专利名称：赭曲霉毒素a杂交瘤细胞株和抗体与复合免疫吸附剂和免疫亲和柱与试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂交瘤细胞株、由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体及其应用，由该抗体制得的免疫吸附剂，以及装有该免疫吸附剂的免疫亲和柱和试剂盒，及其它们在纯化黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中的应用。
背景技术：
黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组结构类似的次生代谢产物，是一组以二吠喃香豆素为基本结构的化合物。目前已分离鉴定出12种，尤其是黄曲霉毒素B1,B2,GijG2^M1和M2为强污染物质，广泛存在于粮食谷物和饲料及其加工品中，在目前已知的两百多种真菌毒素中毒性最强、污染频率最高。黄曲霉毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用。黄曲霉毒素作用的靶器官主要是肝脏，被公认为致肝癌物质，即使食用含有低水平的黄曲霉毒素食物，长期食用的人其肝脏也将受到损害。国际癌症中心将其定为一类致癌剂。杂色曲霉素是由杂色曲霉、构巢曲霉等产生的一种具有致癌性的真菌毒素，在化学结构上属于黄曲霉毒素前体物质，可与DNA形成加合物。杂色曲霉素产生菌及杂色曲霉素在世界各地粮食及饲料中的污染很常见。国内学者研究发现，我国各地粮食中杂色曲霉素的污染非常普遍，其中以小麦最明显，污染率最高可达100%。杂色曲霉素可能与胃癌、肝痛的发生密切相关。赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一种霉菌肾毒素,可分为A和B两种类型，赭曲霉毒素A的毒性较大。赭曲霉毒素在4°C的低温下赭曲霉即可产生具有毒害作用浓度的赭曲霉毒素。动物摄入Ippm体重剂量的赭曲霉毒素A可在5-6天致死。常见的病变是肾小管上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死。饲喂含Ippm浓度赭曲霉毒素的日粮3个月可引起动物烦渴、尿频、生长迟缓和饲料利用率降低；饲喂含量低至200ppb的日粮数周可检测到肾损伤。其他的临床症状还有腹泻、厌食和脱水。有时临床症状不明显，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地区，动物在屠宰时惟一可观察到的病变是肾苍白、坚硬。目前，黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法(ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和层析-荧光光度法等。其中，薄层层析法要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联免疫法，只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。而免疫亲和层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中的黄曲霉毒素的含量。由于该方法灵敏特异，而且不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷等，应用越来越广泛。免疫亲和层析方法的关键在于选择一种高效特异的抗体，但是，利用现有技术中的液液提取、固相萃取、加热蒸发浓缩等方法的添加回收率均较低，对后续的检测步骤造成很强的基质效应，并且现有技术中没有能够同时纯化待处理基质中6种黄曲霉毒素(BpB2、Gp G2, M1和M2)、杂色曲霉 素和和赭曲霉毒素A的免疫吸附介质，而能够同时纯化分析多种病毒素显然能够提高检测的效率。
因此，当务之急，是要制备出性能稳定、特异的免疫吸附剂，并建立一种经济、快捷、精确、安全，并且能同时纯化6种黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株、由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，由该抗体制得的免疫吸附剂及其在纯化和检测赭曲霉毒素A中的应用，以及装有该免疫吸附剂的免疫亲和柱(IAC)和试剂盒，及其它们在纯化以及检测黄曲霉毒素B2、Gp G2、MpM2、杂色曲霉素和赫曲霉毒素A中的应用，以及具体提供一种纯化黄曲霉毒素B1' B2> G1^ G2>M1, M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法和一种检测黄曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。本发明的第一方面是提供一种杂交瘤细胞株CGMCC N0.5505。该杂交瘤细胞株已于2011年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明的第二方面是提供由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体为抗赭曲霉毒素A的抗体。
本发明的第三方面是提供上述单克隆抗体在纯化和检测赭曲霉毒素A中的应用。本发明的第四方面是提供一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为上述单克隆抗体和由杂交瘤细胞株CGMCCN0.5506分泌得到的单克隆抗体。本发明的第五方面是提供一种装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。本发明的第六方面是提供一种含有上述免疫吸附剂或上述免疫亲和柱的试剂盒；优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS缓冲液。本发明的第七方面是提供上述免疫吸附剂、上述免疫亲和柱、或上述试剂盒在纯化以及检测黄曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中至少一种中的应用。本发明的第八方面是提供一种纯化黄曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，使含有黄曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品通过上述免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分黄曲霉毒素Bp B2、Gp G2、MpM2、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B2、Gp G2、M1, M2、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。