被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白的制作方法

专利名称：被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及被融合或插入到转铁蛋白分子上的治疗性蛋白或肽，其血清稳定性或体内循环半衰期被提高，转铁蛋白分子被修饰以减少或抑制糖基化、和/或减少或抑制铁结合和/或转铁蛋白受体结合。特别地，本发明包括被融合到或插入到转铁蛋白分子或被修饰的转铁蛋白分子上的单链抗体。
背景技术：
天然状态下的或者重组制备的治疗性蛋白或肽通常是不稳定的分子，具有短的血清稳定性周期或者短的体内循环半衰期。此外，当这些分子被配制特别是在水溶液中用于诊断和治疗目的时，通常是非常不稳定的。
只有极少数实用办法可以被用于延长或提高治疗性蛋白分子的体内或体外稳定性。聚乙二醇(PEG)是可以结合到蛋白质上的物质，从而使该蛋白质具有长期、持续的活性。如果蛋白质活性通过结合到PEG上被延长，那么就可以降低该蛋白质的施用频率。但是，PEG结合常常降低或破坏蛋白质的治疗活性。在有些情况下，PEG结合会降低蛋白质的免疫原性，而在其它情况下可能提高其免疫原性。
还可以通过融合到能够延长治疗性蛋白质的体内循环半衰期的蛋白质上来稳定治疗性蛋白质或肽。例如，与处于未被融合状态下的治疗性蛋白质相比，被融合到白蛋白或抗体片段上的治疗性蛋白质的体内循环半衰期被延长，参见美国专利5，876，969和 5，766，883。
另一种血清蛋白，糖基化的人转铁蛋白(Tf)也已经被用于与治疗性蛋白质一起融合，靶向呈递到细胞内部，或用于携带试剂跨越血脑屏障。通过将全长Tf融合到因子上， 这些包含被糖基化的人Tf的融合蛋白已经被用于靶向神经生长因子(NGF)或睫状神经营养因子(CNTF)跨越血脑屏障，参见美国专利5，672，683和5977，307。在这些融合蛋白中， 该分子的Tf部分被糖基化并结合两个铁原子，铁原子是Tf结合到细胞上的受体所需的， 并且如这些专利的发明人所述，Tf引导呈递NGF或CNTF部分跨越血脑屏障。已经通过将 HIV-I蛋白酶靶向序列插入到糖基化转铁蛋白的外露表面环上，研究制备通过Tf受体靶向呈递到细胞内部的另一种形式的Tf融合物的可能性，已经制备了转铁蛋白融合蛋白(Ali 等(1999) J. Biol. Chem. 274(34) :24066-24073)。
血清转铁蛋白(Tf)是分子量为80，000道尔顿的单聚糖蛋白，其在循环中结合铁，并通过转铁蛋白受体(TfR)将铁转运到各种组织中(Aisen等(1980)Ann. Rev. Biochem. 49 357-393 ；MacGiIlivray 等(1981) J. Biol. Chem. 258 :3543-3553,美国专利 5，026，651)。 Tf是最常见的血清分子之一，包含多达约5-10 %的总血清蛋白。在酗酒个体的血液中，存在高水平的缺乏糖的转铁蛋白，并且这种转铁蛋白的半衰期(约14-17天)比被糖基化的转铁蛋白(约 7-10 天)更长。参见 van Eijk 等(1983)Clin. Chim. Acta 132:167-171， Stibler (1991) Clin. Chem. 37 :2029-2037(1991)，Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1) :13-27 和 Stibler 等〃 Carbohydrate-deficient consumption" , Advances in the Biosciences, (Nordmann 等编辑)，Pergamon, 1988，71，353-357)。
Tf的结构已经被充分表征，受体结合、铁结合及释放以及碳酸铁的结合的机制已经被阐述(美国专利 5，026, 651,5, 986，067 和 MacGillivray 等(1983) J. Biol. Chem. 258(6) :3543-3546) 转铁蛋白和结合转铁蛋白受体的抗体也已经被用于呈递或携带毒性试剂到肿瘤细胞中，作为癌症治疗的方法(Baselga和Mendelsohn，1994)，而且转铁蛋白也被用作非病毒性基因治疗载体，将DNA呈递细胞中(Frank等1994 ；Wagner等1992)。使用转铁蛋白受体作为进入点来将蛋白质呈递到中枢神经系统(CNS)中的能力也已经用数种蛋白质和肽证明，包括CD4 (Walus等1996)、脑源神经营养因子(Pardridge等，1994)、神经胶质来源的神经营养因子(Albeck等)、肠道血管(vasointestinal)肽类似物(Bickel等，1993)、 β -淀粉状蛋白肽(Saito等，1995)，以及反义寡核苷酸(Pardridge等1995)。
但是，还没有修饰或遗传工程化转铁蛋白融合蛋白来延长治疗性蛋白或肽的体内循环半衰期，或者通过减少或抑制Tf部分的糖基化或者减少或防止铁和/或Tf受体的结合来提高生物利用度。
抗体及其结构 在血液或其它体液中循环的抗体被称作体液抗体，区别于被结合到其亲本淋巴细胞上的“膜抗体”。术语免疫球蛋白通常用于指所有抗体。在人体中，所有的免疫球蛋白被分成五种，称作IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。每个免疫球蛋白分子由两对相同的多肽链组成，称作重链或轻链。“重链”被命名为gamma(Y)、alpha(a)、mu(l·!)、delta(5)和 epsilon(e)。“轻链”命名为 Iambda(A)或 kappa (κ)。
天然存在的抗体由四条多肽链组成两条相同的重链和两条相同的轻链。每一条重链约50-70kDa，每一条轻链约25kDa。这些链通过二硫键连接在一起。抗体分子的基本结构具有字母Y的形状。Y的每一个臂由一条轻链和一条重链的部分组成，而Y茎部分由重链的剩余部分组成。Y的臂和茎通过铰链区连接在一起，铰链区使得臂能够活动。
抗体的茎和连接到茎的臂部分由免疫球蛋白的恒定区构成。这些区域具有保守的氨基酸序列，可变性低。臂的相反端是轻链的可变区和由100-110个氨基酸组成的重链，其中为三个小的非保守氨基酸序列区域或超变区。这些区域负责抗原识别和结合。
无论相连的重链的类型，所有轻链的区域结构是相同的。每条轻链具有两个区域， 八区和称作恒定轻链或Q的具有相对不变化的氨基酸序列的区域。相反，重链具有三个 (IgG、IgA、IgD)或四个(IgM、IgE)恒定区或C区，称作ChI, Ch2，Ch3和CH4，以及一个可变区，称作VH。可替代地，C区可以按照重链类型来命名；因此，Cε4是指IgE(ε)重链的Ch4 区。
各个可变轻链(Vl)和可变重链(Vh)区含有三个称作互补决定区(OTR)的超变区。 这些CDR组合在一起形成结合抗原的口袋。由于超变区中的氨基酸序列的可变性，结合位点的形状和特性是变化的，该位点结合抗原的特异性也是变化的。
通常，当抗原进入机体时，抗原的不同部分被不同的幼稚(Iiaive)B细胞识别。各种B细胞产生具有略微区别的结合位点的抗体。结果，生成抗体混合物。1977年，George Kohler和Cesar Milstein发现了一种获得大量具有相同亲合性的单一类型抗体的方法。 Kohler和Milstein用以制备单克隆抗体的方法包括将来自被免疫的动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，制备了大量无限增殖的杂交瘤，并选择生产期望抗体的杂交瘤。
单克隆抗体是重要的研究工具，被用作治疗剂。但是，单克隆抗体是昂贵的，并且难以制备。此外，单克隆抗体比较大，限制其到达靶向位点。
单链抗体 单链抗体(SCA)已经成为基础研究和应用研究的对象，在诊断和治疗应用中作为替代单克隆抗体的手段。SCA是遗传制备的蛋白质，具有单克隆抗体的结合特异性和亲合性，但是较小，使得具有更大的毛细血管渗透性。SCA优越于单克隆抗体的优点包括在诊断成像和治疗中具有更大的组织渗透性，免疫原性问题更少，在机体中更特异地定位于靶向位点，以及更容易和低成本的大量制备。
