专利名称：一种可溶性突变baff蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可溶性突变BAFF蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。
背景技术：
B 细胞 舌化因子(B-cell activator factor belonging to the TNF family, BAFF)属肿瘤坏死因子(Tumor NecrosisFactor, TNF)家族成员，主要参与B细胞分化发育成熟的功能调节。BAFF 又称为 BLyS(B lymphocyte stimulator)、TALL-1 (TNF-and apoptosisligand-felated leukocyte expressed ligand 1)、 THANK(TNF homo logue that act ivatesapoptosis, NF-KB and JNK)、zTN F4 等，是 B 细胞存活与成熟和 T 细胞激活的必需因子。人BAFF基因编码285个氨基酸，其中47 73氨基酸为跨膜区，74 285氨基酸为胞外区，133 285氨基酸为其发挥功能的主要区域。BAFF属II型跨膜蛋白，N端在胞内， 缺少信号肽序列，C端在胞外，其胞外段与TNF超家族成员IPRIL有高度同源性。具有TNF 家族特征性结构，富含β 2片层的同源三聚体，在三聚体的中央含2个镁离子，能够稳定蛋白功能。BAFF主要表达在单核细胞、巨噬细胞，树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面。BAFF有膜结合蛋白和可溶性配体(hsBAFF)两种形式存在，上述BAFF表达免疫细胞活化后，释放hsBAFF，后者通过与B细胞表面的BAFF受体结合，使B细胞活化并分化为浆细胞， 分泌免疫球蛋白，产生相应的生理和病理性免疫应答，参与机体正常免疫调节和免疫病理。 另外，hsBAFF还通过活化CD4+T细胞和NK细胞，参与机体固有和获得性免疫应答的调节。 BAFF 有三禾中受体BCMA(B cell maturation antigen), TACI (transmembrane activator andcalcium modulator cyclophilin ligand intercator)禾口 BAFF 受体(BAFF receptor, BAFF-R)，主要表达在B细胞上，三种受体均属于TNF受体家族成员，三者均通过一个小的结构域结合BAFF，他们的表达受T、B细胞的控制。BAFF与其三种受体结合而发挥着不同的作用。TACI表达于B细胞及部分活化的T细胞，其表达水平可由丝裂原和抗⑶3单抗上调；而BCMA仅见表达于B细胞，但其表达强度要低于TACI，TACI和BCMA除了与BAFF结合外，还可与TNF家族成员APRIL结合，介导APRIL的部分功能。因为BAFF能与不表达TACI 和BCMA的细胞系BJAB结合，提示BAFF还可能有新的受体存在。2001年Thompson等克隆了 BAFF 的第三种受体BAFF-R。(Thompson JS, Bixler SA, Qian F, et al. BAFF-R, anewIy identified TNF receptor thatspecifically interacts with BAFF. Science 2001, 293(5537) :2108-2111.人 BAFF-R 定位于染色体 22ql3. 1-13. 31，其 mRNA 长约 4. 5Kb，在脾脏及淋巴结高表达，而在胸腺、外周血低表达。在骨髓中不能检测到BAFF-R mRNA。BAFF-R 是BAFF特异性的高亲和力受体，它仅与BAFF结合而不与TNF家族成员结合。BAFF与它的三种特异性细胞膜受体结合后，能促进B淋巴细胞增殖、分化发育、激活，刺激免疫球蛋白产生，并在自身免疫性疾病发病的过程中发挥重要作用。系统性红斑狼疮(Systematic Lupus Erythematosus, SLE)是以B细胞异常活化和大量自身抗体产生为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。BAFF作为最重要的B细胞活化因子，参与SLE的免疫病理过程。在两种SLE小鼠模型-MRL/Mp21pr/lpr和NZB/WF1小鼠， 发病时均存在血清BAFF水平增高，并与肾脏损害相关，阻断BAFF的作用可显著改善狼疮鼠的生存。BAFF转基因鼠出现严重B细胞增生、高滴度抗dsDNA自身抗体、蛋白尿和免疫复合物在肾脏沉积等狼疮样表现，也提示BAFF参与SLE发病。另外SLE患者的血清BAFF水平与IgG和抗dsDNA抗体滴度相关。综上所述，临床病例研究和动物实验均提示BAFF参与 SLE发生和发展的免疫病理进程。BAFF受体表达仅限于免疫球蛋白阳性的B细胞，BAFF和其受体特异性结合特性提示BAFF作为放射性同位素和化疗药物靶向蛋白载体，特异性的杀伤清除B细胞，用于B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的靶向治疗。