专利名称：一种高纯度环孢菌素a衍生物的制备方法
技术领域：
本发明属于工业微生物技术领域，涉及药品原料的制备方法，具体地说具体涉及到一种从发酵培养物中分离纯化环孢菌素A衍生物的制备方法。
背景技术：
环抱菌素A (CyclosporineA, CsA)是一种从丝状真菌(Tolypocladium inf latum)培养液中分离出的由11个氨基酸组成的环肽。从20世纪80年代CsA作为免疫抑制剂用于临床以来，在器官移植治疗中发挥了重大作用，奠定并推动了器官移植的发展。目前，全世界已有超过20万例的患者使用环孢菌素A作为器官移植时的抗排斥反应药物(陈代杰编。微生物药物学[M]。上海:华东理工大学出版社，1999，140)。此外，环孢菌素A还具有广泛的其它生物学活性如抗真菌、抗寄生虫、抗HIV、抗炎、逆转肿瘤细胞多药耐药等作用，但是，由于其存在比较严重的肝肾毒性以及溶解性差，治疗指数窄，生物利用度低等缺点影响了它在这些领域的进一步应用。人们开始尝试对其结构进行改造合成了一系列化合物，并从中寻找毒副作用低的免疫抑制剂或虽然无免疫抑制活性，但毒性低，具有其它生物学活性的衍生物(季新燕，温耀明，陈振伟等。环孢素的生物学活性及其衍生物的研究进展，国外医药抗生素分册，2006，27 (3): 116-121)。在4-和/或5-位氨基酸修饰的NM811和其它9种环孢菌素A衍生物，具有非免疫抑制活性，可用于HIV感染治疗和预防AIDS (EP04840281)。环孢菌素A衍生物，结构见附图6，是最近开发的另一类环孢菌素，即4位上的羟基衍生物，是用环孢菌素A为原料经过6-7步反应合成或用微生物氧化环孢菌素A而得到的。国际申请专利W00001715报道了在位置4上含有不同于亮氨酸的N-甲基化的或N-乙基化的疏水或中性氨基酸，这些化合物具有高效抑制HIV-1复制的能力(TetrahedronLett.41，2000，7193-6)和HCV诱导的丙型肝炎抑制作用(CN200480024604 [I].4)，而不具有Csk的免疫抑制活性，其中NIM811和DIB0025是具有该特性的最具代表的化合物。环孢菌素A衍生物是合成该类非免疫抑制化合物的重要中间体。化学法合成环孢菌素A衍生物反应步骤长(6-7步化学反应)，收率低(10%左右)。微生物氧化环孢菌素A得到环孢菌素A衍生物的收率很高，达到70 %以上，因此，用微生物发酵生产环环孢菌素A衍生物的成本优势十分明显。目前，用微生物发酵法制备环孢菌素A衍生物的文献及专利很少。韩国专利KR2005002764A报道了将环孢菌素A用DMSO溶解后，用Sebekia benihana进行生物转化，优化发酵培养条件，得到环孢菌素A衍生物代谢产物，然后用大孔树脂AmberliteXAD-16orAmberlite XAD-1180进行吸附。由于在生物转化环孢菌素A的过程中，除了目的产物外，还会有其他的环孢菌素A衍生物类似物。因此，仅仅用大孔树脂吸附而不进一步纯化，此专利方法步骤虽然简便，但产品含量较低，相关物质不能有效得到控制，得到的环孢菌素A衍生物纯度不高。韩国专利KR2004088593A也报道了该环孢菌素A衍生物的制备方法，先将转化菌Sebekia benihana用大豆粉等营养物质培养,将环孢菌素A用DMSO溶解后，加入到Sebekia benihana培养液中进行生物转化。该专利只涉及发酵培养,提高环孢菌素A的生物转化率，不涉及环孢菌素A衍生物的分离纯化过程。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，研究设计一种制备高纯度、高收率的环孢菌素A衍生物的制备工艺。本发明首次采用聚合物微球分离纯化发酵液粗提物，通过梯度解析，有效地去除了发酵代谢过程产生的杂质，得到高含量的环孢菌素A衍生物精粉，含量大于98.5 %，单杂小于1.0 %，总收率大于70 %，适于工业化规模生产高纯度环孢菌素A衍生物。下面对本发明进行具体描述:本发明的目的是这样实现的:在环孢菌素A衍生物发酵液中加入助滤剂，搅拌均匀，过滤，脱色，吸附、解吸、浓缩、结晶，得到粗提物；粗提物用极性溶剂溶解后上样至聚合物微球层析柱，使用水与极性溶剂的混合液梯度解析，收集环孢菌素A衍生物洗脱液，经浓缩、萃取、结晶、干燥，得到高含量环孢菌素A衍生物精粉。本发明所得环孢菌素A衍生物可供药品使用，最重要的是作为合成非免疫抑制化合物的重要中间体使用。环孢菌素A衍生物含量可达98.5%以上，单杂小于1%，样品回收率大于70%。