通常采用短肽接头连接抗体的Vh和\链的可变区来制备SCA。用于连接这些可变区的合适接头是使V1^nt区折叠成具有三维结构的单一多肽链的接头，该三维结构保持完整抗体的结合特异性。对于单链抗体结合蛋白的理论和制备方法的描述存在于Ladner 等，美国专利 4，946，778,5, 260，203,5, 455，030 和 5，518，889，以及 Huston 等，美国专利 5，091，513( “生物合成抗体结合位点”"(BABS))，这些公开在此全部引入作为参考。根据上面的专利所采用的方法制备的单链抗原结合蛋白具有与相应的Fab片段基本上相似的结合特异性和亲合性。
Fc 区 当抗体被暴露于蛋白质水解酶时，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，生成多种主要片段。保留抗原结合能力的片段由抗体的Y构象的两个“臂”构成，被称作Fab (抗原结合片段)或者Fab' 2, Fab' 2表示两个Fab臂通过二硫键连接。生成的其它主要片段组成Y 的单个“尾部”或中心轴，由于其容易从溶液结晶，被称作Fc (结晶片段)。IgG、IgA、IgM和 IgD的Fc片段由各种抗体的两个羧基末端区域的二聚体构成(即，IgG、IgA和IgD的CH2和 Ch3，以及IgM的Ch3和Ch4)。相反，IgE的Fc由其三个羧基末端的重链区构成(C ε 2，C ε 3 禾口 C ε 4)0 Fc片段由抗体生物学“活性位点”构成，该活性位点使得抗体能够与其它的免疫系统分子或细胞联系，从而激活或调节免疫系统的防御功能。当抗体区域中的活性位点结合到称作Fc受体的分子上时，发生这种联系。
Fc受体是与具有免疫球蛋白Fc区的分子活性位点高亲合性和特异性结合的分子。Fc受体可能作为完整的膜蛋白存在于细胞外质膜中，或者作为游离的“可溶的”分子存在，在血浆或其它体液中自由地循环。
五种抗体种类中的每一种具有多种类型的Fc受体，该受体结合到特定类型的Fc 区上，具有独特的功能。因此，IgE的Fc的受体仅与IgE Fc区或者分离的IgE Fc片段高亲合性地结合。已知存在特异于Fc受体的不同类型的种类，其识别和结合Fc区中的不同部位。例如，一些IgG Fc受体专一结合IgG的第二恒定区(Ch2)，而介导其它免疫功能的Fc 受体专一地结合IgG的第三恒定区(Ch3)。其它IgG Fc受体结合位于Ch2和CH3区的活性位点，不能结合单一的隔离的区域。
一旦被抗体Fc区活性位点激活，Fc受体介导各种主要的免疫杀伤和调节功能。某些IgG Fc受体，例如介导直接杀死抗体通过其Fab臂结合的细胞(抗体依赖的细胞调节细胞毒性--(ADCC))。当被IgG结合时，其它IgG Fc受体通过称作吞噬作用的过程，刺激一些白细胞参与和破坏细菌、病毒、癌细胞或其它实体。位于某些称作B淋巴细胞的白细胞上的 Fc受体调节细胞的生长，发育成分泌抗体的血浆细胞。当被抗原连接的IgE结合时，位于一些称作嗜碱细胞和肥大细胞的白细胞上的Fc受体起动过敏反应，表现为枯草热和哮喘。
一些可溶的Fc受体作为血液补体系统的一部分，起动能够杀死细菌、病毒和癌症细胞的炎症反应。其它Fc受体刺激某些白血球细胞分泌强有力的调节的或细胞毒性的分子，在遗传学上称作淋巴因子，淋巴因子有助于免疫防御。这些仅仅是抗体Fc受体调节的免疫活动的少数代表性例子。
组成抗体功能的氨基酸的大部分是决定抗体结构的分子“支架”(scaffolding)， 一种高度规则的三维形状。正是该支架具有正确暴露和空间朝向的抗体活性位点的重要功能，该位点由多个氨基酸簇构成。特定活性位点根据其功能，可能已经被暴露，因而能够结合分子受体。可替代地，特定的活性位点可能被隐藏，直到抗体结合到抗原上，而后支架改变其方向，并随即暴露抗体的活性位点。然后，被暴露的活性位点结合到细胞表面上或者作为可溶分子的部分(例如补体)的特异Fc受体上，接着起动特定免疫反应。
由于抗体支架的功能是保持和固定其活性位点，以结合到细胞或可溶分子上，当抗体活性位点作为肽被分离和合成时，具有完整的抗体分子的免疫调节功能。
取决于活性位点肽所结合的特定类型的Fc受体，该肽可能激活或抑制免疫功能。 如果Fc受体为被结合到Fc区的作用激活的类型时，可选择地，如果Fc活性位点肽刺激受体时，发生激活。产生的刺激的类型包括，但是不限于，直接起作用或者间接地受抗体Fc 区-Fc受体结合调节。这种功能的例子包括，但是不限于，由特定类型的白细胞(多核形嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)的吞噬作用激活；巨噬细胞活化；抗体依赖的细胞调节的细胞毒性(ADCC)；天然杀伤(NK)细胞作用；B细胞和T淋巴细胞的生长和发育，以及淋巴细胞分泌淋巴因子(具有杀伤和免疫调节活性的分子)。
发明_既述 如下文的更加详细的描述，本发明包括包含至少一种抗体或CDR片段，优选抗体可变区的被修饰的Tf融合蛋白，其中Tf部分被遗传工程改造来提高该分子的体内循环半衰期或生物利用度。本发明还包括包含融合蛋白的药物制剂和组合物，通过融合到被修饰的转铁蛋白上，提高抗体或CDR片段的体内循环半衰期和生物利用度的方法，编码被修饰的Tf融合蛋白的核酸分子等。本发明的另一个方面涉及用被修饰的Tf融合蛋白治疗患者的方法。
优选地，被修饰的Tf融合蛋白包含被修饰来减少或防止糖基化和/或铁和受体结合的人转铁蛋白Tf部分。
在一个方面，本发明提供包含被连接到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的SCA或⑶R片段的“转移体”(“trans-bodies”)。该转移体可以采用不同的抗体可变区来构建， 用于各种制药的和诊断的应用。
在另一个方面，本发明提供包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的一种或多种抗原性肽和抗体可变区的转移体。这些转移体不仅具有结合抗原的能力，而且能够在宿主中诱导免疫反应。本发明还提供包含一种或多种抗原结合肽的转移体。
而且，本发明的转移体包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的抗毒素的抗体。此外，本发明的转移体包含被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子上的⑶R。毒素的例子包括但是不限于肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、难辨梭菌 (Clostridium difficile)禾口炭Iil芽子包杆菌(Bacillusanthracis)。
附图简介 附

图1显示人(Hu)转铁蛋白(Tf)的N结构域和C结构域(SEQ ID NO 3的氨基酸1-331和332-679)的比对，相似和相同部分用高亮显示。
附图2A-2B显示来自不同物种的转铁蛋白序列之间的比对(SEQ IDNO 81-87)。淡阴影相似；浓阴影相同。
附图3显示治疗性蛋白、多肽或肽的大量Tf外露表面插入位点的位置。
附图4A-4B显示用于制备被修饰的融合蛋白的大量优选抗-TNF α的抗体的 Vh(SEQ ID NO 88-93)和 Vl(SEQ ID NO 94-44)。
附图5显示在存在50U/ml TNF α时，用N结构域(N-domain) /TNF CDR以及仅N 结构域处理WEHI-164细胞的吸收值。各个柱表示各个条件下的三个重复孔的平均值。较高的吸收值表示较高的代谢活性。
详细描述 总体描述 本发明部分地基于发明人发现可以通过将SCA遗传融合到转铁蛋白、被修饰的转铁蛋白，或转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的足以延长分子的体内半衰期的部分上来稳定抗体、抗体片段、CDR区和SCA，以提高它们的体内血清半衰期和/或活性。被修饰的转铁蛋白融合蛋白包括被共价连接到SCA抗体或抗体片段上的转铁蛋白或其结构域，其中与野生型转铁蛋白序列相比，转铁蛋白被修饰以含有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。在一个实施方案中，Tf融合蛋白被工程化来减少或防止Tf或Tf结构域中的糖基化。在另一个实施方案中，Tf蛋白或Tf结构域被修饰以显示减少或不结合铁或碳酸根离子，或者对Tf受体 (TfR)的亲合性降低或不结合Tf受体。
在一个实施方案中，本发明提供包含被融合或插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的抗体可变区的融合蛋白。特别地，本发明部分地基于使用转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白来连接至少两个抗体的可变区，形成被修饰形式的SCA。以这种方式形成的SCA融合蛋白能够结合目标抗原，并且具有转铁蛋白的长的循环半衰期。
