专利名称：重组人干扰素β-1a的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白的纯化方法。具体而言，本发明公开了重组人干扰素β-Ia 的纯化新工艺。本发明摒弃了影响蛋白活性较大的反相层析与金属螯合层析这些步骤，设计出新的纯化工艺，采用了包含一次亲和层析与两次离子交换层析的纯化过程，得到了高纯度、生物活性良好的重组人干扰素β-la。
背景技术：
干扰素(interferon，IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用的重要细胞因子，根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素将其分为2种类型1型和II 型，干扰素β (IFNi3)属于I型干扰素，IFNii主要由成纤维细胞产生。人IFNii基因长 777bp，位于染色体9P22，与IFNa基因簇临近。IFNa与IFN^结合于同一受体，但后者与受体的亲和力大于前者。与IFNa相比，IFNii具有严格的种属特异性，其它种属的IFN3 在人细胞上没有活性。干扰素i3-la(IFNi3-la)是由166个氨基酸组成的糖蛋白，分子量约22. 5KD，如去除糖链，分子量约为18KD，糖基化位点位于Asn80。IFN^含有3个半胱氨酸Cysl7，Cys31和Cysl41，其中Cys31和Cysl41组成分子内二硫键。IFN^-Ia主要通过诱导人成纤维细胞或者经过基因改造的哺乳动物细胞产生。还原型的Cysl7易于导致蛋白不稳定，将其突变成Ser后可提高蛋白稳定性，可由大肠杆菌以包涵体形式表达，通过变复性得到具有活性的蛋白，但不具有糖链，且在N末端缺少甲硫氨酸，因此只有165个氨基酸， 由此得到的干扰素命名为IFNi3-lb。IFN^涉及调节非特异性体液免疫和抗病毒免疫，其临床治疗作用主要表现在以下几方面1)多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)。多发性硬化是主要以中枢神经系统(CNQ白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病，免疫调节治疗是治疗MS的主要策略[Kieseier BC, Hartung HP. Current disease-modifying Therapies in multiple scierosis. Semin Neurot, 2003, 23 (2) :133-146.]。基因工程人 IFN β 是经过 FDA 批准应用于多发性硬化症的生物制品。2)恶性肿瘤的辅助治疗。IFNii对某些恶性肿瘤具有直接的抑制及治疗作用。目前美国及日本已批准进行基因工程IFNii应用于恶性脑胶质瘤、肾癌、小细胞肺癌的辅助治疗的研究，雪兰诺公司的Rebif产品已进入III期临床研究。3)多种病毒感染性疾病。IFNii和IFNa —样均属于I型IFN，IFN β具有广谱抗病毒作用，它们能诱导宿主细胞产生多种活性酶来干扰病毒复制的各个环节。已往的临床研究结果已证实，IFN^对慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、HPV感染所致的生殖器湿疣、由 HSV感染所致的流行性病毒性脑炎及HIV感染均具有较好的治疗作用，可应用于多种DNA病毒、RNA病毒感染的预防与治疗。目前IFNii主要用于多发性硬化症的治疗，包括细胞培养获得的IFNi3-Ia与通过大肠杆菌表达的IFNi3-lb。目前市场上重组人IFNβ-Ia类药物有Biogen IDEC公司的
3AVONEX默克雪兰诺公司的Rebif ，和伊朗于2006年在其国内推出的仿制药CirmoVex。 目前Rebif 已经引进中国，中文商品名为“利比”;剂型包括冻干粉针，预充注射液等，尚无国产产品上市。日本的Diichi和Mochida公司研制的IFNii-Ib已经批准用于临床治疗丙型肝炎，雪兰诺公司的Rebif产品目前也正在进行丙型肝炎的II期临床研究。利用哺乳动物细胞表达得到的重组人IFNii具有与人天然IFNii —样的二硫键结构，以及比较相近的糖基化结构，所以其生物学活性几乎等同于天然蛋白质。而通过大肠杆菌表达得到的IFNii为包涵体形式，不具有生物学活性，需要经过复杂的变性、复性来实现其活性的恢复，其间蛋白质的损失较大，并且通过这种方式得到的蛋白质没有任何糖基化修饰，其生物学活性与天然蛋白相比，只有后者的十分之一左右。