具体地，本发明涉及一种高纯度环孢菌素A衍生物的制备方法，包括下述步骤:I)常温条件下在环孢菌素A衍生物发酵液中加入助滤剂，搅拌50分钟-1.5小时至助滤剂分散均匀，过滤，固液分离得到环孢菌素A衍生物滤液；2)滤液使用大孔脱色树脂脱色；3)脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，饱和树脂用解吸剂解吸，得到解吸液；4)解吸液浓缩、结晶，固液分离得到环孢菌素A衍生物粗粉；5)将环孢菌素A衍生物粗粉用极性溶剂溶解，注入聚合物微球层析柱；6)使用极性溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，收集环孢菌素A衍生物洗脱液；7)洗脱液浓缩、萃取、结晶，固液分离得到环孢菌素A衍生物精粉。其中，步骤I)中调节发酵液中加入的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩，助滤剂用量为发酵液体积的0.01: 1-0.1: 1(克/升)，优选为
0.02: 1-0.04: 1(克/升)；搅拌时间为50分钟-1.5小时。步骤2)中的大孔脱色树脂为SD-2、LX-700、D290、D315、D301树脂，优选为SD-2或LX-700树脂。步骤3)中的大孔吸附树脂为D312、HZ816、XAD-1600、AB-8、HZ801、X-5树脂，优选为D312树脂及HZ816树脂，解吸剂为甲醇、丙酮或乙醇的水溶液，优选为乙醇的水溶液。步骤4)所述的浓缩、结晶，要求收集的解吸液在20°C _75°C条件下真空浓缩，优选为50-55°C，浓缩后结晶液浓度控制在100g/L-120g/L，得到环孢菌素A衍生物粗粉。步骤5)、6)所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的一种，各步骤使用的极性溶剂可不相同，步骤6)中梯度洗脱的极性溶剂所占比例可为20-90%，优选40-70%。步骤6)中使用的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及其衍生物制备的。步骤7)中所述的浓缩、萃取，要求解吸液浓缩后的体积为解吸液体积的1/8-1/12，浓缩液再加入0.5: 1-3: 1(升/升)的醋酸乙酯、二氯甲烷中的一种萃取，优选为醋酸乙酯，萃取剂加入量优选为1: 1-2: 1(升/升)。步骤7)所述的结晶，结晶析出溶剂可以是的正己烷或石油醚中的一种，优选为正己烷，析出溶剂加入量为2: 1-10: I结晶液体积(升/升)，优选为2: 1-10: 1(升/升)，结晶液过滤后真空干燥，得到白色的环孢菌素A衍生物纯品。本发明所得产品可供药品或药物中间体使用，环孢菌素A衍生物的HPLC含量大于
98.5%，样品提取总收率大于70%。本发明有如下优点:1.通过在发酵液中加入助滤剂，然后进行固液分离，可有效去除其中的菌丝体、未用完的培养基、杂蛋白和金属离子，提高了过滤速度，缩短了工艺周期，并得到澄清的滤液。2.大孔脱色树脂及吸附树脂的应用，去除了大部分色素和极性大的杂质，提高了滤液的澄清度和质量。3.解吸过程采用非连续梯度解吸法，低浓度的乙醇冲洗树脂柱可除去树脂吸附上的大部分多糖、色素和强极性杂质，之后采用高浓度的乙醇解吸，解吸液质量大副提高。4.首次使用聚合物微球层析，大幅度提高了产品纯度，降低了相关物质含量。5.工艺简洁，溶媒 消耗量少，溶媒易回收，样品收率高，全程总收率达到70%以上，提取成本低，适用于工业化生产。6.质量可控，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。
附图1:环孢菌素A衍生物的粗粉液相色谱图附图2:环孢菌素A衍生物的精粉液相色谱图附图3:环孢菌素A衍生物的ES1-MS图谱
附图4:环孢菌素A衍生物的13C-NMR图谱附图5:环孢菌素A衍生物的1H-NMR图谱附图6:环孢菌素A衍生物结构式