研究显示，放射性同位素标记的重组人 BAFF可在实验动物体内与B细胞结合，并靶向富集于BAFF受体阳性的小鼠移植肿瘤。由于天然BAFF具有刺激B细胞增殖的作用，基于BAFF的放射性同位素和化疗药物靶向制剂在杀伤BAFF受体阳性细胞的同时也刺激其增殖，用于B细胞恶性增殖性疾病和异常活化性疾病的治疗存在安全隐患，因而只有受体结合活性而无B细胞活化作用的BAFF突变体及其靶向制剂的研究，对提高基于BAFF的放射性同位素和化疗药物靶向制剂的治疗作用，减少安全隐患具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种可溶性突变BAFF蛋白及其编码基因与应用。本发明的另一目的就是提供一种高效表达重组可溶性突变BAFF(S0luble mutated BAFF, smBAFF)蛋白的方法，以及用于该方法的表达载体及工程细胞的构建。发明概述本发明根据编码人BAFF天然氨基酸的核苷酸序列，进行人工突变，将位于251-277位的核苷酸序列gtccatgtctttggggatgaattgagt删除，插入核苷酸序列 ggtggttca,获得具有受体结合活性而缺乏B细胞活化作用的突变人BAFF的基因。同时，本发明还利用生物技术将上述突变基因导入质粒并转化宿主菌表达重组可溶性突变 BAFF(soluble mutated BAFF, smBAFF)蛋白。一种可溶性突变BAFF基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。由上述基因表达的可溶性突变BAFF蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。 上述可溶性突变BAFF基因全长438个碱基，与天然BAFF基因序列有76. 03 %以上同源性。它具有如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，全长145个氨基酸，与天然BAFF蛋白的氨基酸序列有98. 62%以上同源性。一种含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表达载体。含有上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或上述表达载体的重组细胞。所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。上述重组细胞构建的方法，通过将smBAFF编码序列与表达载体是pET41a连接，转入大肠杆菌，抗生素筛选获得高表达工程细胞。上述可溶性突变BAFF蛋白在制备化疗药物、放射性同位素药物及以B细胞为靶细胞的靶向治疗制剂中的应用。本发明的优点在于1、本发明所述突变的smBAFF保留结合BAFF受体能力而丧失活化受体的能力，因而不刺激B细胞增殖活化，作为B细胞靶向载体更为安全。2、本发明所述突变后的重组smBAFF蛋白基因非常适合在大肠杆菌BL21 (DE3)宿主细胞中表达，具有高表达、稳定的特点；3、选用的是大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，通过施加抗生素筛选出多拷贝转化细胞，进而筛选出高表达工程细胞。
图1. smBAFF蛋白诱导表达筛选电泳图；图中1、PET41a诱导前，2、PET41a 诱导后，3、PET4Ia-BAFF 诱导前，4-9、 PET4Ia-BAFF 诱导后，M 自下而上依次为10KD，17KD，26KD，34KD，43KD，55KD，72KD，95KD， 130KD,170KD(Fermentas SM 0671)；图2. smBAFF蛋白表达形式确定电泳图；图中l、PET41a诱导前全菌，2、PET41a诱导后全菌，3、PET41a_BAFF诱导后全菌， 4、PET4Ia-BAFF诱导前全菌，5、PET4Ia-BAFF诱导后细菌裂解上清，6、PET4Ia-BAFF诱导后细菌裂解包涵体，M 自下而上依次为19. 9KD，25KD，34KD，47KD，85KD，117KD (Fermentas SM 0441)；图3.免疫荧光检测smBAFF与BAFF-R(+) B细胞表面受体具有特异性结合能力的显微镜照片；其中a、Hmy2. CIR细胞在荧光显微镜下的照片；b、Hmy2. CIR细胞在普通显微镜下的照片；c、U937细胞在荧光显微镜下的照片；d、U937细胞在普通显微镜下的照片。图4. smBAFF与BAFF蛋白细胞学活性比较图。
具体实施例方式本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将人smBAFF编码序列转入大肠杆菌，从而实现了人smBAFF高效表达。在此基础上完成了本发明。本发明根据编码人BAFF天然氨基酸的核苷酸序列，进行人工突变，将天然BAFF基因中第 251-277 位的 gtccatgtctttggggatgaattgagt 序列删除，插入 ggtggttca 序列。获得具有受体结合活性而缺乏B细胞活化作用的可溶性突变smBAFF的基因序列；全基因合成 pUC57-smBAFF, PCR扩增sm BAFF，将该基因克隆到pMD中测序验证。优化后的sm BAFF编码序列与表达载体pET41a连接，转入大肠杆菌，通过实施抗生素筛选出表达工程细胞，再通过小量诱导表达筛选获得高表达工程细胞。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得