目前我国还没有成功开发人IFNii上市，而唯一处于注册阶段的某公司采用的是大肠杆菌表达，所以采用哺乳动物细胞表达生产重组人IFNii仍然是技术难点与市场空白。我们设计了高表达基因的真核表达载体，实现了重组人IFNii-Ia的高效表达和均一性表达，获得了高纯度的 IFN^-Ia,并对其抗病毒活性进行研究。现已成功构建稳定表达重组人IFNii-Ia的真核细胞株(CH0-K1-9A3)，并能稳定的在体外得到表达。天然人IFNii分子量约为22. 5KD，分子量较小，但是其又具有高疏水性等特点，导致其纯化难度大于其它常见蛋白质。目前文献中多数使用染料亲和层析或者CPG可控孔径玻璃填料作为捕获手段，后期通过反相层析、离子交换层析、分子筛层析、金属螯合层析等多种手段来实现该蛋白质的纯化[Ernest Knight, Jr. and Diana Fahey. Human Fibroblast Interferon-an Improved Purification. The Journal of Biological Chemistry,1981, 256(8) :3609-3611. Shin Yonehara, Yuko Yanase, Toshihiko Sano, et al.Purification of Human Lymphoblastoid Interferon by a Simple Procedure with High Yields. The Journal of Biological Chemistry,1980,256(8) :3770-3775. Wolfgang Berthold,Celine Tan, and Y. H. Tan. Purification and in Vitro Labeling of Interferon from a Human Fibroblastoid Cell Line. The Journal of Biological Chemistry,1977,253 (14) 5206-5212.]。其中，反相层析或金属螯合层析为这些纯化过程的必有途径。反相层析需要使用有机溶剂作为蛋白质的洗脱介质，蛋白质长时间暴露在有机溶剂中将导致分子结构不同程度的改变，严重的可导致不可逆变性，严重影响蛋白的生物学活性。金属螯合层析会导致高浓度金属离子引入蛋白溶液中，不同程度导致蛋白活性的降低，并且增加了金属离子去除的难度。为此，开发一种减少蛋白活性丧失的IFNii纯化工艺具有重要的现实意义。一项发明专利(重组人IFNii的生产方法，申请号200510025595. 7)公开了重组人IFNii的层析纯化方法，可以用阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、疏水层析及其组合，但是该专利未能具体实施例说明是如何组合，以及其效果如何。为了得到生物学活性良好的重组人IFN β-la，并且使之各项指标符合作为药物开发的要求，本发明尝试一套重组人IFNii-Ia的纯化工艺，取代了可能导致蛋白质失活的反相层析与金属螯合层析，主要包括两次离子交换层析，包括强阴离子交换层析与弱阳离子交换层析，来去除与目的蛋白相比带有不同电荷的杂蛋白，并可以有效去除宿主残留蛋白，宿主残留DNA以及内毒素。
发明内容
本发明公开了重组人IFNii-Ia的纯化新工艺。本发明所述的重组人IFNii-Ia的纯化新工艺，包括以下步骤1)亲和层析细胞上清液浓缩处理后，平衡亲和层析柱后上样，再用洗脱液洗脱层析柱，收集洗脱峰；浓缩亲和层析收集液。2)强阴离子交换层析平衡阴离子层析柱；将上步的收集液上样，收集含有重组人IFNi3-Ia的流穿组份。3)弱阳离子交换层析平衡阳离子层析柱；将收集的阳离子层析柱流穿组分上样；用洗脱液洗脱层析柱，收集含有重组人IFNii-Ia的组分。将目的蛋白浓缩保存。本发明所述亲和层析过程，所用亲和层析柱选自Blue染料亲和层析柱以及抗体亲和层析柱之一。本发明所述离子交换层析过程，所选用强阴离子交换层析柱为阴离子交换柱 Q-s印harose，所选用弱阳离子交换层析柱为阳离子交换柱CM-s印harose。本发明还公开了另一种重组人IFNii-Ia的纯化方法，包括1)亲和层析细胞上清液浓缩处理后，平衡亲和层析柱后上样，再用洗脱液洗脱层析柱，收集洗脱峰；浓缩亲和层析柱收集液。