一种抗病毒蛋白TRAIL_114-281及其制备方法

专利名称：一种抗病毒蛋白TRAIL_114-281及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗病毒蛋白TRAIL114_281及其制备方法，属于生物技术领域。背景介绍
艾滋病(AIDS, Acquired Immunodeficiency Syndrome)、非典(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome)、禽流感(Al，Avian hfluenza)等病的爆发和流行，不断向人们敲响警钟，人类与传染病的斗争是一个长期和持续的过程。为此，各国政界、业界、学界和科界人士都通过不同的思路、途径、策略等来研究和探讨对付这些传染病的方法。月中瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)又称凋亡素2配体(Apo2 ligand，Apo_2L)，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族的成员之一，可诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无杀伤作用。但在抗病毒方面关于TRAIL的研究不多，尤其是TRAIL是否对单纯疱疹病毒(HSV-1，DNA病毒) 和脊髓灰质炎病毒(PV，RNA病毒)有作用还没有相关研究。

发明内容
本发明目的在于提供一种抗病毒蛋白TRAIL114.，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，蛋白的分子量为MKD。本发明另一目的在于提供抗病毒蛋白TRAIL114_281制备方法，包括如下步骤
(1)TRAIL全基因的获得
提取Hela细胞的RNA，用逆转录PCR方法获得TRAIL部分基因，然后用套叠PCR方法补全TRAIL全基因；
(2)原核表达载体TRAIL114_281/pET-30a的构建
以上一步所得的TRAIL全基因为模板利用AfcoI和历'/^III位点设计引物，PCR扩增后获得TRAIL114_281基因并插入pET-30a载体中，得到原核表达载体TRAIL114_281/pET-30a ；
(3)重组表达载体TRAIL114_281/pET-30a的表达
在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达，IPTG诱导表达出正确的TRAIL114.蛋白，蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在，表达后使用镍离子亲和层析方法对可溶性的TRAIL114J1蛋白进行纯化，目的蛋白纯度达90%以上。TRAIL114.段蛋白位于TRAIL蛋白的胞外C端区，具有可溶性且是TRAIL的功能性部分，以TRAIL114_281段蛋白代替TRAIL蛋白具有操作方便，便于纯化等特点。本发明通过融合表达的TRAIL114^功能蛋白，经实验证实，对病毒HSV-I和PV无直接灭活作用，但可以干扰病毒向宿主细胞吸附，且经TRAIL114_281功能蛋白预处理的细胞， 可明显阻滞病毒产生细胞病变，同时还发现TRAIL114_281功能蛋白可有效地抑制病毒的增殖，但不影响子代病毒的释放。纯化后的TRAIL114J1功能蛋白以不同剂量在正常细胞KMB17中作用于病毒复制周期的各个阶段，结果显示TRAIL114_281功能蛋白对病毒HSV-I和PV均有明显的抗病毒作用， 且有剂量依赖性，但在RNA病毒和DNA病毒中却无明显差别，这为下一步探讨TRAIL抗病毒作用的机制奠定了基础。


图1是为获取TRAIL全基因的套叠PCR图。图2是TRAIL114_281/pET-30a/DH5 α菌落PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测图，泳道1 为DNA Marker (DL2000),泳道2为空白对照，泳道3为菌落PCR。图3是重组质粒TRAIL114_281/pET-30a的酶切鉴定电泳图，泳道1为重组质粒，泳道 2 为 DNA Marker (DL5000),泳道 3 为质粒 TRAIL114_281/pET_30a 经 AfcoI 单酶切，泳道 4 为质粒 TRAIL114_281/pET-30a 经 AfcoI 和历III双酶切，泳道 5 为质粒 TRAIL114_281/pET_30a 经 Hind III单酶切，泳道6为空载质粒pET-30a经Nco I和Hind III双酶切。图4是重组蛋白TRAIL114_281的SDS-PAGE检测图，泳道1为ftOtein Marker,泳道 2 为 pET-30a/BL21 诱导前，泳道 3 为 pET_30a/BL21 诱导后，泳道 4 为 TRAIL114_281/pET_30a/ BL21诱导前，泳道3为TRAIL114_281/pET-30a/BL21诱导后，目的蛋白大小为MKD。图5是重组蛋白TRAIL114^281免疫印迹电泳检测图，泳道1为Protein Marker, TRAIL114_281/pET-30a/BL21 诱导后。
具体实施例方式实施例1 TRAIL114_281蛋白的制备
大肠杆菌感受态的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶的消化、DNA片段的回收、 线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等均参照《分子克隆实验指南》 (黄培堂等译，第三版，科学出版社，2002 )相关章节进行。1、目的基因的获得