5
根据人天然BAFF氨基酸序列，进行人工突变，全基因合成smBAFF蛋白的目的基因序列，通过PCR扩增得到目的基因smBAFF，目的基因序列如SEQ ID NO. 1所示，将该目的基因克隆到PMD中并测序验证。用NdeI 和 Xhol 双酶切(Buffer o，37°C，购自 NEB 公司)pMD-smBAFF 及 pET41a 质粒(购自MBI公司)。将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌 DH5 α (购自北京全式金公司)，在含有卡那霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆。大量扩增确证的pET41a-SmBAFF质粒，获得含有smBAFF 的重组质粒pEI^la-smBAFF。表达质粒pET41a-SmBAFF经测序验证后，转化进入已制备好的大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞，涂布含50ug/mL卡那霉素的LB平板，然后在转化平板上调取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pET41a-SmBAFF的单克隆在含50ug/ mL卡那霉素的LB平板上保存。实施例kmBAFF的表达及表达形式的确定挑选一株确证好的表达工程菌BL21 (DE3) /pET41a-smBAFF,用LB培养基进行培养并用IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带出现，并分析表达量。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于pH7.4，20mM PBS和2. 5mM EDTA缓冲液，在冰浴下超声破碎，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析其超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大多数在沉淀中，表明目的蛋白是以包涵体形式表达。实施例3smBAFF蛋白的纯化取SDS-PAGE确证好的IPTG诱导的pEI^la-smBAFF表达工程菌BL21 (DE3)菌体超声沉淀，用8M尿素，IOOmM NaH2PO4 ·2Η20，IOmM Tris缓冲液(ΡΗ8. 0)重悬，加至用上述缓冲液活化好的Ni-NTA柱，混勻，置4°C摇床上结合3小时，用8M尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20， IOmM Tris 缓冲液(PH6. 3)洗；再用 8M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20, IOmM Tris 缓冲液 (PH4. 5)洗脱，收集smBAFF纯化蛋白，分别用6M尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20 ；4M尿素， IOOmMNaH2PO4 · 2H20 ；2M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20 ； IM 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20 ；0. 5M 尿素，IOOmM NaH2PO4 · 2H20和IOOmM NaH2PO4 · 2H20梯度缓冲液透析，洗脱样品中的尿素。过滤除菌。产物经测定，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，smBAFF蛋白较天然BAFF蛋白相比， 天然BAFF蛋白第84-91位氨基酸VHVFGDEL突变为GG。实施例如mBAFF的细胞学活性的测定1. smBAFF对BAFF-R (+) B细胞表面受体具有特异性结合能力用含10 %胎牛血清的IMDM培养基分别接种BAFF-R⑴的B细胞Hmy. CIR和 BAFF-R(-)的U937细胞于12孔细胞培养板，接种密度为IO5细胞/孔，每孔加smBAFF蛋白， 使其终浓度达5ng/ml,37°C ,5% CO2培养24小时。1200转/分离心3分钟，弃上清，用PBS 洗细胞2遍，每次1200转/分，离心3分钟，弃上清。加0.5ml PBS重悬细胞，制备细胞涂片，把细胞涂片浸入95%乙醇中固定20分钟，然后放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。