2)弱阳离子交换层析平衡阳离子层析柱；将上步的收集液上样，洗脱液洗脱层析柱，收集含有重组人IFNii-Ia的组份。3)强阴离子交换层析平衡阴离子层析柱；将上步的收集液稀释上样，并收集含有重组人IFNii-Ia的流穿组份。将目的蛋白浓缩保存。本发明所述亲和层析过程，所用亲和层析柱选自Blue染料亲和层析柱以及抗体亲和层析柱之一。本发明所述离子交换层析过程，所选用强阴离子交换层析柱为阴离子交换柱 Q-sepharose0所选用弱阳离子交换层析柱为阳离子交换柱CM-sepharose。本发明所述离子交换层析过程可以首先用强阴离子层析柱进行阴离子交换层析， 再用弱阳离子层析柱进行阳离子交换层析；也可以首先用弱阳离子层析柱进行阳离子交换层析，再用强阴离子层析柱进行阴离子交换层析。本发明所述的重组人IFNii-Ia的纯化新工艺，简便易行，不存在复杂的变复性过程，经验证，可以方便的应用于IFNi3-Ia的规模化生产。本发明所述的重组人IFNii-Ia的纯化新工艺，经过对重组人IFNi^-Ia纯度验证与活性验证，并显示了良好的实际效果。本发明制备重组人IFNii-Ia与市售的IFNii-Ia Rebif (利比)经过对照，显示了本发明制备产物具有更高的生物学活性。
图1重组人IFNii-Ia纯化流程图，包括一次亲和层析与两次离子交换层析。离子交换层析分别为强阴离子交换层析与弱阳离子交换层析。图2重组人IFNi3-Ia的Bule染料亲和层析图。其中图A为AF-Blue亲和层析图， 图B为Capto-Blue Sepharose亲和层析图。其中纵坐标mAU表示A280紫外吸收值，横坐标为体积。
5
图3 Blue亲和层析_强阴离子交换层析_弱阳离子交换层析纯化(实施例2)后 IFNi3-Ia的RP-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于11. 8min出峰。图4 Blue亲和层析_强阴离子交换层析_弱阳离子交换层析纯化(实施例2)后 IFN^-Ia的SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于14. 5min出峰。图5 Blue亲和层析_弱阳离子交换层析_强阴离子交换层析纯化(实施例3)后 IFNi3-Ia的RP-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于11. 8min出峰。图6 Blue亲和层析_弱阳离子交换层析_强阴离子交换层析纯化(实施例3)后 IFN^-Ia的SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于14. 5min出峰。图7途径A和途径B纯化的IFN β -la,标准品(利比)以及蛋白质Marker的 SDS-PAGE电泳图谱，其中Lane 1 实施例2中Blue亲和层析-强阴离子交换层析-弱阳离子交换层析纯化后的重组人IFNii-Ia;Lane 2 实施例3中IFN^抗体亲和层析-弱阳离子交换层析-强阴离子交换层析纯化后的重组人IFNii-Ia ；Lane 3 重组人IFN β -Ia标准品(利比)；Lane 4 蛋白质 Marker。图8目的蛋白与市售原研药利比的生物学活性比较图。图A目的蛋白为通过Blue 染料亲和层析-强阴离子交换层析-弱阳离子交换层析纯化后的重组人IFNi3 -la。图B 目的蛋白为IFNii抗体亲和层析-弱阳离子交换层析-强阴离子交换层析纯化后的重组人 IFNi3-la。结果显示两者具有等同的生物学活性。其中〇表示利比，□表示分别的两批样
P
ΡΠ O
具体实施例方式实施例1重组人IFNii在哺乳动物细胞中的表达1)细胞株的构建我们采用哺乳动物偏性的密码子，将Genbank中人IFN0的基因序列进行优化， 在保证编码氨基酸序列(kquence No. 1)不变的情况下，用人工方法合成IFNβ基因序列(kquence No. 2)。将此人工合成的基因片段插入我们构建的一种高效真核表达质粒载体pCG-IFNii，转染CHO-Kl细胞，用甲硫酰硫酸胺筛选并建立了稳定转染的细胞株 CH0-K1-9A3，用免疫印迹及ELISA检测蛋白的表达，得到了一株可高水平分泌表达该蛋白的细胞株。再通过无血清培养驯化，获得了可适应于无血清培养的悬浮生长细胞株。2)重组人IFN β -Ia细胞株的鉴定用免疫印迹和ELISA均检测出该细胞株分泌表达的IFNii蛋白，其在细胞培养瓶中的表达量达0. 5-1 μ g/106细胞。以该细胞株建立原始细胞库，在原始细胞库基础上建立了主细胞库和工作库。对主细胞库检定表明其无细菌、真菌、支原体和病毒等外源因子CN 102219848 A