本发明的第九方面是提供一种检测黄曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法,该方法包括，⑴根据上述纯化黄曲霉毒素GyMp M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，得到待测液，所述待测液为用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来而得到的溶液；(2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。本发明通过开发出性能稳定、特异的单克隆抗体，实现了对6种黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的同时纯化和检测。由实施例的结果可以看出，对牛奶样品和饲料样品的检测中,添加回收率都在70-110%之间，RSD均小于6%。表明本发明的方法完全满足对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、Mp M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A纯化和检测的分析要求。
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式
一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:图1为黄曲霉毒素B1'B2、G1'G2、M1和M2标准品的液相色谱图；图2为杂色曲霉素标准品的液相色谱图；图3为赭曲霉毒素A标准品的液相色谱图。
具体实施例方式本发明提供一种杂交瘤细胞株OTA-El 1B8CGMCC N0.5505。该杂交瘤细胞株已于2011年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，分类命名为抗赭曲霉毒素A单克隆抗体细胞株。本发明还提供由上述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体为抗赭曲霉毒素A的抗体。本发 明的上述单克隆抗体可应用于纯化和检测赭曲霉毒素A。本发明中上述杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方法。S卩，首先将赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联，制备作为免疫原，然后将该免疫原对小鼠进行免疫，通过将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合和杂交瘤细胞克隆化筛选得到所需的杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆抗体。其中，所述载体蛋白可以为牛血清蛋白或卵清蛋白。所述免疫原与载体蛋白的相对用量可以为本领域常规选择，例如，所述免疫原与载体蛋白的摩尔比为5-8: I。具体地，本发明中的杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以包括以下步骤:(I)制备赭曲霉毒素A免疫原将2mg赭曲霉毒素A (OTA)加入到500 μ L丙酮中，加入4mg CDI，得到第一溶液。将8mg BSA加入到3mL 0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液中，得到BSA溶液。把第一溶液慢慢滴加到BSA溶液中，室温反应2天,反应后溶液在4°C条件下,用PBS溶液透析3天。(2)制备杂交瘤细胞和抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体动物免疫:免疫动物为6-8周龄左右的雌性BALB/c小鼠。用赭曲霉毒素A免疫原免疫5只小鼠。取适量赭曲霉毒素A免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余均为腹腔注射。免疫结束后处死小鼠，取脾细胞。细胞融合:将脾细胞和杂交瘤细胞按照10: I的比例进行细胞融合试验。杂交瘤细胞克隆化:采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对赭曲霉毒素A有很好的特异性反应的细胞。最后筛选出分泌赭曲霉毒素A抗体的杂交瘤细胞CGMCCN0.5505，制备出单克隆抗体。本发明提供一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为上述单克隆抗体(抗体A)和由杂交瘤细胞株Afla-D12A1CGMCC N0.5506 (该杂交瘤细胞株已于2011年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，分类命名为抗杂色曲霉素黄曲霉毒素单克隆抗体细胞株)分泌得到的单克隆抗体(抗体B)。其中，抗体B为抗黄曲霉毒素B2、Gp G2、M1, M2,和杂色曲霉素中至少一种的抗体。本发明中的杂交瘤细胞株CGMCC N0.5506和抗体B的制备方法可以为本领域常规的制备方法。即，首先将黄曲霉毒素半抗原与载体蛋白偶联，制备作为免疫原，然后将该免疫原对小鼠进行免疫，通过将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合和杂交瘤细胞克隆化筛选得到所需的杂交瘤细胞株以及由其分泌的单克隆抗体。其中，所述载体蛋白可以为牛血清蛋白或卵清蛋白。所述免疫原与载体蛋白的相对用量可以为本领域常规选择，例如，所述免疫原与载体蛋白的摩尔比为5-8: I。具体地，本发明中的杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法可以包括以下步骤:(I)制备黄曲霉毒素免疫原将4mg黄曲霉毒素B1溶于2mL丙酮中，加入40yL 10%的H2SO4，在56°C搅拌反应4h，将反应所得产物蒸干后，加入5mL H2O,用25mL氯仿提取两次，然后用20mL H2O洗涤有机层，保留有机层，蒸去有机溶剂，得到黄色固体产物。取1.0mg黄色固体产物，向其中加入2mL 0.5%的BSA溶液(4mL PBS中溶解20mgBSA)，在 37°C 下反应 30min ;加入 100 μ L 6.5mM 的 NaHB4,在 4°C 反应 30min ;加入 50 μ L0.1N的HC1，除去过量的NaHB4。在4°C条件下，用PBS溶液透析3天，制得免疫原，即黄曲霉毒素 B1-BSA(Aflatc)Xin B1-BSA)。本发明中，所述固相载体可以为本领域常规的各种适用于与抗体进行偶联的固相载体，包括但不限于纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶中的至少一种，优选为溴化氰(CNBr)活化的琼脂糖凝胶；所述琼脂糖凝胶的浓度可以为常规的各种选择，如4%。