通常，用短肽连接两个可变区来制备SCA。这种肽可以具有任何序列，通常主要是由于其三维结构而被选择，而不是其序列同源或生物学功能。但是，由于这种肽不是天然产物，会导致免疫反应。与短肽不同，转铁蛋白是一种天然存在蛋白质，不具有抗原性。采用转铁蛋白作为接头形成的SCA是一种转移体，即具有抗体活性的转铁蛋白。转移体在药学上是有用的，并且容易在微生物系统例如酵母中制备。此外，大而可溶的转铁蛋白主链有助于溶解和稳定连接在其上的可变区。转移体可以采用各种可变区来制备，被用于各种药学和诊断的应用。
因此，本发明包括转移体，包含转移体的治疗性组合物，以及通过施用转移体来治疗、预防或缓解疾病或症状的方法。本发明的转移体包括至少一个抗体可变区和至少一个被修饰的转铁蛋白的片段或变体，它们相互结合在一起，优选通过遗传融合(即，通过核酸翻译来生成转移体，其中编码抗体可变区的全部或部分的多核苷酸在读框内与编码被修饰的转铁蛋白的全部或部分的多核苷酸相连接)。在优选实施方案中，本发明提供包含抗体可变区的转移体，抗体可变区选自Vh、&或者一个或多个CDR区。一旦抗体可变区和转铁蛋白是转铁蛋白融合蛋白的一部分时，可以被称作转铁蛋白融合蛋白的“部分”、“区域”或“部分 (moiety)，，(例如“SCA或抗体可变区部分”或者“转铁蛋白部分”) 在一个实施方案中，本发明提供转移体，其包含或者可替代地由抗体可变区和转铁蛋白或者被修饰的转铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供转移体，其包含或者可替代地由生物活性的抗体可变区和转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白组成。在其它实施方案中，本发明提供转移体，其包含或者可替代地由抗体可变区例如人源化抗体可变区的生物活性和/或治疗活性变体与转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白组成。在另一个实施方案中，本发明提供一种包含抗体可变区以及被修饰的转铁蛋白的生物活性和/或治疗活性片段的转移体。
此外，本发明公开包含至少一个抗原性肽或免疫调节肽的转移体。这种转移体不仅能够结合其抗原，而且能够在宿主中诱导免疫反应。
除非另外定义，在此所用的所有科学技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然任何类似或等同于在此所描述的那些方法和材料的方法和材料可以被用于实施和验证本发明，优选的方法和材料被描述。
定义 如在此所用，术语“抗体可变区”包含一个或多个VH、Vl或⑶R区。
如在此所用，术语“转移体”是指具有抗体活性的转铁蛋白。优选地，转移体包含至少一个抗体可变区和转铁蛋白分子、被修饰的转铁蛋白或其片段。转移体还包含一种或多种能够在宿主中引起免疫反应的抗原性肽。
如在此所用，术语“抗体”是指由实质上由一种或多种由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda, alpha、gamma、delta、印silon和mu恒定区的基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链 MM^^J kappa Iambda0 Sljl^^ gamma> mu、alpha> delta epsilon, TSiilixiiJft^ 义免疫球蛋白的分类，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0 抗体可能以完整的免疫球蛋白存在，或者以各种形式的修饰物存在，包括例如， 仅含有轻链和重链可变区的Fv片段、含有可变区和部分恒定区的Fab或(Fab) ‘ 2片段、单链抗体(Bird 等，Science 242 :424-426(1988) ；Huston 等，Proc. Natl. Acad, ki. USA 85 :5879-5883(1988)都在此引入作为参考)，等等。抗体抗原可以是动物(特别是小鼠或大鼠)或者人类来源的，或者是嵌合的(Morrison等，Natl. Acad. Sci. USA81，6851-6855 (1984)在此引入作为参考)或者人源化的(Jones等，Nature 321，522-525 (1986)，和公开的英国专利申请#8707252，都在此引入作为参考)。如在此所用，术语“抗体”包括这些不同形式。
术语“抗体的单链可变片段”(scFv)或者“单链抗体”(SCA)用于此是指含有通过肽接头(L)被连接到Vh结构域上的八结构域的多肽，用八-L-Vh表示。可以颠倒八结构域和Vh结构域的顺序来获得称作为Vh-L-\的多肽。“结构域”或者“区域”是推定具有分散功能的蛋白质区段，例如具有抗原结合或抗原识别功能。
如在此所用，术语“多价单链抗体”是指通过肽接头共价连接的两个或多个单链抗体片段。可连接抗体片段来形成二价单链抗体，具有如下的\和Vh结构域的顺序 Vl-L-Vh-L-Vl-L-Vh ；Vl-L-Vh-L-Vh-L-Vl ；Vh-L-Vl-L-Vh-L-Vl ；或者 Vh-L-Vl-L-VL_L-Vh。单链多价抗体是三价或者更高价的，一个或多个抗体片段通过其它中间肽接头被连接到二价单链抗体上。在优选实施方案中，\和Vh结构域的数量是相同的。
如在此所用，“Fv”区是指含有可变重链(Vh)和可变轻链的单链抗体Fv区。 重链和轻链可以来源于相同的抗体，或者不同抗体从而产生嵌合的Fv区。
如在此所用，术语“超变区”是指抗体上负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或者“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(Ll)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)，和重链可变区的残基 31-35 (HI)、50-65 (H2)和 95-102 (H3) (Kabat
SM Wii^lJ (Sequences ofProteins of Immunological Interest) ,H 5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md. (1991))禾口/ 或那些来自“超变环”的残基(即轻链可变区中的残基26-32 (Li)、50-52 (U)和91-96 (L3)， 以及重链可变区中的残基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987))。“架构”(Framework)或“FR”残基是那些不同于在此定义的超变区残基的可变区的残基。
本领域熟知，抗体的互补决定区(CDRs)是主要决定抗体特异性的抗体部分。CDR 直接与抗原表位相互作用(参见，Clark, 1986 ；Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白的重链和轻链可变区中，存在由三个互补决定区(CDR1到CDR3)分开的四个架构区(FRl到FR4)。架构区(FRs)维持抗体结合部的三级结构，抗体结合部是抗体的一部分，参与与抗原的作用。 ⑶Rs，特别是⑶R3区，更特别为重链的⑶R3，使抗体产生特异性。由于这些⑶R区特别是 CDR3区使抗体具有抗原特异性，这些区域被插入到转移体上，使该单位具有相同的抗原特异性。
可以通过本领域已知的方法来确定用于合成本发明的转移体的CDR区的序列。重链可变区是通常长度为100-150个氨基酸范围的肽。轻链可变区是通常长度为80-130个氨基酸范围的肽。重链和轻链可变区中的CDR序列仅包括约3-25个氨基酸序列，容易由本领域技术人员测序确定。甚至可以通过商业来源合成这种肽，例如由kripps Protein and Nucleic Acids CoreSequencing Facility 合成(La Jolla Calif·)。