具体实施例下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。除非特别言明，本发明中所有百分比均为体积百分比。本发明所使用的环孢菌素A衍生物发酵液均为华北制药集团新药研究开发有限责任公司用微生物培养手段，得到的环孢菌素A衍生物发酵液。大孔树脂HZ816、HZ801、D290、D312，上海华震公司生产；大孔树脂D315、D301，安徽三星公司生产；大孔树脂SD-2，上海安澜德公司生产；LX-700、AB-8，西安蓝晓公司生产；XAD-1600、X_5，罗门哈斯公司生产；聚合物微球为苏州纳微科技公司生产，乙醇、甲醇等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。实施例1取环孢菌素A衍生物发酵液10L，发酵单位422 μ g/mL。在发酵液中加入200g珍珠岩，搅拌50分钟后板框过滤，滤液以l_2BV/h的流速通过大孔树脂SD-2柱进行脱色，脱色液以lBV/h的流速导入大孔树脂D312柱进行吸附富集，吸附后用40%乙醇/水溶液和95 %的乙醇/水溶液非连续梯度解吸，解吸流速控制在0.5BV/h，HPLC检测有环孢菌素A衍生物流出时开始收集解吸液，解吸完毕后，真空浓缩解吸液至环孢菌素A衍生物浓度IOOg/L-120g/L，缓慢降温到-5-0°C，结晶12小时，抽滤、洗涤、干燥，得到粗粉(见附图1)6.33g。粗粉加入甲醇7mL溶解，注入长度31cm，直径为2.6cm,PS30型聚合物微球装量为150mL的层析柱，使用30%浓度甲醇作为流动相洗涤20min，50%浓度甲醇作为流动相洗涤至环孢菌素A衍生物洗脱完毕，流速为200mL/h，根据HPLC检测结果收集洗脱液，50°C减压浓缩洗脱液至甲醇浓度小于5%，加入等体积乙酸乙酯萃取，静置分层，弃去水相，无水硫酸钠脱水；真空浓缩萃取液至环孢菌素A衍生物浓度为100g/L (体积约为30mL)，加入150mL正己烷，缓慢降温到2V -8 V，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，最后得到3.0Sg白色环孢菌素A衍生物精粉(见附图2-5)，收率为72.0%。精粉HPLC含量为98.7%，其中最大单杂<1.0%。实施例2取环孢菌素A衍生物发酵液100L，发酵单位457 μ g/mL。在发酵液中加入3Kg硅藻土，搅拌90分钟后板框过滤，滤液以1.5BV/h的流速通过大孔树脂LX-700柱进行脱色，脱色液以1.5BV/h的流速导入大孔树脂HZ816柱进行吸附富集，吸附后用40%乙醇/水溶液和95%的乙醇/水溶液非连续梯度解吸，解吸流速控制在0.5BV/h, HPLC检测有环孢菌素A衍生物流出时开始收集解吸液，解吸完毕后，真空浓缩解吸液至环孢菌素A衍生物浓度110g/L-120g/L,缓慢降温到-5- 0°C，结晶12小时，抽滤、洗涤、干燥，得到粗粉65.2g。粗粉加入乙醇60mL溶解，注入长度92cm，直径为4.9cm,PS30型聚合物微球装量为1500mL的层析柱，使用25%浓度乙醇作为流动相洗涤20min，45%浓度乙醇作为流动相洗涤至环孢菌素A衍生物洗脱完毕，流速为2000mL/h，根据HPLC检测结果收集洗脱液，50°C减压浓缩洗脱液至乙醇浓度小于5%，加入2倍体积二氯甲烷萃取，静置分层，弃去水相，无水硫酸钠脱水；真空浓缩萃取液至环孢菌素A衍生物浓度为110g/L(体积约300mL)，加入ISOOmL正己烧，缓慢降温到2V _8°C，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，最后得到32.58g白色环孢菌素A衍生物精粉，收率为70.5%。精粉HPLC含量为98.9%，其中最大单杂< 1.0%。实施例3取环孢菌素A衍生物发酵液1000L，发酵单位428 μ g/mL。在发酵液中加入40Kg珍珠岩，搅拌90分钟后板框过滤，滤液以1.5BV/h的流速通过大孔树脂SD-2柱进行脱色，脱色液以1.5BV/h的流速导入大孔树脂HZ816柱进行吸附富集，吸附后用40%乙醇/水溶液和95 %的乙醇/水溶液非连续梯度解吸，解吸流速控制在0.5BV/h-lBV/h，HPLC检测有环孢菌素A衍生物流出时开始收集解吸液，解吸完毕后，真空浓缩解吸液至环孢菌素A衍生物浓度110g/L-120g/L，缓慢降温到-5-0°C，结晶12小时，抽滤、洗涤、干燥，得到粗粉638.lg。粗粉加入丙酮700mL溶解，注入长度92cm，直径为10cm，PS30型聚合物微球装量为7200mL的层析柱，使用20%浓度丙酮作为流动相洗涤20min，40%浓度丙酮作为流动相洗涤至环孢菌素A衍生物洗脱完毕，流速为7000mL/h，根据HPLC检测结果收集洗脱液，50°C减压浓缩洗脱液至丙酮浓度小于5%，加入等体积乙酸乙酯萃取，静置分层，弃去水相，无水硫酸钠脱水；真空浓缩萃取液至环孢菌素A衍生物浓度为120g/L(体积约2500mL)，加入18L正己烧，缓慢降温到2V _8°C，结晶12小时，过滤、洗涤、干燥，最后得到327.27g白色环孢菌素A衍生物精粉，收率为75.7%。精粉HPLC含量为99.0%，其中最大单杂< 1.0%。