加1 500稀释的抗BAFF(羊抗人)一抗(购自R&D公司)，置于免疫组化湿盒内， 4°C冰箱过夜。PBS振洗3次，每次5min，吹干。加1 5000稀释的荧光素标记的抗羊二抗 (购自R&D公司)，置于免疫组化湿盒内，37度保温60分钟。PBS振洗2次，每次5min，然后用蒸馏水振洗1次。50%缓冲甘油封片。倒置荧光显微镜下观察结果。实验结果见图3。由图3可以看出经免疫荧光染色后在倒置荧光显微镜下可观察到BAFF_R(+) Hmy2. CHR细胞有较强红色荧光出现(如图3. a)，而阴性对照组BAFF-R(-)U937细胞则未见荧光(如图3. c)，表明重组蛋白与BAFF-R (+) Hmy2. CHR细胞表面受体具有特异性结合能力。2. smBAFF对BAFF-R (+) B细胞有刺激增殖作用以BCA法测定smBAFF蛋白浓度为30ug/ml，无菌条件下，用IMDM细胞培养基将蛋白稀释5个浓度梯度，分别为0ug/ml、0· 6ug/ml 1. 2ug/ml、l. 8ug/ml和3. 6ug/ml，分别作为五个实验组，并设立对照组和空白组。将处于对数生长期的BAFF-R(+)的B细胞株Hmy. CHR和BAFF-R(-)的U937悬浮细胞接种于含10%胎牛血清的IMDM培养基的96孔细胞培养板中，接种密度均为5000细胞/50ul/孔，空白组不接种细胞，加空白培养基补足50ul/孔， 每组做3个复孔，边缘孔加无菌PBS以维持湿润环境。每组分别加相应浓度梯度的smBAFF 蛋白50ul，对照组不加蛋白，以空白培养基50ul/孔取代。以天然BAFF蛋白做平行实验。 37°C,5% CO2培养72小时，加CCK8溶液(日本Dojindo公司产品)IOul混勻，继续培养3 小时，450nm测定OD值，计算每组平均OD值。以每组平均OD值，按下列公式计算出smBAFF蛋白和天然BAFF蛋白分别对Hmy. CIR细胞和U937细胞的增值率。细胞增值率=(实验组OD-空白组0D) / (对照组OD-空白组0D)实验结果见图4。由图4可以看出天然BAFF蛋白和本发明所述蛋白smBAFF对BAFF-R(-)的U937 细胞均无增殖作用，增加蛋白浓度也未见变化；两者比较无差异。而对BAFF-R(+)的B细胞株Hmy. CHR而言，天然BAFF蛋白对其有明显的细胞增殖作用，且随蛋白浓度的提高，天然BAFF蛋白对Hmy. CIR细胞的增殖率相应提高，当蛋白浓度为3.6ug/ml时，天然BAFF蛋白对Hmy. CHR细胞的增殖率可达84%。本发明所述蛋白 smBAFF对Hmy. CIR细胞无增殖作用，两者比较有明显差异。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种可溶性突变BAFF基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一种由权利要求1所述基因表达的可溶性突变BAFF蛋白，其特征在于，氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
3.一种含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表达载体。
4.含有权利要求1所述核苷酸序列或权利要求3所述表达载体的重组细胞。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)。
6.权利要求4所述重组细胞的构建的方法，其特征在于，通过将smBAFF编码序列与表达载体是pET41a连接，转入大肠杆菌，抗生素筛选获得高表达工程细胞。
7.权利要求2所述可溶性突变BAFF蛋白在制备化疗药物、放射性同位素药物及以B细胞为靶细胞的靶向治疗制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可溶性突变BAFF蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。本发明所述的可溶性突变BAFF蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该可溶性突变BAFF蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述的突变的smBAFF保留结合BAFF受体能力而丧失活化受体的能力，因而不刺激B细胞增殖活化，作为B细胞靶向载体更为安全；编码smBAFF的基因，非常适合在大肠杆菌中表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高表达量，具有高表达、高稳定的优点。本发明获得保留受体结合活性而缺失受体活化活性的人BAFF突变体-smBAFF，并可高效、简便、低成本的制备重组人smBAFF。
文档编号C07K14/525GK102250920SQ20111009677
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者焦玉莲, 赵跃然, 陈子江, 马金龙 申请人:赵跃然, 陈子江