在其它实施方案中，CDR区或序列可以作为肽序列文库随机制备，用标准分析来筛选具有期望结合特性或功能特性的CDR区或序列。在一个物种中，不同轻链或重链的构架区的序列相对保守。如在此所用，“人架构区”是与天然的人免疫球蛋白的架构区实质上相同(约85%或更高，通常约90-95%或更高)的架构区。抗体的架构区是组成轻链和重链的组合架构区，起安置(position)和排列⑶R作用。
如在此所用，术语“结合结构域”是指如下的一种或组合(a)免疫球蛋白(IgG、 IgM或其它免疫球蛋白)的\区加;(b)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的 Vl区加\区；(c)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的Vh区加Vh区；(d)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的单一 \区；(e)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的单一 Vh区或者一个或多个CDR肽序列；或者(f)具有与CDR肽类似的抗原结合活性的肽。
如在此所用，术语“人源化的”是指非人的(例如鼠的)抗体的形式，是特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或者其它抗原结合亚序列)，含有来源于非人的免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化的抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的超变区的残基被具有期望特异性、亲合性和性能的来自非人物种(供体抗体)的超变区的残基取代，非人物质例如小鼠、大鼠或兔子。 在有些情形下，人免疫球蛋白的Fv架构区(FR)的残基被相应的非人的残基取代。而且，人源化的抗体可能包括存在于受体抗体或供体抗体的残基。进行这些修饰来进一步改进和优化抗体性能。总之，人源化抗体将包含实质上至少一个，和通常两个可变区的全部，其中全部或实质上全部超变区对应于非人类的免疫球蛋白的那些超变区，全部或者实质上全部FR 区是人免疫球蛋白的一致序列的那些FR区。人源化的抗体最佳地还包含至少一部分免疫球蛋白的恒定区或者结构域(Fe)，通常为人免疫球蛋白的Fc区。
如在此所用，术语“生物活性”是指治疗性分子、蛋白或肽，优选抗体可变片段或 CDR区，在生物学范围内(context)(在生物体中或其体外模拟物中)执行的功能或一整套的活性。生物活性可以包括但是不限于要求保护的融合蛋白的抗体部分的功能。如果本发明的融合蛋白或肽具有抗体的天然配对物(Counterpart)的一种或多种生物学活性，或者与被检测的转移体的体内或体外分析中具有可辨别的反应，则融合蛋白或肽被视为具有生物学活性。
如在此所用，转铁蛋白序列中的“相应氨基酸”或“等价氨基酸，，是通过比对来最大化第一条转铁蛋白序列和至少第二条转铁蛋白序列之间的相同性和相似性而确定的。用于在第二条序列中确定相当的氨基酸的编号是基于用于在第一条序列中确定相应氨基酸的编号。在某些情况下，这些短语被用于描述与兔血清转铁蛋白或者来自其它物种的转铁蛋白的特定氨基酸相对的人转铁蛋白中的氨基酸残基。
如在此所用，术语“Tf蛋白片段”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白部分”是指包含天然Tf 蛋白或其天然突变体的至少约5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %， 95%, 96%, 97%, 98%, 99%^； 100% 的氨基酸序列。
如在此所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的DNA的任何区段。因此，基因包括，但是不限于，编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还可以包括未被表达的DNA 片段，例如，构成其它蛋白的识别序列的DNA片段。基因可以从各种来源中获得，包括从目标来源中克隆得到，或从已知的或预测的序列信息中合成，而且包括具有期望参数的被设计的序列。
如在此所用，“异源多核苷酸”或“异源核酸”或“异源基因”或“异源序列，，或“外源的DNA区段”是指从特定宿主细胞之外的来源获得的多核苷酸、核酸或DNA区段，或者，如果来自相同来源，则被修饰以区别于其原始形式。宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞的内在的、但是被修饰的基因。因此，该术语是指细胞的外源或异源的、或者与细胞同源但是存在于该宿主细胞的核酸中的该元件通常不存在的位置上的DNA区段。作为例子，被连接到人Tf序列上的酵母细胞天然信号序列是异源的。
如在此所用，“被分离的”核酸序列是指基本上不含有其它核酸序列的核酸序列， 例如通过琼脂糖凝胶电泳确定至少约20%纯度，优选至少约40%纯度，更加优选至少约 60%纯度，甚至更加优选约80%纯度，最优选约90%纯度，和甚至最优选约95%纯度。例如，可以通过在遗传工程加工中将核酸序列从其天然位置重新定位到其将被复制的不同位置上的标准克隆操作来获得被分离的核酸序列。克隆操作可以包括切除和分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将该片段插入到载体分子上，和将重组载体插入到宿主细胞中，在宿主细胞中，核酸序列的多个拷贝或克隆被复制。核酸序列可以是基因组的、cDNA、 RNA、半合成来源的或它们的任何组合。
如在此所用，当DNA编码序列被翻译成多肽时，由于DNA编码序列之间的读框内融合，两条或多条编码序列被认为“被连接”或“被融合”。
如在此所用，当涉及Tf融合时，术语“融合”包括，但是不限于，至少一种治疗性蛋白、多肽或肽，优选抗体可变区，被连接到Tf的N末端，被连接到Tf的C末端，被插入到Tf 中的任何两个氨基酸之间，和/或替换一部分Tf序列，例如Tf环。
如在此所用，“被修饰的转铁蛋白”用于此来指与野生型转铁蛋白相比，氨基酸序列具有至少一种修饰的转铁蛋白分子。在优选实施方案中，“被修饰的转铁蛋白”是指被修饰的转铁蛋白，减少或无糖基化，降低或不结合铁或碳酸盐，以及降低或不结合转铁蛋白受体。
如在此所用，“被修饰的转铁蛋白融合蛋白，，被用于此是指通过将至少一个被修饰的转铁蛋白分子(或其片段或变体)融合到至少一个治疗性蛋白分子(或其片段或变体)， 优选抗体可变片段或CDR上形成的蛋白质。
如在此所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。除非特别限定，该术语包括含有与参比核酸具有类似结合特性的天然核苷酸的类似物的核酸，并且以与天然核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，特定核酸序列还含蓄地包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及被明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选择(或全部的)密码子的第三个位置用混合碱基和/或脱氧次黄苷残基取代的序列(Batzer等(1991) NucleicAcid Res. 19 :5081 ；Ohtsuka 等(1985)J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 ；Cassol 等 (1992) ；Rossolini 等(1994)Mol. Cell. Probes 8:91-98)。术语核酸与基因、cDNA 和由基因编码的mRNA互换使用。
如在此所用，当DNA区段与另一种DNA区段处于功能性关联时，被称作是“被可操作地连接的”。例如，信号序列的DNA以参与融合蛋白分泌的前蛋白(pr印rotein)被表达时，则其被可操作地连接到编码本发明的融合蛋白的DNA上；如果启动子或增强子刺激序列的转录，则被可操作地连接到编码序列上。一般地，被可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且在为信号序列或融合蛋白的情况下，为相邻的并在读框内。但是，增强子与转录被其所控制的编码序列可以不必是相邻的。在本文中，连接是通过在便利的限制性位点连接或在被插入到该位置上的连接物或接头上进行连接来完成。