该CNBr活化的琼脂糖凝胶可以以干粉形式商购获得，如购自美国GE公司，使用时，加入酸溶液进行溶胀即可，该酸处理方法已为本领域技术人员公知，在此不再赘述。当使用冻干形式并含有添加剂的CNBr活化的琼脂糖凝胶时，优选在低PH值(如pH值为2-3)的条件下洗去添加剂，然后再与抗体进行偶联。所述将抗体A和抗体B与固相载体偶联的方法可以为本领域常规的方法，具体地，该方法可包括:(I)用偶联缓冲液溶解抗体，所述抗体为抗体A和抗体B，得到第一抗体溶液，(2)使所述第一抗体溶液与活化的固相载体接触进行偶联，得到偶联液，(3)将偶联液中偶联后的固相载体转移至浓度为0.05-1M的Tris-HCl缓冲液中静置，以封闭偶联液中偶联后的固相载体上的残留活性位点，(4)用洗涤液洗涤静置后的固相载体，以去除未偶联的抗体，得到洗涤后的固相载体，(5)用含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS缓冲液清洗洗涤后的固相载体。本发明对所述抗体和固相载体的用量比例以及抗体A和抗体B的相对用量没有特别的限定，一般地，使所述抗体与固相载体尽可能饱和偶联，因此，所述抗体一般过量于固相载体。但是，本领域技术人员也可以根据需要选择抗体与固相载体的用量比。本发明中，所述抗体A、抗体B与固相载体的重量比优选为1: 0.2-5: 5-10。本发明中所述偶联缓冲液可以为本领域常规的各种选择，如0.1-0.3M的NaHCO3溶液，PH值可以为8-8.5。偶联条件和偶联方法可以为常规的选择，如，可以在4_25°C条件下，采用翻转式(end-over-end)的方法将抗体与固相载体充分均勻混合1_24小时。所述封闭和除去未偶联的抗体的方法也可以为本领域的常规方法。其中，所述在0.05-1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中静置的条件可以为，在4_25°C下，静置2_4小时。所述用洗涤液洗涤静置后的固相载体中的洗涤液可以为低、高两种PH值的缓冲液(如pH4.0的醋酸盐缓冲液和PH8.0的Tris-HCl缓冲液)，所述洗涤的条件只要使得未偶联的抗体基本被除去即可，一般地，按照依次用低、高PH的缓冲液洗涤的顺序至少洗涤3个循环。可以通过测量未偶联的抗体的量来计算两种抗体总的偶联率，偶联率计算公式为:
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株CGMCC N0.5505。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体，其中，该单克隆抗体为抗赭曲霉毒素A的抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在纯化和检测赭曲霉毒素A中的应用。
4.一种免疫吸附剂，其特征在于，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为权利要求2所述的单克隆抗体和由杂交瘤细胞株CGMCC N0.5506分泌得到的单克隆抗体。
5.装载有权利要求4所述的免疫吸附剂的免疫亲和柱。
6.含有权利要求4所述的免疫吸附剂或含有权利要求5所述的免疫亲和柱的试剂盒；优选地，所述试剂盒中还包括洗脱液和/或保存液，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，所述保存液优选为含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS缓冲液。
7.权利要求4所述的免疫吸附剂、权利要求5所述的免疫亲和柱、或权利要求6所述的试剂盒在纯化以及检测黄曲霉毒素B1' B2> G1^ G2> M1^ M2、杂色曲霉素和赫曲霉毒素A中至少一种中的应用。
8.—种纯化黄曲霉毒素BpB2WpGyMpM2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括，使含有黄曲霉毒素G2JpM2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品通过权利要求5所述的免疫亲和柱，使得所述液体样品中的至少部分黄曲霉毒素B2、Gp G2、MpM2、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至该免疫亲和柱上，然后用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B2、G1 > G2> Mp M2、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来，所述洗脱液优选为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述含有黄曲霉毒素G2、M1、M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的液体样品优选为食品的液体提取物、饲料的液体提取物、生物样品的液体提取物和中药的液体提取物中的至少一种。
10.一种检测黄曲霉毒素G2、M1、M2、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法，该方法包括， (1)根据权利要求8或9所述的方法，得到待测液，所述待测液为用洗脱液将所述至少部分黄曲霉毒素B2> G1^ G2> M1' M2、至少部分杂色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脱下来而得到的溶液； (2)使所述待测液进入检测系统，并通过与标准品比较进行定性或定量检测。
全文摘要
本发明公开了一种杂交瘤细胞株CGMCC NO.5505和由该细胞株分泌得到的单克隆抗体及其应用。本发明还提供一种免疫吸附剂，该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗体，所述抗体为上述单克隆抗体和由杂交瘤细胞株CGMCC NO.5506分泌得到的单克隆抗体。以及装载该免疫吸附剂的免疫亲和柱。本发明还提供含有上述免疫吸附剂或免疫亲和柱的试剂盒。以及上述免疫吸附剂、免疫亲和柱、试剂盒在检测黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A中的应用。并具体提供了分离方法和检测方法。本发明通过开发出性能稳定、特异的单克隆抗体，实现了对6种黄曲霉毒素、杂色曲霉素和赭曲霉毒素A的同时纯化和检测。
文档编号C07K14/38GK103160471SQ20111040995
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者李为喜, 王雄, 鲍蕾, 许艳丽, 王步军, 吕宁, 梁成珠, 果旗, 江帆, 王彦斐, 胡明勋, 邓颖, 戚大海, 吴兆广 申请人:中国农业科学院作物科学研究所, 北京中检维康技术有限公司, 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心