登革病毒亚单位疫苗及其制备方法

专利名称：登革病毒亚单位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药高技术领域，特别涉及一种登革病毒亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术：
登革病毒(dengue virus,DV)是黄病毒属(Flaviviridae)有包膜的单股正链RNA 病毒，有四个血清型(DV1-4)，以蚊虫为媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。DV感染所致的人类登革热(classical dengue fever，DF)和登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)严重危害人类健康。全球有 25 30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，DHF病例约50万，死亡率5 20 %， 如治疗不及时可达50%。近年来，随着全球气候变暖、人口流动、生态环境恶化、蚊媒分布区域扩展等诸多原因，登革热流行的范围和频率不断增加，WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病(Murgue B. 2010)。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区也都是重点流行区域，多次发生DF，DHF/DSS的爆发流行。但时至今日，对DV感染性疾病尚无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。因此，对DV的有效免疫分子展开深入研究，并从中发掘有效的治疗策略和途径是当前登革热控制的当务之急(Mathew A. et al. 2008)。要认识DV的有效免疫分子，首先得从DV的结构入手。DV基因组(约111Λ)可编码3种结构蛋白(衣壳蛋白C，基质蛋白M和包膜糖蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1，NS2A， NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和 NSQ (Leyssen P，et al. 2000)。其中，糖蛋白 E 位于 DV 包膜上，是 DV吸附靶细胞的重要功能蛋白(Modis Y,et al. 2004)，由三个功能区构成中心区(Domain I)，二聚体形成区(Domain II)和一个受体结合区(Domain III)。DV E蛋白DIII区是决定病毒与受体结合的关键结构域，由E蛋白的295 392位残基构成，没有糖基化位点，但有一对二硫键(CyS302-CyS333)对维持其结构很重要，残基382-386形成一个受体结合Loop 环，是DV识别和结合靶细胞上病毒受体的重要功能位点，决定着DV感染的靶细胞种类和组织嗜性(Matsui K，et al. 2009)。虽然DV的受体尚未确定，但利用纯化的DV E蛋白DIII 区(EDIII)及其抗血清可在体外阻断DV的感染(Batra G，et al. 2010)，证实了 EDIII区是DV识别靶细胞上病毒受体的功能域，且有保护功能。古巴PCT/CU2006/000015公开了 E蛋白的表面的保守区域用于预防和/或治疗由登革病毒1-4和其他黄病毒引起的感染，涉及嵌合蛋白质，其用作疫苗或用于针对登革病毒的4种血清型和其他黄病毒的预防性或治疗性治疗。但因血清型别的差异，交叉保护作用弱。古巴PCT/⑶1998/000001公开了登革病毒的前M/M蛋白的表位、合成肽，涉及5种登革2型病毒前M/M蛋白的合成肽，能激发抗四种登革病毒血清型的中和抗体。但登革病毒的preM/M蛋白有很强的非中和表位(Dejnirattisai M, et al. kience，2010)，由此引发的抗体依赖的感染增强现象(ADE)不容忽视。
3