如在此所用，术语“启动子”是指参与结合RNA聚合酶来起始转录的DNA的区域。
如在此所用，术语“重组体”是指已经用基因或DNA的新组合转化的细胞、组织或生物体。
如在此所用，靶向单位、蛋白质、多肽或肽是指特异地结合到特定细胞类型上[正常(例如，淋巴细胞)或异常例如(癌细胞)]的分子，因而可以被用于将转移体或化合物 (药物或细胞毒性剂)特异地靶向该细胞。
如在此所用，“治疗性蛋白质”是指包括(induce)蛋白质、多肽、SCA、抗体可变片段、CDR或肽或其片段或变体，具有一种或多种治疗性和/或生物学活性。术语肽、蛋白质和多肽在此被相互交换使用。此外，术语“治疗性蛋白质”是指治疗性蛋白质的内在的或天然的相关物(correlate)。“治疗活性”的多肽或具有“治疗活性的”蛋白质是指具有一种或多种已知的与治疗性蛋白质相关的生物学的和/或治疗性活性的多肽，治疗性蛋白质例如在此公开或本领域另外知晓的一种或多种治疗性蛋白质。作为非限制性例子，“治疗性蛋白质”是用于治疗、预防或缓解疾病、症状或紊乱的蛋白质。这种疾病、症状或紊乱可以是人或非人类动物患有的，例如兽医用途。
如在此所用，术语“转化”是指核酸(即核酸聚合物)转移到细胞中。如在此所用， 术语“遗传转化”是指DNA特别是重组DNA转移和结合到细胞中。
如在此所用，术语“转化体”是指已经转化的细胞、组织或生物体。
如在此所用，术语“转基因”是指以确保其功能的方式被插入到生物体、宿主细胞或载体中的核酸。
如在此所用，术语“转基因的”是指细胞、细胞培养物、生物体、细菌、真菌、动物、植物，它们的任何一种的后代，通过各种转化方法之一接受外源的或被修饰的基因，特别是编码被修饰的Tf融合蛋白质的基因，其中外源的或被修饰的基因来自与接受外源的或被修饰的基因的生物体种类相同或不同的种类。
“变体” (variants or variant)是指不同于参比核酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般地，变体大体上是非常相似的，并且在许多区域与参比核酸或多肽相同。如在此所用，“变体”是指本发明的转铁蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分，其序列区别于天然治疗性蛋白质，但是保留至少其一种本文别处或本领域另外知晓的功能的和/或治疗的特性。
如在此所用，术语“载体”泛指任何编码外源核酸的质粒、噬菌粒或病毒。该术语还被解释为包括非质粒、非噬菌粒和非病毒的化合物，其方便将核酸转移到病毒子或细胞中， 例如，多溶素化合物等。载体可以是适合作为将核酸或其突变体呈递给细胞的呈递媒介的病毒载体，或者该载体可以是适用于相同目的的非病毒载体。用于将DNA呈递给细胞和组织的病毒和非病毒载体的例子在本领域是熟知的，并且被描述在，例如Ma等(1997，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 94 :12744-12746)中。病毒载体的例子包括，但是不限于，重组病毒载体、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺伴随病毒、重组鸟痘病毒等(Cranage等1986， EMBO J. 5 :3057-3063 ； 1994年8月18日公开的国际专利申请WO 94/17810 ； 1994年10月 27日公开的国际专利申请W094/23744)。非病毒载体的例子包括，但是不限于，脂质体、DNA 的多胺衍生物等。
如在此所用，术语“野生型”是指天然存在的多核苷酸或多肽序列。
如在此所用，术语“毒素”是指生物学来源的有毒物质。
如在此所用，术语“免疫调节”是指在B细胞或T细胞水平上提高或降低抗原特异的免疫反应的能力。可以例如在T细胞增殖分析中，通过测定抗体生成、淋巴因子生成或T 细胞响应来检测免疫调节活性。特别地，除了影响T细胞反应，本发明的免疫调节多肽可能结合到B细胞表面的免疫球蛋白(即抗体)分子上，影响B细胞反应。
如在此所用，术语“免疫调节肽”是影响免疫反应的肽。
如在此所用，术语“Fe区”是指由恒定区组成的抗体分子的茎部。Fc区也被称作效应区。Fc区与免疫系统的其它组分相互作用，将存在细菌的信号转换为细胞反应。抗体的Fc区是在免疫反应过程中产生不同读出(readout)的重要区域。该区域由重链组成，在免疫反应过程中改变读出的方式将会改变抗体的Fc区的结构。通过改变恒定区，将改变抗体的类型。该过程被称作类别转换(class switching)，发生在B淋巴细胞中。
单链抗体和转移体 与常规抗体相比，单链抗体较小，可以极低的成本制备。单链抗体小，可能降低机体的免疫反应，从而提高治疗应用的安全性和效率。而且，单链抗体可以被加工成具有高度抗原性。
各种单链抗体(SCA)最初被发明来简化抗体筛选和生产。但是，由于个体小，会发生自凝聚，并且体内半衰期短，单链抗体被证明具有有限的治疗价值或者无治疗价值。将转铁蛋白添加到SCA上，显著地提高SCA的体内半衰期、稳定性，并且容易制备。
因此，来自SCA的组分可以被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的N末端、C末端或者N末端和C末端上(VpV1^P/或一个或多个CDR区)。还可以采用转铁蛋白的不同部分或结构域来进行这种融合，例如N结构域或C结构域。这些蛋白可以被直接融合或者采用各种长度的接头肽来融合。还可能将活性SCA的全部或部分融合在转铁蛋白的支架中。 在这种情况下，通过将SCA的cDNA插入到转铁蛋白的cDNA中，在细胞中生产融合蛋白。
在一个实施方案中，可以将两个Vh区或两个\区连接到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的两端，或者插入转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白中。在另一个实施方案中，可以将一个 Vh区或一个\区连接到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的两端，或者插入转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白中。通过接头(L)将可变区相互连接，然后融合或插入到转铁蛋白中。接头是被共价地连接到可变结构域上的分子，使得容易连接或插入到Tf上。总的来说，接头和Tf在两个结构域之间产生足够大的空间和灵活性，使得结构域能够形成一种构象，在该构象中， 结构域能够特异地结合其所定向的表位。此外，可以修饰转铁蛋白，使得连接到两个末端的可变区紧贴在一起。这种修饰包括，但是不限于，去除C末端脯氨酸和/或接近Tf的C末端的半胱氨酸环，产生更大的灵活性。
本发明还包括多价转移体。具有Vh-L-Vh顺序的抗体可变区可以被融合到转铁蛋白的一端，而具有\-L-Vj幌序的抗体可变区可以被融合到同一个转铁蛋白的另一端。本发明还包括形成多价SCA的可变区的其它序列。例子包括，但是不限于，Vh-L-I和八-L-Vh,以及具有更多可变区相互连接的那些序列。还可以将可变区和接头插入到转铁蛋白分子中。
可替代地，多价抗体的可变区可以通过将可变结构域插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子中来形成，而不使用任何非自然的肽接头。通过这种方式，转铁蛋白分子中作为接头的部分在可变结构域之间形成空间和灵活性。
在本发明的一个方面，可以将结合相同抗原的可变区融合到相同转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的不同末端。在本发明的另一个方面，结合不同抗原的可变区被融合到相同的转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白的不同末端。这种转移体能够连接两种不同抗原或者结合和/或激活两种不同的细胞。因此，本发明提供被融合到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白上的嵌合抗体可变区。此外，该可变区可以被插入到转铁蛋白或被修饰的转铁蛋白分子中。