权利要求
1.一种高纯度环孢菌素A衍生物的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤: 1)在常温条件下在环孢菌素A衍生物发酵液中加入助滤剂，搅拌50分钟-1.5小时至助滤剂分散均匀，过滤，固液分离得到环孢菌素A衍生物滤液； 2)滤液使用大孔脱色树脂脱色； 3)脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，饱和树脂用解吸剂解吸，得到解吸液； 4)解吸液浓缩、结晶，固液分离得到环孢菌素A衍生物粗粉； 5)将环孢菌素A衍生物粗粉用极性溶剂溶解，注入聚合物微球层析柱； 6)使用极性溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，收集环孢菌素A衍生物洗脱液； 7)洗脱液浓缩、萃取、结晶，固液分离得到环孢菌素A衍生物精粉。
2.根据权利要求1所述，环孢菌素A衍生物指的是(Y-hydroxylmethylleucine4)_cyclosporin A。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，助滤剂的用量为每升发酵液加入助滤剂0.01-0.1千克。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)所述大孔脱色树脂为SD-2、LX-700、D290、D315、·D301 树脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤3)所述的大孔吸附树脂为D312、HZ816、XAD-1600、AB-8、HZ801、X-5树脂，优选为D312树脂或HZ816树脂，解吸剂为甲醇、丙酮或乙醇的水溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤4)所述的浓缩、结晶，要求解吸液在200C _75°C条件下真空浓缩，浓缩后结晶液浓度控制在100g/L-120g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤5)或6)所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的一种，各步骤使用的极性溶剂可不相同，步骤6)所述梯度洗脱中极性溶剂所占比例可为20-90%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤5)所述聚合物微球是采用聚苯乙烯或聚丙烯酸酯及其衍生物制备的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤7)所述的浓缩、萃取，要求浓缩后的体积为解吸液体积的1/8-1/12，再加入浓缩液体积1/2-3倍的醋酸乙酯或二氯甲烷萃取。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤7)所述的结晶，要求萃取液浓缩后浓度控制在120g/L-150g/L，然后缓慢加入2-10倍结晶液体积的正己烷或石油醚，结晶液过滤后真空干燥，得到白色的环孢菌素A衍生物纯品。
全文摘要
本发明公开了一种利用丝状真菌(Tolypocladium inflatum)发酵培养物制备环孢菌素A衍生物的方法。该方法包括使用助滤剂，经过过滤、脱色、吸附、结晶等步骤，得到环孢菌素A衍生物的粗提物，再借助聚合物微球对粗提物进行层析分离，得到高纯度的环孢菌素A衍生物产品。本发明的优点在于采用大孔树脂提取分离环孢菌素A衍生物，工艺简单易行，适宜于工业化规模生产；并首次将聚合物微球用于该产品的层析分离，可以制备高纯度的环孢菌素A衍生物产品。
文档编号C07K7/64GK103073624SQ20111032880
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者张雪霞, 董爱华, 任风芝, 李晓露, 李宁, 陈书红, 成晓迅, 林毅, 王海燕, 李丽红, 张金娟, 林旸, 张丽, 张艳立, 高月麒, 张艳哲, 蒋沁, 段宝玲 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司