说明书
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污染，对工作细胞进行超过生产代次10代以上的细胞株检定，表明无致瘤性。合成引物 Sequence No. 3与kquence No. 4，用PCR及实时荧光定量PCR对连续传代50代以上的细胞进行IFN基因的鉴定及基因拷贝数分析，用免疫印迹和ELISA分析重组人IFNi3-Ia蛋白表达水平，结果表明该IFN基因稳定整合在CHO细胞染色体中，其拷贝数达72拷贝以上，表达水平稳定。体外试验表明，该蛋白具有抑制VSV病毒致WISH细胞病变的活性，其比活性与雪兰诺公司的利比相似。3)重组人IFN β -Ia细胞株的培养在300L细胞培养罐规模上，采用进口无血清细胞培养基，配合针对该细胞株开发的补料培养基，实现细胞密度最高达到8 X 106/ml。经过12天培养，培养液中目标蛋白质浓度达到10 15mg/L。我们成功建立了可稳定高水平表达具有高生物学活性的重组人IFNii-Ia蛋白的 CH0-K1-9A3细胞株，基于该细胞株建立的原始细胞库、主细胞库和工作细胞库的各项指标均符合《中华人民共和国药典》2005年版三部中的对于生物制品生产用动物细胞的要求。 该系列工作为建立该蛋白的生产工艺及进行其药理、药效学等研究奠定了基础。实施例2重组人IFN β -Ia蛋白的纯化途径A本实施例优选以羟基化的聚甲基丙烯酸类树脂为基质的染料亲和填料取代以葡聚糖为基质的亲和填料，前者的优点为填料硬度高，反压低，能够承受更大的工艺流速。其次选择两次离子交换的层析方法，先用强阴离子交换层析，后用弱阳离子交换层析，取代反相层析等工艺复杂，容易导致蛋白质变性的层析方法。其方法示意图如图1所示。材料与仪器AF-Blue HC 650Μ填料(T0S0H公司产品)，CM_s印harose FF±真料(GE healthcare 公司产品)，Q-s印harose FF填料(GE healthcare公司产品)。Pellicon 2超滤膜(截流分子量10K)，0· 5M2 (Millipore公司产品)，Pellicon超滤系统(Millipore公司产品)， Amicon 超滤离心管(Millipore 公司产品)，AKTA Purifier 层析系统(GE healthcare 公司广品)O实验方法1)上清液的浓缩清洁超滤系统，浓缩上清液，用(0. 025mol/L磷酸二氢钠+0. 025mol/L磷酸氢二钠)缓冲液(ΡΗ7· 2)置换浓缩液。^Blue染料亲和层析清洁AF-Blue层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作用(0. 025mol/L磷酸二氢钠+0. 025mol/L磷酸氢二钠)缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；上样后用(0. 025mol/L磷酸二氢钠+0. 025mol/L磷酸氢二钠)缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；用(0. 025mol/L磷酸二氢钠+0. 025mol/L磷酸氢二钠+2mol/L NaCl)缓冲液(ρΗ7· 2)洗涤层析柱；用(0. 025mol/ L磷酸二氢钠+0. 025mol/L磷酸氢二钠+2mol/L NaCl+15%丙二醇)缓冲液(ρΗ7· 2)洗涤层析柱；用(0. 025mol/L磷酸二氢钠+0. 025mol/L磷酸氢二钠)缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；用(0. 025mol/L 磷酸二氢钠 +0. 025mol/L 磷酸氢二钠 +2mol/L NaCl+50% 丙二醇)缓冲液(pH7. 2)洗脱层析柱，收集洗脱峰。
7