古巴PCT/⑶97/00006公开了利用毕赤酵母属甲基营养酵母表达编码血清型2和 4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。编码病毒蛋白E的基因序列是血清2型登革病毒的起点，来自1981年古巴登革热和出血登革热流行期间分离的毒株A15。对于血清4型登革病毒，起点是编码病毒蛋白E的基因序列，病毒来自1981年多米尼加共和国登革热流行期间分离的毒株814669。使用的病毒株较为久远，对现行流行株的预防效果有待深入探讨。陈宗涛等200810069545公开了一种抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体，能特异性地结合登革病毒，可以应用于制备新型有效的预防和治疗登革病毒感染的药物，并且还可以做成试剂盒，用于检测登革病毒。该单克隆抗体的中和效能偏低，应用受限。Zhang AS等(J Virol Methods, 2007)公开了一种用大肠杆菌表达2型登革病毒E 蛋白III区的方法，有一定保护效果，但产量为25mg/L，制备效率偏低，不利于规模化制备。Wang J等(Dengue Bulletin. 2006)公开了一种大肠杆菌谷胱甘肽转移酶(GST) 融合的登革病毒E蛋白，但保护实验表明该融合蛋白没有保护功能，提示重组分子效能与其天然结构的维持密切相关。印度^emad B等Q008)和我国学者Chen S等Q007)将4种血清型登革病毒E 蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1 47-1 588，对各型DV的保护力差异较大，不利于推广。新加坡Sim CAN等Q008)报到了一种表达登革病毒EDIII的重组乳链球菌制剂， 但对同种或不同种小鼠的保护能力差异很大，其中和效果和免疫途径都有待深入进行评估。综上所述，本领域急切需求安全性好，免疫效价高的优质疫苗。

发明内容
本发明的目的就是提供一种安全、新型、免疫效果好、适于产业化生产的疫苗。该疫苗融合了登革病毒保护性抗原组分，可以刺激机体产生免疫应答，可以用于预防登革病毒感染性疾病。本发明的技术方案是登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，所述的重组表达质粒中含有一个由下列元件组成融合编码基因A)引导肽编码序列；B)登革病毒包膜糖蛋白EDIII编码区；C)编码序列为SEQ ID NO 9所示的连续6个组氨酸编码序列。所述表达质粒是述表达质粒是pETWb或pQE-31或pET 28a0所述的编码基因是由插入元件按a-b-c的顺序串联串联、优化而成，相邻两个元件之间没有终止密码子。所述的引导肽编码序列选自SEQ ID NO :1所示的胡萝卜软腐欧文(氏)菌果胶酶信号肽的核苷酸序列。所述的登革病毒包膜糖蛋白EDIII编码区选自SEQ ID NO 5所示的2型登革病毒包膜糖蛋白EDIII的核苷酸序列；SEQ ID NO :7所示的1型登革病毒包膜糖蛋白EDIII 的核苷酸序列。
所述的登革病毒为登革病毒血清型1或2或3或4型。一种融合蛋白，由登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒经转化靶细菌后表达，所述融合蛋白不含任何核苷酸。所述的靶细菌包括BL21或Rosetta或观33来源于大肠杆菌的宿主细菌。登革病毒亚单位疫苗，含有上述融合蛋白和药学中可以接受的佐剂或载体。登革病毒亚单位疫苗在制备预防登革热的药物中的用途。登革病毒亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤1)将上述的含有登革病毒亚单位疫苗融合基因的重组表达质粒导入靶细菌；2)当所述的转化靶细菌培养至0D600值为0. 5时，加入0. 5mM的诱导剂IPTG进行诱导，37°C下培养4小时，收集诱导细菌；3)超声破壁，收集包涵体；4)溶解包涵体，用Ni-NTA层析柱进行纯化；5)收集含目的蛋白的洗脱峰，透析复性；6)用XK16阳离子交换柱进行纯化，收集含目标蛋白的洗脱峰；7)透析脱盐处理后得到所需的登革病毒亚单位疫苗蛋白。本发明提供了包含本发明所述的重组登革病毒亚单位疫苗的各种组合物，包括药用组合物，尤其是疫苗组合物。药用组合物所述的药用组合物可以包含实际使用时所选用的药学上可以接受的缓冲剂，也包含用于预定用途的其它物质。本领域已有多种缓冲剂适用于预定用途，本领域的技术人员都善于选择的缓冲剂。