本发明包括特异地结合期望多肽、肽或表位的转移体。如果1)转移体具有结合活性的阈值，和/或2)不会显著地与无关的多肽分子发生交叉反应，则转移体被确定是特异地结合。在某些情况下，如果转移体结合期望多肽、肽或表位的亲合性超过结合对照多肽的亲合性至少10倍，则转移体发生特异性结合。优选地，转移体具有IO6M-1或更高的结合亲合性(Ka)，优选为ΚΛΤ1或更高，更加优选为IO8M4或更高，最优选为IO9M4或更高。本发明的转移体的结合亲合性容易由本领域技术人员采用标准的抗体亲合性分析方法来确定， 例如 Scatchard 分析(Scatchard, G.，Ann. NY Acad. Sci. 51 :660-672,1949)。
在另一个实施方案中，如果转移体未显著地与无关多肽发生交叉反应，则被确定发生特异性结合。如果采用标准的Western印迹分析检测到期望的多肽、肽或表位，但是未检测到无关多肽，则转移体未显著地与无关多肽分子发生交叉反应。在有些情况下，无关多肽是orthologs，来自相同物种的蛋白质，是蛋白质家族的成员。
制备转移体的抗体可变区 将来自许多抗体的可变区转化成适合插入转铁蛋白来制备转移体的形式。包括抗 erbB2、B3、BR96、0VB3、抗转铁蛋白、Mik-β 1 和 PRl (分别参见 Batra 等，Mol. Cell. Biol. , 11 :2200-2205(1991) ；Batra 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :5867-5871 (1992)； Brinkmann 等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :8616-8620 (1991) ；Brinkmann φ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :547-551 (1993) ；Chaudhary 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :1066-1070(1990) ；Friedman 等’ Cancer Res. 53 :334-339 (1993) ；Kreitman 等’ J. Immunol.，149 :2810-2815(1992) ；Nicholls 等，J. Biol. Chem.，268 :5302-5308(1993)； 和 Wells 等，CancerRes. ,52 :6310-6317 (1992))。
典型地，Fv结构域选自本领域知晓的缩写为沈-10、MOPC 315、741F8、520C9、 McPC 603、Dl. 3、鼠 phOx、人 phOx、RFL3. 8sTCR、lA6、Sel55_4、18-2-3、4-4-20、7Α4_1、 B6. 2、CC49、3C2、2c、MA_15C5/K12G。、Ox 等的单克隆抗体(参见，Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883(1988) ；Huston, J. S.等，SIM News 38(4)(副刊) 11(1988) ；McCartney, J.等，ICSU Short Reports 10 :114(1990) ；Nedelman, Μ. Α.等， J. Nuclear Med. 32(副刊):1005(1991) ；Huston, J. S.等，分子设计与建模概念和应用 (Molecular Design and Modeling :Concepts and Applications), B 部，J. J. Langone ^m 辑，Methods in Enzymology 203:46-88(1991) ；Huston, J. S.等，单克隆抗体在临床肿瘤学中的应用的进展(Advances in the Applications ofMonoclonal Antibodies in Clinical Oncology) ,Epenetos, A. A.(编辑)，伦敦，Chapman & Hall (1993) ；Bird, R. Ε.等， Science 242:423-426(1988) ；Bedzyk, W. D.等，J. Biol. Chem. 265 :18615-18620 (1990)； Colcher, D. etal.，J. Nat. Cancer Inst. 82 :1191-1197 (1990) ；Gibbs, R. A. etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4001—4004(1991) ；Milenic, D. Ε. et al. , Cancer Research 51: 6363-6371 (1991) ；Pantoliano, Μ.W. et al. , Biochemistry 30:10117-10125(1991)；Chaudhary, V. K. etal.，Nature 339 :394-397 (1989) ；Chaudhary, V. K. etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1066-1070(1990) ；Batra, J. K. etal. ， Biochem. Biophys. Res. Comm. 171 :1-6(1990) ；Batra, J. K. etal.，J. Biol. Chem. 265 :15198-15202(1990)； Chaudhary, V. K. etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :9491-9494(1990) ；Batra, J. K.等， Mol. Cell. Biol. 11 :2200-2205(1991) ；Brinkmann, U.等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 88 8616-8620(1991) ；Seetharam, S.等，J. Biol. Chem. 266 :17376-17381 (1991) ；Brinkmann, U.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89:3075-3079(1992) ；Glockshuber, R.等，Biochemistry 29 :1362-1367(1990) ；Skerra, Α.等，Bio/Technol. 9 :273-278(1991) ；Pack, P.等， Biochemistry 31:1579-1534(1992) ；Clackson, Τ.等，Nature 352:624-628(1991); Marks, J. D.等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991) ; Iverson，B. L.等，Science 249 659-662(1990) ；Roberts, V. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6654-6658(1990)； Condra, J. H.等，J. Biol. Chem. 265 :2292-2295 (1990) ；Laroche, Y. J. Biol. Chem. 266 :16343-16349(1991) ；Holvoet, P.等，J. Biol. Chem. 266 :19717-19724(1991)； Anand, N. N.等，J. Biol. Chem. 266 :21874-21879 (1991) ；Fuchs, P.等，Bio/Technol. 9 1369-1372(1991) ；Breitling, F.等，Gene 104:104-153(1991) ；Seehaus, Τ.等，Gene 114 :235-237 (1992) ；Takkinen, K. Protein Engng. 4 :837-841 (1991) ；Dreher, Μ. L.等，J. Immunol. Methods 139:197-205(1991) ；Mottez, Ε. φ, Eur. J. Immunol. 21 467-471 (1991) ；Traunecker, Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :8646-8650 (1991)； Traunecker, Α.等，EMBO J. 10 :3655-3659(1991) ；Hoo, W. F. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :4759-4763(1993))。
