内含子的多态性，申请人根据目标区域的序列设计了 57对特异引物(或称之为标分子记)，发现21个IP分子标记(或称引物)在亲本间表现多态性。分子标记IPl和IP5在7365AB近等基因系群体的2135个不育单株中分别检测到3个和5个交换单株，这些单株在标记和BnaC. Tic40位点间发生了重组(图2)。然后用其余的IP标记对交换单株进行分析，发现两侧最近的分子标记是引物IP8R、IP8FF和IP17R，IP17F两个标记分别有I个单株在标记与BnaC. Tic40间表现交换，并有10个IP标记与BnaC. Tic40基因表现为共分离。对与目标区段共线的拟南芥区域进行分析，发现该区域内有43个候选基因。为缩小候选基因范围，申请人用标记IP8和IP17扫描了来源于近等基因系750AB的5022个不育株群体，IP8和IP17分别检测到2个和I个交换单株，这些单株在标记和BnaC. Tic40位点间发生了重组，用在上一个群体中与BnaC. Tic40表现共分离的10个IP标记对交换单株进行分析，最近两侧标记IP21和IP18分别检测到一个单株在标记与BnaC. Tic40间表现交换。通过以上精细定位，将BnaC. Tic40基因定位于分子标记IP21和IP18之间，与IP11、IP16共分离。用于精细定位的引物多的核苷酸序列见表I所示。表I精细定位的引物多的核苷酸序列IP IFGT AGGGTATCTAAGGCACTAA AGGC
IP IRGGTTGATGGATAGATATGACCAGC
IP2FTAACCAATTTGAGAGATAGCC
IP2RCTCGCAGTCTAGGAGAATCG
IP3FCAAGCAATGCTACTTCGACC
IP3RCCAATACTCCGTATAAAATTTTGT
IP4FGAACTTGAATACATTCTTCATGIP4RGGAGAGACTTGTGGTGCTTC
IP5FTGTTGGATGGGAAGAGTACAG
IP5RTAGCAAACTGTCCCACAAGC
IP6FAGCAGAATCAGGTCAAACCT
IP6RCAGATCCTGCGCCTCACT
IP7FCCAAGATTTGCTGC AAAGAC
IP7RACGGCTTCACAGTAGTCATC
IP8FGCTGTCCACAGATATCACTATTAC
权利要求
1.一种分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 1 所示。
2.一种分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO :2 所示。
3.一种分离的甘蓝型油菜隐性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 3 所示。
4.一种分离的甘蓝型油菜隐性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
5.权利要求I至4任一项所述的基因在甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良中的应用。
全文摘要
本发明属于作物分子育种技术领域。具体涉及一种油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40的分离克隆、功能验证和应用。本发明分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，它编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。分离的甘蓝型油菜隐性雄性不育基因BnaA.Tic40-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。本发明还公开了所述的基因在甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良中的应用。利用分子标记技术定位和克隆恢复基因BnaC.Tic40，可以加快油菜等作物隐性细胞核雄性不育系和临保系的选育，从而在繁殖制种时获得100％不育的群体，突破核不育系在油菜等作物杂种优势利用中的瓶颈。
文档编号C07K14/415GK102747087SQ20111009655
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者傅廷栋, 文静, 易斌, 李兴华, 沈金雄, 涂金星, 顿小玲, 马超芝 申请人:华中农业大学