在一些实例中，该药用组合可以含有药学上可接受的保湿剂，药学上可接受的各种保湿剂在多种公开出版物都有叙述，包括如中华人民共和国药典(2005版)。所述的药用组合物可制备出各种剂型，如注射剂、片剂、丸剂、胶囊、喷雾剂等。适用于局部使用和口服的药用级别的有机或无机载体或稀释剂。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油脂。还可用稳定剂、乳化剂、维持PH的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助材料。当本发明用作疫苗时，重组的登革病毒亚单位疫苗可采用多种方法进行配制。通常情况下，按本领域熟知的各种方法，用药学上可以接受的载体或运载体配制本发明的疫苗。合适的药用载体包括无菌生理盐水，也可用其它无菌的水性和非水性的等渗注射液，是本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体。配制本发明的疫苗组合物时还可含有其它成分，如佐剂、稳定剂、PH调节剂、防腐剂等。这些成分都是疫苗领域的技术人员所熟知的。佐剂包括(但不限于)铝盐佐剂、皂苷佐剂、Cerbu佐剂(Cerbu Biotechnik Gmbh, Gaiberg, Germany)等。稳定剂包括(但不限于)精氨酸、乙基纤维素、多元醇、氨基酸、无机盐、PEG等。给药途径与剂量当用作疫苗时，可用本领域技术人员熟知的方法将本发明的登革病毒亚单位疫苗施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，除含有重组的登革病毒亚单位疫苗蛋白外，还可包括药学上可以接受的载体、佐剂、稳定剂、PH调节剂等。
给药常规与途径包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、静脉注射、经口服等，如果需要也可采用组合给药途径。疫苗组合物的给用剂量可以单剂量，也可多剂量，且可给予加强剂量以维持被施用个体的免疫力。在所选用的给药途径中，应以“有效剂量”给予登革病毒亚单位疫苗的量，足以引发被施用个体的免疫应答，且能有效保护被施用个体，足以抵抗登革病毒的感染。所述的有效剂量，是指在疫苗组合物中所选用的登革病毒亚单位疫苗的量是按可引发个体免疫保护性应答而无明显的副作用的量确定。以疫苗组分中登革病毒亚单位疫苗蛋白质为基础计算有效剂量，通常包括给予约l_500yg蛋白质，较佳地为l-200yg，更加地10-100 μ g。可用包括观察对象中的抗体滴度和其它反应来确定具体疫苗的最佳用量，通过检测疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量，施用佐剂或免疫刺激剂可提高本发明登革病毒亚单位疫苗的免疫应答，这些都是本领域的技术人员所熟知的。与现有技术相比，本发明具有以下优点1.保持了天然结构，提高了免疫的有效性1)本方面提供的登革病毒亚单位疫苗既拥有登革病毒E蛋白的中和表位，能有效刺激机体的产生保护性免疫应答。2)提供的重组蛋白含有特定的引导肽序列，有利于疫苗中和表位的结构呈现，保持最佳的免疫原性，免疫宿主个体后可以产生对登革病毒的免疫活性，免疫效能上优于同类疫苗制剂。3)所述的亚单位疫苗蛋白含有6XHis纯化标签，便于制备过程中的纯化，其纯化途径相对便捷。2.为成分单一的蛋白制剂，提高了疫苗的安全性。1)本发明的登革病毒亚单位疫苗为一种重组的蛋白质制剂，不具有复制能力，也不会引起登革病毒导致的特异性细胞病变，可以最大程度地降低疫苗使用的风险。2)在疫苗的设计上，采用了登革病毒E蛋白中重要的中和表位肽，摒弃了非中和表位，大大降低了疫苗使用后引发的抗体依赖的增强现象，即ADE现象，提高了使用安全性。3.生产成本低。1)本发明所述的登革病毒亚单位疫苗是采用大肠杆菌系统表达的，其成本相对于酵母系统、哺乳动物细胞表达系统低，利于成本的控制。2)在构建了重组表达质粒后，转化靶细菌并筛选稳定的细菌克隆。在生产时，只需要培养稳定转化的细菌克隆、加入诱导剂诱导，即可产生大量的登革病毒亚单位疫苗，经适当的纯化途径即可获得登革病毒亚单位疫苗，缩短了疫苗生产流程，提高了疫苗的生产效率，产品生产成本降低。下面结合具体实施实例，进一步阐明本发明。应当指出的是，这些实施实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002) 中所述的条件，或按试剂制造产家所建议的条件进行。