清洁超滤系统，并作去热原处理，用0. 02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 0)循环清洗超滤系统后，超滤浓缩AF-Blue柱收集液，并用0. 02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 0)充分置换。 层析结果如图2所示。3)0-8印1^1~086阴离子交换层析清洁Q-s印harose柱层析系统，并作去热原处理，依次按以下步骤进行用A相(0. 01mol/L磷酸二氢钠+0. 01mol/L磷酸氢二钠)缓冲液(ρΗ7· 0)平衡层析柱，重组人IFNi3-Ia蛋白不结合在阴离子交换柱上，而杂质结合在阴离子交换柱上，收集流穿组份；用A相(0. 01mol/L磷酸二氢钠+0. 01mol/L磷酸氢二钠)缓冲液(ρΗ7· 0)平衡层析柱；用B相(0. 01mol/L磷酸二氢钠+0. 01mol/L磷酸氢二钠+1. 0mol/L NaCl)缓冲液(PH7. 0)洗脱层析柱，收集洗脱峰。4^-8印118他6阳离子交换层析清洁CM-s印harose柱层析系统，并作去热原处理，依次按以下步骤进行用 0. 01mol/L磷酸二氢钠+0. 01mol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH6. 7)平衡层析柱；将收集的Q 层析柱流穿蛋白溶液，上样；用(O.Olmol/L磷酸二氢钠+O.Olmol/L磷酸氢二钠)缓冲液 (pH6. 7)平衡层析柱；设定层析系统梯度洗脱程序参数，15-20个柱体积洗脱层析柱，收集洗脱峰。5)超滤浓缩和缓冲液置换将收集的阳离子柱层析的蛋白溶液用O.Olmol/L醋酸钠缓冲液(pH3. 5)稀释，使用Millipore Pellicon超滤系统彻底置换缓冲液为0. 01mol/L醋酸钠(pH3. 5)。实施例3重组人IFN β -Ia纯化的纯化途径B本实施例包含两次离子交换的层析方法，优选先采用弱阳离子交换层析，后用强阴离子交换层析。其方法示意图如图1所示。材料与仪器Capto-Blue (GE healthcare 公司产品)，CM-sepharose FF 填料(GE healthcare 公司产品)，Q-s印harose FF填料(GE healthcare公司产品)。Pellicon 2超滤膜(截流分子量10K)，0· 5M2 (Millipore公司产品)，Pellicon超滤系统(Millipore公司产品)， Amicon 超滤离心管(Millipore 公司产品)，AKTA Purifier 层析系统(GE healthcare 公司广品)O实验方法1)上清液的浓缩清洁超滤系统，浓缩上清液，用0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7. 2)置换浓缩液。^Blue染料亲和层析清洁Capt0-Blue层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作用0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；上样后用0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；用(0. 05mol/L Tris-HCl+2mol/L NaCl)缓冲液(ρΗ7· 2)洗涤层析柱；用(0. 05mol/ L Tris-HCl+2mol/L NaCl+15 % 丙二醇)缓冲液(ρΗ7· 2)洗涤层析柱；用 0. 05mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；用(0. 05mol/L Tris-HCl+2mol/L NaCl+50%丙二醇)缓冲液(PH7.2)洗脱层析柱，收集洗脱峰。清洁超滤系统。Capto-Blue层析结果如图 2所示。
3乂11-8印1^1~086阳离子交换层析清洁CM-s印harose柱层析系统，并作去热原处理，依次按以下步骤进行用 0. 05mol/L Tris-HCl (pH6. 7)平衡层析柱，上样；用 0. 05mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH6. 7)平衡层析柱；设定层析系统梯度洗脱程序参数，15-20个柱体积洗脱层析柱，收集洗脱峰。4)0_8印1^1~086阴离子交换层析清洁Q-s印harose柱层析系统，并作去热原处理，依次按以下步骤进行用A相 0. 03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)平衡层析柱，重组人IFNi3-Ia蛋白不结合在阴离子交换柱上，而杂质结合在阴离子交换柱上，将上步的收集液上样，收集流穿组份；用A相 0. 03mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7. 0)平衡层析柱；用 B 相(0. 03mol/L Tris-HCl+1. Omo 1/ L NaCl)缓冲液(pH7.0)洗脱层析柱，收集洗脱峰。5)超滤浓缩和缓冲液置换将收集的阴离子柱层析的蛋白溶液用0. 01mol/L醋酸钠缓冲液(pH3. 5)稀释，使用Millipore Pellicon超滤系统彻底置换缓冲液为O.Olmol/L醋酸钠(pH3. 5)。实施例4重组人IFN β -Ia纯化的纯化途径C本实施例优选以抗体亲和层析样品之后，选择两次离子交换的层析方法先用强阴离子交换层析，后用弱阳离子交换层析。其方法示意图如图1所示。材料与仪器IFNβ 抗体亲和柱(自制)，CM-sepharose FF 填料(GE healthcare 公司产品)， Q-sepharose FF 填料(GE healthcare 公司产品)。Pellicon 2 超滤膜(截流分子量 10K)， 0. 5M2(Millipore公司产品)，Pellicon超滤系统(Millipore公司产品)，Amicon超滤离心管(Millipore公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GE healthcare公司产品)。实验方法1)上清液的浓缩清洁超滤系统，浓缩上清液，用0. 03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7. 2)置换浓缩液。2)抗体亲和层析利用重组人IFNii-Ia作为抗原免疫小鼠，构建分泌抗重组人IFN^-Ia单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过体外培养该细胞，或者将该细胞感染小鼠收获腹水，制备抗重组人 IFNi3-Ia单克隆抗体。将该抗体与kpharose 4B凝胶通过CNBr偶联制备获得用于特异性纯化重组人IFNii-Ia的亲和填料。将细胞培养浓缩液直接上样或者经过初步纯化后上样至亲和柱，目标蛋白结合于柱上，利用低PH缓冲液洗脱目标蛋白。3) CM-sepharose阳离子交换层析(同实施例3)4) Q-sepharose阴离子交换层析(同实施例3)5)超滤浓缩和缓冲液置换(同实施例3)实施例5重组人IFN β -Ia纯化的纯化途径D本实施例选择以AF-Blue染料亲和后，选择两次离子交换的层析方法先用强阳离子交换层析，后用弱阴离子交换层析。材料与仪器AF-Blue HC 650Μ 填料(T0S0H 公司产品)，SP-Sepharose (GE healthcare 公司产品)；DEAE-kpharose(Tosoh公司产品)。Pellicon 2超滤膜(截流分子量10K)，
90. 5M2(Millipore公司产品)，Pellicon超滤系统(Millipore公司产品)，Amicon超滤离心管(Millipore公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GE healthcare公司产品)。实验方法1)上清液的浓缩(同实施例2)2) AF-Blue染料亲和层析(同实施例2)3)SP-kpharose阳离子交换层析清洁SP-S印harose柱层析系统，并作去热原处理，依次按以下步骤进行用磷酸盐缓冲液平衡层析柱；将上一纯化步骤收集的蛋白溶液上样；用磷酸盐缓冲液平衡层析柱；设定层析系统梯度洗脱程序参数，洗脱层析柱，收集洗脱峰。4) DEAE-Sepharose 阴离子交换层析清洁DEAE-kpharose层析系统，并作去热原处理，将SP纯化产物经稀释降低电导率后上样，收集流穿组分。5)超滤浓缩和缓冲液置换(同实施例2)实施例6重组人IFN^-Ia蛋白的检测1)SDS-PAGE 检测将分离纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，通过实施例2与实施例3所获得目标蛋白、标准品(利比)以及蛋白质Marker的检测结果如图7所示，目标蛋白与标准品具有一致的分子量，并且该分子量符合文献[Goodin DS. Treatment of Multiple Sclerosis with Human Beta Interferon. The International MS Journal. 