提取Hela细胞的RNA，用逆转录PCR获得TRAIL部分基因，后用套叠PCR方法补全 TRAIL基因(图1)。测序正确后，PCR获取TRAIL功能区即114-281段基因。2、重组质粒 TRAIL114_281/pET_30a 的构建 2. 1双酶切反应
用限制性内切酶Afco I和/Ziz7i/III消化原核表达载体pET-30a，获得线性化的载体片段， 具体步骤如下取3ug的质粒DNA与适量的水混勻，使其总体积为25ul，各加入两种限制性内切酶IOU及3ul相应的IOX限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混勻并离心，置最适反应温度水浴他，取3ul反应液进行琼脂糖凝胶电泳检查。完全酶切后，回收片段备用。2. 2连接反应
将获得TRAIL114.段蛋白基因片段定向插入到pET-30a载体中，获得TRAIL114./ pET-30a重组质粒。具体步骤如下取1. Oug回收的载体DNA加2_10倍摩尔量的外源DNA 片段，2ul IOX连接缓冲液加水定容至20ul，最后加入适量的T4 DNA连接酶，混勻后并瞬间离心以使液滴聚集管底，至16°C水浴过夜，取:3ul连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。最后挑取单个菌落，进行质粒提取和菌落PCR验证，结果如图2所示。2. 3重组质粒的鉴定将提取的质粒用PCR及双酶切(AfcoI + Λ /^ΙΙΙ)反应进行鉴定(图3)，获得正确的原核重组质粒 TRAIL114_281/pET-30a。3、TRAIL114_281蛋白的诱导表达
用空表达载体pET-30a作对照，与重组质粒同步转化表达宿主菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取4个转化单菌落，接种于aiil LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D_=0. 6^1. 0， 放入4°C冰箱放置4 6h。4°C 5000r/m离心5min收集菌体，用^il LB培养基重悬沉淀，取 0. Iml 混悬液接种 IOml LB 培养基(50ug/ml Kan), 37°C 200r/m 振荡培养 OD600=O. 6 1. 0， 加IPTG进行诱导表达，同时设置不同的温度、诱导时间、IPTG浓度，然后4°C 5000r/m离心 5min收集菌体。用1/10培养基体积lOmmol/L Tris · HCl (pH 8. 0)重悬菌体，分别取适量诱导表达菌体及其对照菌体，加等量2XSDS加样缓冲液(lOOmmol/L Tris · HCl pH 6.8、 4% SDS,0. 2%溴酚蓝、20%甘油、5%巯基乙醇)，100°C水浴^iin后，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察表达量，与空表达载体相比重组质粒经诱导后可见非常一条非常明显的大小约为MKD的条带。4、表达条件的优化
通过设置不同的表达参数，对表达条件进行了优化，具体实验如下 4. 1温度梯度实验
固定IPTG的诱导浓度为lmmol/L，诱导时间为6h，设温度梯度为16°C、观°C、37°C、 42°C，结果为在表达量最高。4.2 IPTG浓度梯度实验
固定温度为，诱导时间为6h，设IPTG浓度梯度为0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/ L、1. 0mmol/L、1. 2mmol/L,结果为在 1. Ommo 1/L 表达量最高。4. 3诱导时间梯度实验
固定温度为^°C，诱导浓度为1. 0mmol/L，诱导时间梯度为ai、4h、Mi、8h、10h、12h。5、目的蛋白的鉴定 5.1 SDS-PAGE凝胶电泳
诱导结束后，4°C 5000r/m离心5min收集菌体。用1/10培养基体积的lOmmol/L Tris · HCL(pH 8. 0)重悬菌体，以含质粒pET_30a的对照菌体和标准蛋白做对照，分别取适量样品加等量2X上样缓冲液，用微量移液器加入加样槽，以8V/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，以12V/cm电压电泳，溴酚蓝电泳至分离胶底部后，取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色或蛋白印迹，结果显示目的蛋白有大量表达(见图4)。5. 2 Western Blot 检测
SDS-PAGE凝胶电泳结束后，切出含待转移蛋白的凝胶，剪6张同样大小的Whatman 3mm 滤纸和一张PVDF膜，用软铅笔在PVDF膜一角做好标记。将它们悬浮于ddH20水平面上， 润湿后浸于水中5min，驱除膜上的气泡，在浸泡于转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris,0. 037% SDS，20%甲醇)中。在塑料支架上依次叠放浸湿的海绵、3层滤纸、凝胶、PVDF 膜、3层滤纸和海绵，使滤纸、凝胶和PVDF膜对齐，且各层之间无气泡存在；将塑料支架夹紧插入电泳槽中，PVDF膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，加转移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/ L Tris，0.037% SDS，20%甲醇)稍超过凝胶，以30疒:35V电压，4°C转移14 16h。