专利名称：一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉发酵乳制备的技术领域，具体涉及从酪蛋白酶解液分离得到的具有具有提高发酵液中多糖含量的生物活性单肽及其应用。
背景技术：
发酵乳是指在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的作用下，使用添加(或不添加) 乳粉(全脂或脱脂)的乳进行乳酸发酵而得到的凝固乳制品，最终产品中必须含有大量的活菌。乳酸菌的发酵作用可以使乳白蛋白变成微细的凝乳粒，易于消化吸收，发酵过程中乳酸菌可以产生机体营养所必需的维生素、烟酸和叶。发酵乳除了保留了牛奶的全部营养外， 其与鲜奶最显著的差异就是在于它还含有大量的乳酸及易于人体肠道健康的活性乳酸菌。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中形成的位于细胞壁外的粘液多糖或荚膜多糖，属于微生物胞外多糖的一种。乳酸菌胞外多糖对于发酵乳制品形成良好的质构特征起着十分重要的作用，由于乳酸菌保外多糖作为生物高分子的特性而能改善产品的流变学特性，增强产品的稳定性和持水能力，使有关产品生产中不添加或少添加增稠剂、乳化剂等添加物，并赋予产品良好的口感和风味。此外研究发现，乳酸菌胞外多糖还具有突出的生理功能，如抗肿瘤、调理肠道、免疫调节、抗致突变、细胞保护和降低血清胆固醇等。因此，通过在发酵乳中添加酪蛋白生物活性肽，有效地促进发酵乳发酵过程中胞外多糖的分泌和提高发酵液中多糖含量，对发酵乳行业具有重大的经济价值和现实意义。
发明内容
本发明提供一种有牛乳来源的、高安全性的、具有可产业化的酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种酪蛋白活性单肽的制备方法，包括如下步骤
(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解
液；
(2)当水解度达到9% 10%时，90 95°C加热15 20min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；
(3)将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。上述的制备方法中，步骤(3)中将灭酶活的酶解液在4°C下以6000 g离心20分钟， 将上清液经超滤，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用大孔树脂NKA-II，收集10-20% (w/w)乙醇洗脱液，接着采G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经kphadex G-25分离得到的活性的组分再经Cw高效液相色谱分离纯化，分离条件为5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集。由上述制备方法制得的具有提高发酵液中多糖含量的酪蛋白活性单肽。上述制得的酪蛋白活性单肽，通过液相色谱-电喷雾串联质谱测定其分子量为
3801. 4道尔顿，该活性单肽氨基酸序列为Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。上述酪蛋白活性单肽的应用，具体是将酪蛋白活性单肽与甘油混合应用于发酵乳发酵中，提高发酵液中多糖含量。所述应用中，以发酵乳总重计，酪蛋白活性单肽的添加量为0. 001%-0. 1% ；甘油添加量为0. 1%-2%。与现有技术相比，本发明采用了以上技术方案，具有如下优点和效果
1、本发明通过对酪蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了活性肽NPSKENL，该活性肽与甘油共同添加到发酵乳中，具有明显提高发酵乳中多糖含量作用。2、本发明分离纯化所得的生物活性肽是从酪蛋白中分离得到的乳源性肽，可以安全的添加的到酸乳中。
图1为实施方式中kphadex G-25对酪蛋白酶解液的初步分离图。图2为实施方式中RP-HPLC对生物活性肽的分离纯化图。图3为实施方式中添加生物活性单肽和甘油制备的发酵乳与空白对照中多糖含量的变化曲线。
具体实施方案下面结合附图和实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。实施例1 利用酪蛋白酶解液生产具有提高发酵液中多糖含量的生物活性单肽
1、可控酶解在50°c，pH 6. 0的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。2、酶解液灭酶90°C加热15min灭酶，终止酶解反应。3、将灭酶活的酶解液离心(6000 χ g，4°C ) 20分钟，将上清液经超滤(取分子量小于3000道尔顿的组分)后，采用大孔树脂NKA-II，收集10% (w/w)乙醇洗脱液，接着
采用kphadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图1所示。 经kphadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为5% (w/w)乙腈和95% (w/w)去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集， 如图2所示。实施例2 利用酪蛋白酶解液生产具有提高发酵液中多糖含量的生物活性单肽
1、可控酶解在55°C，pH 7. 5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。2、酶解液灭酶95°C加热20min灭酶，终止酶解反应。3、将灭酶活的酶解液离心(6000 χ g，4°C ) 20分钟，将上清液经超滤(取分子量小于3000道尔顿的组分)后，采用大孔树脂NKA-II，收集20% (w/w)乙醇洗脱液，接着
采用kphadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图1所示。 经kphadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为40% (w/w)乙腈和60% (w/w)去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图2所示。
实施例3 生物活性肽和甘油共用添加对发酵乳中多糖的影响
全脂奶粉100 g，蔗糖80 g，稳定剂3. 5 g混合均勻，加水至1000 g，55 60°C水化30min,经20 MPa均质后90 95 °C灭菌5 min,冷却后以0. 05%。(w/w)接种丹麦汉森 Yo-Flex (嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)，42°C发酵72 h，得空白发酵乳，测定发酵乳中多
糖含量。全脂奶粉100 g，蔗糖80 g，生物活性肽NPSKENL 0. 05 g，甘油1 g，稳定剂3.5 g混合均勻，加水至1000 g，55 60 °C水化30min，经20MPa均质后90 95 °C灭菌5 min, 冷却后以0.05 %。(w/w)接种丹麦汉森朴-Flex (嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)，42°C发酵72 h，得发酵乳，测定发酵乳中多糖含量。如图3所示，添加NPSKENL和甘油后发酵M h时发酵乳中多糖含量是空白样的 3. 3倍。这表明生物活性肽NPSKENL和甘油共用可明显提高发酵液中多糖含量，有助于提高发酵乳品质。
权利要求
1.一种酪蛋白活性单肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)在50°C 55°C，pH6. 0-7. 5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；(2)当水解度达到9% 10%时，90 95°C加热15 20min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；(3)将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中将灭酶活的酶解液在4°C下以6000 g离心20分钟，将上清液经超滤，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用大孔树脂 NKA-II,收集10-20% (w/w)乙醇洗脱液，接着采用kphadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经kphadex G-25分离得到的活性的组分再经Cw高效液相色谱分离纯化，分离条件为5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm， 按吸收峰顺序收集。
3.由权利要求1所述制备方法制得的具有提高发酵液中多糖含量的酪蛋白活性单肽。
4.根据权利要求3所述的酪蛋白活性单肽，其特征在于通过液相色谱-电喷雾串联质谱测定其分子量为801. 4道尔顿，该活性单肽氨基酸序列为 Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。
5.权利要求1所述的酪蛋白活性单肽的应用，其特征在于将酪蛋白活性单肽与甘油混合应用于发酵乳发酵中，提高发酵液中多糖含量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于以发酵乳总重计，酪蛋白活性单肽的添加量为 0. 001%-0. 1%。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于发酵乳总重计，甘油添加量为0.1%1%。
全文摘要
本发明提供一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用，制备方法包括在50℃～55℃，pH6.0-7.5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；当水解度达到9％～10％时，90～95℃加热15～20min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。本发明应用现代酶催化技术对酪蛋白进行酶解，利用生物分子分离纯化技术对具有提高发酵液中多糖含量的部分进行分离纯化，对纯化得到的活性单肽进行氨基酸序列分析。所得生物活性肽与甘油共同添加，可提高发酵液中多糖含量。
文档编号C07K1/36GK102352398SQ20111029295
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者崔春, 张清丽, 赵强忠, 赵谋明 申请人:华南理工大学