图1为实施实例1中登革病毒亚单位疫苗分子重组表达质粒制备的过程示意图。图2为实施实例3中革病毒亚单位疫苗分子Wfertern blot鉴定示意图。图3为实施实例4中革病毒亚单位疫苗分子纯化结果的SDS-PAGE示意图。图4显示了实施实例6中革病毒亚单位疫苗分子免疫小鼠血清中和病毒感染细胞的示意图
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，以2型登革病毒主要保护性抗原功能区为核心，建立了登革病毒亚单位疫苗制备技术，并成功构建了安全性好、免疫效价高的登革病毒亚单位疫苗，在此基础上完成了本发明。经过大量实验，证实本文所述的登革病毒亚单位疫苗分子的构建必须满足下列条件1)必须有合适的引导肽序列。胡萝卜软腐欧文(氏)菌果胶酶信号肽为一种多功能引导肽，能在大肠杆菌中将所携带的重组蛋白引导至细菌的周间隙，增加蛋白的溶解性， 对外源蛋白天然结构的维持有重要作用，本发明选用该引导肽，实验证实其缺失或移码突变，重组蛋白的免疫保护效果会显著下降。2)删除登革病毒E蛋白的前294个氨基酸和后99个氨基酸，保留的编码序列是登革病毒E蛋白的中后部318个核苷酸，因为这段序列以前的编码序列所编码的氨基酸含有更多的非中和表位，有2个糖基化位点，不宜在原核细胞中表达；这段序列以后的编码序列所编码的氨基酸中含有一个包膜锚定区(氨基酸452-491)和一个茎环区(氨基酸 395-450)，能使表达的E蛋白滞留于内质网上，降低了分泌。3)添加必要的纯化标签，如适用于本发明的6XHis标签，便于登革病毒亚单位疫苗蛋白的纯化。可用于本发明的登革病毒是血清亚型中的任何一种，4种亚型的基因组序列登录号如下I 型U88536II 型U87411III 型AY099336IV 型AF326825在制备本发明的登革病毒亚单位疫苗蛋白时，通常按以下步骤进行(以2型登革病毒为例)1.构建重组表达质粒这可通过PCR扩增、连接、转化技术实现(见实施例1)，制备重组质粒进行限制性酶切和核苷酸测序鉴定。2.筛选并鉴定重组细菌克隆(见实施例2)在获得重组表达质粒连接产物后，一种常规的方法是将其引入靶细菌，一种优选的方法是采用质粒携带的抗性基因所对应的抗生素(如氨苄青霉素)筛选质粒转化后的细菌，获得有稳定抗性的细菌克隆，扩增所需克隆，用诱导剂IPTG进行诱导，利用SDS-PAGE电泳分析表达条带，确定表达目标蛋白的细菌克隆。
3.登革病毒亚单位疫苗蛋白的表达(见实施例3)培养2中筛选出的克隆，加入0. 5mM的诱导剂IPTG，30°C诱导4小时，离心收集菌体，超声破碎，制备重组蛋白包涵体。4.登革病毒亚单位疫苗蛋白的纯化(见实施例4)将包涵体溶解于8M尿素中，离心收集上清，分别用Ni-NTA亲和层析柱和阳离子交换株进行纯化，收集洗脱峰，透析至保存液中备用。本发明所用的常规试剂采用市售的分析纯试剂。实施例1登革病毒亚单位疫苗重组表达质粒的构建过程1.弓丨导肽(pelB片段)序列的PCR扩增(1)所述的引导肽为胡萝卜软腐欧文(氏)菌果胶酶信号肽。根据SEQ NO 1所示的信号肽序列(Lei SP，et al，J Bacteriol. 1987 ； 169 (9) :4379-4383)设计一对寡核苷酸片段P1 7]47]4CCATGGGCAAATACCTGCTGCCGACCGCT(黑体为 NcoI 位点)(SEQ ID No 3), P2 TATACATATG GGCCATCGCGGTGGGC(黑体为 NdeI 位点)(SEQ ID No 4)，由深圳华大基因公司DNA合成部合成。(2)胡萝卜软腐欧文(氏)菌基因组DNA的制备基因组提取试剂盒为!Iomega产品，操作按公司说明书进行。(3)PCR扩增以O)中提取的DNA为模板，用P1-P2引物进行PCR扩增，反应如下