表1提供各种单克隆抗体，其可变区和CDR可以用于制备转移体。
权利要求
1.包含被融合到至少一个抗体可变区上的转铁蛋白(Tf)的融合蛋白，其中相对于野生型Tf蛋白，该Tf蛋白的糖基化减少。
2.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区包含VH、\或⑶R区。
3.权利要求1的融合蛋白，包含至少两个抗体可变区。
4.权利要求3的融合蛋白，包含至少Vh和\区域、Vh和Vh区或\和八区。
5.权利要求1的融合蛋白，包含至少两个不同的抗体可变区。
6.权利要求5的融合蛋白，其中不同的抗体可变区特异地结合不同抗原。
7.权利要求3的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗体可变区非常接近。
8.权利要求7的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到两个邻近Tf环中。
9.权利要求8的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的C末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
10.权利要求8的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的N末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
11.权利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的脯氨酸残基被缺失或者用其它氨基酸取代。
12.权利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的半胱氨酸环被缺失。
13.权利要求8的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的N末端和C末端。
14.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区包含至少一个⑶R肽。
15.权利要求14的融合蛋白，其中CDR肽特异地结合抗原。
16.权利要求14的融合蛋白，其中CDR肽来源于抗体。
17.权利要求14的融合蛋白，其中CDR肽来源于肽文库。
18.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区特异地结合肿瘤坏死因子α(TNFa)0
19.权利要求14的融合蛋白，其中⑶R特异地结合TNF。
20.权利要求1的融合蛋白，其中至少一个抗体可变区包含抗体的￥11或\区的氨基末端结构域。
21.权利要求20的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含至少一个CDR。
22.权利要求21的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含3个CDRs。
23.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的C末端。
24.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的N末端。
25.权利要求1的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到Tf的至少一个环中。
26.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对转铁蛋白受体(TfR)的亲合性降低。
27.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳运铁蛋白(乳铁蛋白)。
28.权利要求沈的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合TfR。
29.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁离子的亲合性降低。
30.权利要求四的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合铁离子。
31.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含至少一个防止糖基化的突变。
32.权利要求31的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳运铁蛋白(乳铁蛋白)。
33.权利要求1的融合蛋白，在存在抑制糖基化的化合物时被表达。
34.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白的C结构域的一部分。
35.权利要求34的融合蛋白，其中桥连肽将抗体可变区连接到Tf上。
36.权利要求34的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到Tf蛋白的N和C结构域之间。
37.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf铰链区包含至少一个氨基酸取代、缺失或添力口。
38.权利要求37的融合蛋白，其中所述铰链区选自SEQID NO :3的约残基94到约残基96、SEQ ID NO 3的约残基M5到约残基M7、SEQ IDNO 3的约残基316到约残基318、 SEQ ID NO 3的约残基425到约残基427、SEQ ID NO 3的约残基581到约残基582，以及 SEQ ID NO 3的约残基652到约残基658。
39.权利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白基因在SEQID NO :3中的选自Asp 63、 Gly 65,Tyr 95、Tyrl88、Lys 206,His 207,His 249、Asp392、Tyr 426,Tyr 514,Tyr 517、 His 585,Thr 120,Arg 124,Ala 126、Glyl27、Thr 452,Arg 456、Ala 458 和 Gly 459 的位置上具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。
40.权利要求25的融合蛋白，其中抗体可变区取代至少一个Tf环。
41.权利要求31的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于氨基酸N413、N611的氨基酸残基。
42.权利要求沈或观的融合蛋白，其中Tf在SEQID NO :3中的对应于选自Asp 63、 Gly 65,Tyr 95、Tyrl88、Lys 206,His 207,His 249、Asp392、Tyr 426,Tyr 514,Tyr 517、 His 585,Thr 120,Arg 124,Ala 126、Glyl27、Thr 452,Arg 456、Ala 458 和 Gly 459 的氨基酸残基上包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加。
43.包含被融合到至少一个抗体可变区上的对转铁蛋白受体(TfR)的亲合性降低的转铁蛋白(Tf)的融合蛋白。
44.权利要求43的融合蛋白，包含至少两个抗体可变区。
45.权利要求44的融合蛋白，包含至少Vh和Vl区域、Vh和Vh区或Vl和Vl区。
46.权利要求43的融合蛋白，包含至少两个不同的抗体可变区。
47.权利要求46的融合蛋白，其中不同的抗体可变区特异地结合不同抗原。