转移完毕， 将PVDF膜浸于封闭液(5%脱脂奶粉或3% BSA，150 mmol/L NaCl, 0. 02% Tween-20)中约室温2h，以封闭无关蛋白结合位点，同时对凝胶进行染色，检查蛋白转移是否完全。封闭后， 用洗涤液(10mmol/L Tris · HCl pH7. 5,0. 15mol/L NaCl,0. 05% Tween-20)洗膜 3 次，每次5min ；将一抗(抗TRAIL的多克隆抗体)用抗体稀释液(0. 01mol/L TBS,1% BSA,0. 05% Tween-20)适当稀释，滴在保鲜膜上，然后将PVDF膜正面(吸附抗原面)向下覆盖在加抗体的保鲜膜上，室温反应池；用洗涤液洗膜3次，每次5min ；同样方法加酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，室温反应池；用洗涤液洗膜3次，每次5min ；膜稍干，加酶底物反应液进行反应(酶底物反应液配制Mmg DAB溶于IOml TTBS中，加5ul 30% H2O2混勻)， 结果见图5。
实施例2 TRAIL114^281蛋白的抗病毒实验 1、病毒滴度的确定
取制备好的毒株HSV-I和PV，做10倍系列稀释，ΙΟ"1至10_1(1。将各稀释度的毒株接种于KMB17细胞，各6个复孔，同时以BSA做为阴性对照。以TCID5tl表示病毒毒力。37°C培养3d后，观察细胞病变，以出现细胞病变的最高稀释倍数的倒数作为TCID5Q。用HSV-I和 PV感染KMB17细胞，获得携有HSV-I和PV的KMB17细胞感染株，按Reed-Muench法计算得 HSV-I的TCID50为10_6，PV的TCID50为10_7，本实验采用病毒的量为IOOTCID50o2、TRAIL114^281 对 KMB17 细胞的作用
采用96孔细胞培养板培养KMB17细胞，制成2 X IO5 / ml细胞悬液，每孔加入100 μ 1 细胞，于5% CO2培养箱37°C培养24h 48h后弃生长液，加约100 TCID5tl病毒液100 μ 1， 37°C吸附浊。吸出病毒液，加用维持液稀释的不同稀释度TRAILQOOyg / mlUOOyg / πι1、50μ g / ml、25 μ g / mlU2. 5 μ g / ml、6. 25 μ g / ml、3. 12 μ g / ml) 100 μ 1，置 5% CO2培养箱中37°C继续培养。7 后，当病毒对照细胞病变达75%以上，判断结果，以 Reed-Mueneh法计算TCID5tl或MTT法测A值。实验同时设细胞对照、药物对照、病毒对照及病毒TCID50的滴定。TRAIL114_281对KMB17细胞的增殖无明显作用，且对KMB17细胞毒性极低(TC50为0. 9g/L)，光镜下KMB17细胞形态无明显变化。3、TRAIL对病毒与细胞吸附的影响实验 3.1 TRAIL114_28Jf病毒的直接作用实验
取不同稀释度的TRAIL114^各100 μ 1分别与病毒原液100 μ 1混合于EP管中，37°C接触lh，同时以400 μ g/ml的BSA作为阴性对照。各管病毒依次10倍稀释，在KMB17细胞内滴定各管病毒TCID5tl，结果见表1。两种病毒的各管TCID5tl与阴性对照相同，说明TRAIL114_281 对两种病毒无直接作用。
表1 :TRAIL114_281对病毒直接作用的结果
权利要求
1.一种抗病毒蛋白TRAIL114_281，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白TRAIL114_281，其特征在于其分子量为MKD。
3.一种抗病毒蛋白TRAIL114_281的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)TRAIL全基因的获得提取Hela细胞的RNA，用逆转录PCR方法获得TRAIL部分基因，然后用套叠PCR方法补全TRAIL全基因；(2)原核表达载体TRAIL114_281/pET-30a的构建以第(1)步所得的TRAIL全基因为模板利用AfcoI和^ifli/III两个酶切位点设计引物，PCR扩增获得TRAIL114_281基因并插入pET-30a载体中，得到原核表达载体TRAIL114_281/ pET_30a ；(3)重组表达载体TRAIL114_281/pET-30a的表达在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达，IPTG诱导表达1肌11^114_281蛋白，表达后使用镍离子亲和层析的方法对可溶性的TRAIL114_281蛋白进行纯化，即得TRAIL114J1蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种抗病毒蛋白TRAIL114-281及其制备方法，TRAIL114-281蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，将TRAIL114-281基因插入pET-30a载体中构建重组表达载体TRAIL114-281/pET-30a，通过转化大肠杆菌BL21菌株，获得含TRAIL114-281基因的工程菌，最后通过诱导表达纯化获得纯度＞90％的TRAIL114-281蛋白，本发明的抗病毒蛋白TRAIL114-281具有良好的抗病毒活性，为治疗病毒感染提供了新的途径。
文档编号C07K14/525GK102329387SQ20111028535
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者周静炜, 季秀玲, 张琦, 林连兵, 王志, 魏云林 申请人:昆明理工大学