DNA 模板(20|Lig/ml)Ιμ 5xPCR buffer (TaKaRa)ΙΟμΙMgCl2(25mM) (TaKaRa)5μ1dNTP(25mM/each) (TaKaRa)Ιμ 引物 ΜΙ(ΙΟμΜ)Ιμ 引物 Μ2(10μΜ)Ιμ PrimerStar (lOU/μΙ)Ιμ dH2030μ1total50 μ 混勻后，置PCR扩增仪(Biofcid)上按94°C 30秒，52°C 30秒，72 V 30秒扩增25 个循环，1.5%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收目的片段；2.酶切与连接回收的pelB片段经NcoI (TaKaRa)/NdeI (TaKaRa)双酶切，插入原核表达质粒 pET-16b (Novagen)的 Ncol/Ndel 位点。
8pelB 片段(45ng/|Lil)10 μ
IOxbuffer B(TakaRa)5 μ
NcoI (5υ/μ1)2 μ 酶切反应，、
NdeI (5υ/μ1)2 μ
dH2031μ1
total50 μ 混勻后置37°C水浴反应4小时，1. 5%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa 胶回收试剂盒说明书回收双酶切后的PelB片段；pET-16b (Novagen)质粒的双酶切反应体系同上，回收质粒；
IOxligation buffer (Promega)1.5μ1连接反应pET-16b(NcoI/NdeI酶切，25 ng/μ )Ιμ
pelB 片段(Ncol/Ndel 酶切，60ng/|iil)5μ1
Τ4 ligase (Promega,10U/pl)Ιμ
dH206.5μ1
total15μ1混勻后置16°C水浴反应16小时，750C 5min灭活连接酶；3.转化大肠埃希菌DH5ci感受态的制备参见分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，200 ，取4μ 1连接产物于100 μ 1 DH5a感受态细胞中，混勻，冰浴中30min，42°C休克90秒，置冰浴中2min，将混合物加入900 μ 1 LB培养基CTakaRa)中，37°C振荡培养1小时，涂布AMP (100 μ g/ml，西南制药三厂)琼脂平板，37°C培养18小时，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取与鉴定，序列正确者命名为pET-pelB。4.登革病毒2型E蛋白中和表位编码序列(EDIII)的PCR扩增(1)所述的登革病毒2型为U87411登录号的病毒株，用SV Total RNA Isolation 试剂盒(Promega)，按试剂盒说明书提取登革病毒RNA，用RT-PCR方法扩增EDIII蛋白(SEQ ID No 6)编码序列(E 片段)(SEQ ID No :5)，所用 DNA 引物如下E1，TATACATATG ATGTGCACAGGAAAGTTTAAAG(黑体为 NdeI 位点)(SEQ ID No 11)禾口 E2，GGG GGATCC7T4 CACCATCATCACCATCACTTGACCG ATAG AACTTCCTTT (黑体为 BamHI 位点，斜体为终止密码，下划线为6XHis标签)(SEQ ID No :12)，引物由深圳华大基因公司合成；(2)逆转录逆转录(RT)试剂盒为Promega产品，以病毒RNA为模板，以试剂盒携带的随机引物(6mer)进行RT得到cDNA第一链，RT反应如下
9IOxRTbuffer4μ1MgCl2(25mM)2μ1dNTP(25mM/each)Ιμ 随机引物(10μΜ)Ιμ RNasin(40pg/ml)Ιμ 逆转录酶(AMV,10U/|li1)Ιμ TotalRNA(0.6“g/pl)ΙΟμΙRNase free H2O20μ1混勻后42°C水浴1小时，然后75°C 10分钟，以灭活逆转录酶。(3). EDIII片段的PCR扩增以cDNA第一链为模板，以E1/E2为引物进行PCR扩增，
扩增条件如下
5xPCR buffer (TaKaRa)ΙΟμΙ
MgCl2(25mM) (TaKaRa)5μ1
cDNA 第一链(ImM)Ιμ
dNTP(25mM/each) (TaKaRa) 2μ1 引物 ΕΙ(ΙΟμΜ)Ιμ
引物 Ε2(10μΜ)Ιμ
PrimerStar (lOU/μΙ)Ιμ
dH2027μ1