48.权利要求44的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗体可变区十分接近。
49.权利要求48的融合蛋白，其中抗体可变区被插入到两个邻近的Tf环中。
50.权利要求49的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的C末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
51.权利要求49的融合蛋白，其中一个抗体可变区被融合到Tf的N末端，而一个抗体可变区被插入到邻近的Tf环中。
52.权利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的脯氨酸残基被缺失。
53.权利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的半胱氨酸环被缺失。
54.权利要求49的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf的N末端和C末端。
55.权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区包含至少一个⑶R肽。
56.权利要求55的融合蛋白，其中CDR肽特异地结合抗原。
57.权利要求55的融合蛋白，其中CDR肽来源于抗体。
58.权利要求55的融合蛋白，其中CDR肽来源于肽文库。
59.权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区特异地结合肿瘤坏死因子(TNF)。
60.权利要求55的融合蛋白，其中⑶R特异地结合TNFα。
61.权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区包含抗体的Vh或\区的氨基末端结构域。
62.权利要求61的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含至少一个CDR。
63.权利要求62的融合蛋白，其中氨基末端结构域包含3个CDR。
64.权利要求1或43的融合蛋白，其中抗体可变区的血清半衰期被延长，超过未被融合状态下的抗体可变区的血清半衰期。
65.权利要求43的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被融合到Tf的C末端。
66.权利要求43的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被融合到Tf的N末端。
67.权利要求43的融合蛋白，其中治疗性蛋白质或肽被插入到Tf的至少一个环中。
68.权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合TfR。
69.权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白对铁离子的亲合性降低。
70.权利要求69的融合蛋白，其中Tf蛋白不结合铁离子。
71.权利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白的糖基化减少或未糖基化。
72.权利要求71的融合蛋白，包含至少一个防止糖基化的突变。
73.权利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N结构域的一部分、桥连肽和Tf蛋白的C结构域的一部分。
74.权利要求73的融合蛋白，其中桥连肽将治疗性蛋白质或肽连接到Tf上。
75.权利要求73的融合蛋白，其中所述治疗性蛋白质、肽或多肽插入到Tf蛋白的N结构域和C结构域之间。
76.权利要求73的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf铰链区具有至少一个氨基酸取代、缺失或添力口。
77.权利要求76的融合蛋白，其中所述铰链区选自约残基94到约残基96、约残基245 到约残基M7、约残基316到约残基318、约残基425到约残基427、约残基581到约残基 582，以及约残基652到约残基658。
78.权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白选自Asp63、Gly 65、Tyr 95、Tyrl88、Lys 206,His 207,His 249,Asp 392,Tyr 426,Tyr 514,Tyr 517,His 585,Thr 120,Arg 124、 Ala 126,Gly 127,Thr 452,Arg 456,Ala 458和Gly 459的位置上具有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。
79.权利要求67的融合蛋白，其中治疗性蛋白或肽取代至少一个环。
80.权利要求71的融合蛋白，其中糖基化位点选自对应于氨基酸N413、N611的氨基酸残基。
81.编码权利要求1或43的融合蛋白的核酸分子。
82.包含权利要求81的核酸分子的载体。
83.包含权利要求82的载体的宿主细胞。
84.包含权利要求81的核酸分子的宿主细胞。
85.表达Tf融合蛋白的方法，包括在表达被编码的融合蛋白的条件下培养权利要求83 的宿主细胞。
86.表达Tf融合蛋白的方法，包括在表达被编码的融合蛋白的条件下培养权利要求84 的宿主细胞。
87.权利要求83的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
88.权利要求84的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
89.权利要求87的宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞。
90.权利要求88的宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞。
91.包含81的核酸分子的转基因动物。
92.制备Tf融合蛋白的方法，包括从权利要求91的转基因动物中分离融合蛋白。
93.权利要求92的方法，其中Tf融合蛋白包含乳铁蛋白。
94.权利要求93的方法，其中融合蛋白从来自转基因动物的生物液体中分离。
95.权利要求93的方法，其中液体是血清或乳汁。
96.治疗患者中的疾病或疾病症状的方法，包括施用权利要求1或权利要求43的融合蛋白的步骤。
97.权利要求1或权利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白在蛋白质的各端具有N末端结构域。
98.权利要求97的融合蛋白，其中抗体可变区被融合到Tf蛋白的各个N末端结构域中。
99.权利要求1或权利要求43的融合蛋白，其中抗体可变区特异性地结合毒素。
100.权利要求96的方法，其中抗体可变区结合TNF。
101.权利要求100的方法，其中该疾病选自脓毒性休克；内毒素性休克；与细菌感染、 病毒感染、寄生虫感染、瘤形成疾病相关的恶病质综合症；自体免疫性疾病、炎症性疾病、关节炎，以及与防止移植排斥的处理相关的副作用。
102.权利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白包含单一的N结构域。
103.权利要求9的融合蛋白，其中Tf中的一个或多个半胱氨酸被取代。
104.权利要求12a的融合蛋白，其中一个或多个半胱氨酸被丝氨酸取代。
105.权利要求33的融合蛋白，其中化合物是衣霉素。
106.权利要求1的融合蛋白，其中融合蛋白已经用酶处理来将部分或全部的糖类去糖基ο
107.权利要求25的融合蛋白，其中抗体可变区取代Tf环的一部分以及邻近Tf环的一部分。
全文摘要
本发明公开了转铁蛋白与治疗性蛋白或肽优选为抗体可变区的被修饰的融合蛋白，其血清半衰期或者血清稳定性被提高。优选的融合蛋白包括那些使转铁蛋白部分不发生或减少糖基化，结合铁离子和/或结合转铁蛋白受体的修饰。
文档编号C07K14/705GK102268094SQ201110175090
公开日2011年12月7日 申请日期2003年8月28日 优先权日2002年8月30日
发明者霍马扬.萨德吉, 克里斯托弗.P.普里奥尔, 安德鲁.特纳 申请人:比奥雷克西斯药物公司