2005,12 :96-108] Pff^E, 约 22. ^D。2) ELISA 检测使用 Human IFN b ELISA kit(Pestka Biomedical Laboratories 公司产品)，检测过程按说明书进行。；3) RP-HPLC 法使用C4RP-HPLC柱子，4. 6謹X 25謹，NOBEL公司产品。其中，A相0. 磷酸；B相 80%乙腈，0. 磷酸。检测波长为214nm;流动相流速为lml/min，各时间段内所使用的流动组成相如下表1所示。通过实施例2所获得目标蛋白检测结果如图3所示，通过实施例 3所获得目标蛋白检测结果如图5所示，目标蛋白于11. Smin出峰。表1 RP-HPLC法测定纯化的IFN β -Ia蛋白
权利要求
1.一种重组人干扰素β-Ia的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法包括一次亲和层析过程与随后的两次离子交换层析过程，其中两次离子交换层析过程中，先进行强阴离子交换层析然后再进行弱阳离子交换层析。
2.根据权利要求1所述的重组人干扰素β"la的纯化方法，包括1)亲和层析细胞上清液浓缩处理后，平衡亲和层析柱后上样，再用洗脱液洗脱层析柱，收集洗脱峰；浓缩亲和层析收集液并置换缓冲液；2)强阴离子交换层析平衡阴离子层析柱；将上步的收集液上样，收集含有重组人干扰素β "la的流穿组份；3)弱阳离子交换层析平衡阳离子层析柱；将收集的阳离子层析柱流穿组分上样；用洗脱液洗脱层析柱，收集含有重组人干扰素β "la的组分。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，亲和层析过程中所用的亲和层析柱选自Blue染料亲和层析柱以及抗体亲和层析柱之一。
4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，强阴离子交换层析过程中所用的强阴离子交换层析柱为阴离子交换柱Q-sepharose。
5.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，阳离子交换层析过程中所用的弱阳离子交换层析柱为阳离子交换柱CM-sepharose。
6.一种重组人干扰素β-Ia的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法包括一次亲和层析过程与随后的两次离子交换层析过程，其中两次离子交换层析过程中，先进行弱阳离子交换层析然后再进行强阴离子交换层析。
7.根据权利要求6所述的重组人干扰素β-Ia的纯化方法，包括1)亲和层析细胞上清液浓缩处理后，平衡亲和层析柱后上样，再用洗脱液洗脱层析柱，收集洗脱峰；浓缩亲和层析柱收集液并置换缓冲液；2)弱阳离子交换层析平衡阳离子层析柱；将上步的收集液上样，洗脱液洗脱层析柱， 收集含有重组人干扰素β "la的组份；3)强阴离子交换层析平衡阴离子层析柱；将上步的收集液上样，并收集含有重组人干扰素β-Ia的流穿组份。
8.根据权利要求6或7所述的纯化方法，其特征在于，亲和层析过程中所用的亲和层析柱选自Blue染料亲和层析柱以及抗体亲和层析柱之一。
9.根据权利要求6或7所述的纯化方法，其特征在于，强阴离子交换层析过程中所用的强阴离子交换层析柱为阴离子交换柱Q-sepharose。
10.根据权利要求6或7所述的纯化方法，其特征在于，弱阳离子交换层析过程中所用的弱阳离子交换层析柱为阳离子交换柱CM-sepharose。
全文摘要
本发明公开了重组人干扰素β-1a的纯化方法，所述方法包括亲和层析、强阴离子交换层析、弱阳离子交换层析三个步骤。本发明亲和层析采用了Blue染料亲和层析与干扰素β抗体亲和层析，强阴离子交换层析采用了Q-sepharose层析柱，弱阳离子交换层析采用了CM-sepharose层析柱。本发明摒弃了影响蛋白活性较大的反相层析与金属螯合层析这些步骤，采用了两次离子交换层析，得到了高纯度、生物活性良好的重组人干扰素β-1a。
文档编号C07K1/22GK102219848SQ20111013629
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者应跃斌, 杨承刚, 潘晨晓, 王海彬, 白骅, 运雪莲 申请人:浙江海正药业股份有限公司