total50 μ 混勻后，置PCR扩增仪(Biofcid)上按94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 2分钟扩增25 个循环，1.2%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收EDIII 片段；5. EDIII 片段的克隆回收的 EDIII 片段经 NheI (TaKaRa) /BamHI (TaKaRa)双酶切， 克隆入3中构建的pET-pelB之中
EDIII 片段(45ng/|Lil) ΙΟμΙ
IOxbuffer B(TakaRa)5 μ
NdeI (5υ/μ1)2 μ 酶切反应κ 、，
BamHI (5υ/μ1)2 μ
dH2031μ1
total50 μ 混勻后置37°C水浴反应4小时，1. 2%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa 胶回收试剂盒说明书回收双酶切后的EDIII片段；
pET-pelB(3中构建)质粒的双酶切反应体系同上，回收质粒；
IOxligation buffer (Promega)1.5μ1
pET-pelB(NdeI/Bamffl 酶切，25 ng/μ )Ιμ
SME 片段(Ndel/Bamffl 酶切，68ng/|iil)5μ1连接反应
Τ4 ligase (Promega,10U/pl)Ιμ
dH206.5μ1
total15μ1混勻后置16°C水浴反应16小时，75°C 5min灭活连接酶；转化实验大肠埃希菌DH5 α感受态的制备参见分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002)，取4μ 1连接产物于ΙΟΟμΙ DH5a感受态细胞中，混勻，冰浴中30min，42°C 休克90秒，置冰浴中2min，将混合物加入900 μ 1 LB培养基CTakaRa)中，37°C振荡培养1 小时，涂布AMP (100 μ g/ml，西南制药)琼脂平板，37°C培养18小时，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取与鉴定。附图1显示了登革病毒亚单位疫苗重组表达质粒的构建过程，含正确编码序列的重组子命名为pET-pelB-EDIII-His。实施例2筛选并鉴定重组细菌克隆1.将实施例1所述的重组表达质粒pET-pelB-EDIII-His按分子克隆实验指南 (第三版，科学出版社，200 的方法转化BL21大肠杆菌感受态，具体参见实施例1中步骤 5中描述的方法进行。2.挑取10个氨苄青抗性克隆，用Iml LB培养基进行培养，等0D600值约为 0. 3-0. 5时，加入0. 5mM IPTG诱导剂诱导1小时，14000转/分钟离心5分钟，收集菌体。3.参照分子克隆实验指南的方法进行SDS-PAGE电泳，电泳后的凝胶用考马斯兰染色，观察，与未诱导的菌株相比，有明确表达条带的克隆为表达阳性克隆，命名为 pET-pelB-EDIII-His/BL21 工程菌。4.登革病毒亚单位疫苗蛋白的纯化(见实施例4)将包涵体溶解于8M尿素中，离心收集上清，分别用Ni-NTA亲和层析柱和阳离子交换株进行纯化，收集洗脱峰，透析至保存液中备用。实施例3登革病毒亚单位疫苗蛋白的表达与鉴定1.复苏实施例2中获得的稳定转化pET-pelB-EDIII-HiS/BL21工程菌，扩大培养至2000ml，待0D600值约为0. 5时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导4小时，收集培养物离心(Sigma 3T3离心机)，留存细菌沉淀。2.称取细菌湿重，用 TBS300 buffer (IOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,300mM NaCl，lM Urea)重悬，制成10% (w/v)细菌悬液。3.在细菌悬液中加入终浓度为20μ g/ml的溶菌酶(Sigma公司)和ImM的 PMSF (蛋白酶抑制剂，Sigma公司)，37°C孵育30分钟，超声处理，间隙10秒，工作11秒，处理2个循环(宁波东芝超声仪)。4.超声物经15000转/分钟离心30分钟(日立21G离心机)，沉淀用含TritonX-100 (上海生工)洗涤2次后，加入8M尿素溶液(IOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH8. 0， 300mM NaCl，8M Urea, 5mm imidazole, Imm β-ME)，4°C溶解过夜。5.疫苗蛋白的鉴定取溶解的蛋白溶液10 μ 1，加入2 X loading buffer，参见分子克隆实验指南的方法进行SDS-PAGE电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗His的抗血清(中山公司)作一抗，辣根过氧化物酶(HR)标记的兔抗小鼠(中山公司)作二抗进行免疫印迹(Western blot)鉴定。附图2显示了重组表达登革病毒亚单位疫苗的Western blot鉴定结果，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为表达菌制备包涵体，泳道3为纯化的目标蛋白，箭头所示的特异性抗原印迹条带即为所需的目标蛋白。实施例4登革病毒亚单位疫苗蛋白的纯化1.样品处理将实施例3中8M尿素溶液(Buffer Α)溶解物用15000转/分钟离心 30分钟(日立21G离心机)，收集上清，用0. 22 μ m的滤器(Millipore公司)过滤，收集过滤液作为纯化样品。2. Ni-NTA柱纯化将样品以0. 5ml/min上样于预先经Buffer A平衡好的Ni-NTA层析柱(Bio-Rad)，用buffer A平衡至基线，再用Buffer B[Buffer A+20mM咪唑(上海生工产品)]进行冲洗，最后用Buffer C[Buffer A+150mM咪唑(上海生工产品)]冲洗，收集洗脱峰，经12 % SDS-PAGE电泳分析目标蛋白的纯度。3.目标蛋白透析复性因在8M尿素中的蛋白分子处于变性状态，需要将其复性方可具有生物学活性，复性采用透析方法。即将含目标蛋白的洗脱峰依次用buffer DdOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,300mM NaCl，4M Urea, Imm β -ME), buffer E(100mM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,300mM NaCl,2MUrea,0. ImM EDTA，0.01 % TritonX-100,10 % Glycerol)，和 buffer F(100mMNa2P04, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,150mM NaCl,0. ImM EDTA, 0.01% TritonX-100,10% Glycerol)进行透析处理，4°C透析4h后换液，最后15000转/分钟离心30分钟，上清用0. 22 μ m的滤器(Millipore公司)过滤，收集过滤液。4.离子交换纯化Ni-NTA柱纯化并复性的样品仍含有少量杂质，对透析后的样品用GE Healthcare的XK16阳离子交换柱进行离子交换纯化。层析柱先用buffer I (IOmM磷酸盐缓冲液，PH 8. 0)平衡，上样后再用buffer I冲洗，用0 IMNaCl的梯度液进行洗脱， 收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳分析目标蛋白纯度，用buffer F (见；3)透析4h，再用buffer GdOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,150mM NaCl,0. ImM EDTA,0. 01% Triton X-100, 50% Glycerol)透析，保存于_20°C备用。附图4显示了重组表达登革病毒亚单位疫苗蛋白的纯化物经SDS-PAGE电泳分析结果，泳道1为含重组质粒的工程菌未加诱导剂诱导，泳道 2为加了 0. 5mM诱导剂培养4h后的工程菌，泳道3为蛋白分子量标准，泳道4为Ni-NTA亲和柱纯化的洗脱峰，泳道5为离子交换洗脱峰，箭头所示的为目标蛋白。实施例5登革病毒亚单位疫苗的动物免疫1.动物免疫为证实登革病毒亚单位疫苗的免疫效能，我们检测了登革病毒亚单位疫苗对BALB/c小鼠免疫后的抗体产生效价。登革病毒亚单位疫苗的免疫方案10只4周龄BALB/c小鼠，分对照组和免疫组进行实验。正常对照疫苗免疫组
第一天皮下和腹腔注射
PBS ΙΟΟμΙ
40叩疫苗蛋白+福氏完全佐剂
(Sigma )
注射后28天皮下和腹腔追加注射
PBS ΙΟΟμΙ
40叩疫苗蛋白
注射后35天皮
下和腹腔加强
注射
取血
取血
权利要求
1.一种登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒中含有一个由下列元件组成的融合编码基因A)引导肽编码序列；B)登革病毒包膜糖蛋白EDIII编码区；C)编码序列为SEQID NO 9所示的连续6个组氨酸编码序列。
2.根据权利要求1所述的登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于所述表达质粒是 pET16b 或 pQE-31 或 pET 28a。
3.根据权利要求1所述的登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于所述的编码基因是由插入元件按a-b-c的顺序串联。
4.根据权利要求1所述的登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于所述的引导肽编码序列选自SEQ ID NO :1所示的胡萝卜软腐欧文(氏)菌果胶酶信号肽的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于所述的登革病毒包膜糖蛋白EDIII编码区选自SEQ ID NO :5所示的2型登革病毒包膜糖蛋白 EDIII的核苷酸序列；SEQ ID NO 7所示的1型登革病毒包膜糖蛋白EDIII的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于所述的登革病毒为登革病毒血清型1或2或3或4型。
7.一种融合蛋白，其特征在于由权利要求1所述的重组表达质粒转化靶细菌后表达， 所述融合蛋白不含任何核苷酸。
8.根据权利要求7所述的登革病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的靶细菌包括BL21 或Rosetta或观33等来源于大肠杆菌的宿主细菌。
9.一种登革病毒亚单位疫苗，其特征在于含有权利要求6所述的融合蛋白，和药学中可以接受的佐剂或载体。
10.权利要求9所述的登革病毒亚单位疫苗在制备预防登革热的药物中的用途。
11.一种登革病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)将权利要求1所述的登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒导入靶细菌；2)当所述的转化靶细菌培养至0D600值为0.5时，加入0. 5mM的诱导剂IPTG进行诱导，37°C下培养4小时，收集诱导细菌；3)超声破壁，收集包涵体；4)溶解包涵体，用Ni-NTA层析柱进行纯化；5)收集含目的蛋白的洗脱峰，透析复性；6)用XK16阳离子交换柱进行纯化，收集含目标蛋白的洗脱峰；7)透析脱盐处理后得到所需的登革病毒亚单位疫苗蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种登革病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，所述的重组表达质粒中含有一个由下列元件组成的融合编码基因A)引导肽编码序列；B)登革病毒包膜糖蛋白EDIII编码区；C)编码序列为SEQ ID NO9所示的连续6个组氨酸编码序列。所述疫苗安全、新型、免疫效果好、适于产业化生产。该疫苗融合了登革病毒保护性抗原组分，可以刺激机体产生免疫应答，可以用于预防登革病毒感染性疾病。
文档编号C07K1/36GK102199617SQ201110112898
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者尚伟龙, 张俊磊, 方昕, 杨杰, 胡珍, 饶贤才 申请人:中国人民解放军第三军医大学