专利名称：3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法与在犬狂犬病抗体检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及犬狂犬病病毒防治诊断领域，尤其是一种3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法与在犬狂犬病抗体检测中的应用。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的所有温血动物都易感的人兽共患病，一旦发病，病死率几乎100%，它是人类病死率最高的急性传染病之一。狂犬病病毒 G基因编码的糖蛋白(glycoprotein，GP)是病毒唯一暴露在表面的蛋白，也是唯一既能刺激机体产生中和抗体又能刺激机体产生细胞免疫的保护性抗原，同时还是狂犬病毒与宿主细胞受体结合的结构域，并与病毒毒力有关，在狂犬病毒致病和免疫中起着关键的作用。目前，尚无有效治疗狂犬病的药物，控制狂犬病主要以暴露前和暴露后的免疫为主，因此暴露前的有效诊断及监测狂犬疫苗接种后是否产生有效的保护抗体，开展疫苗免疫效果评估都显得十分重要。用于血清狂犬病毒抗体的检测方法主要有荧光抗体试验(FAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、荧光抗体病毒中和试验(FAVNT)、小鼠中和试验 (MNT)等，但是，这些检测方法要求较高，需要配备专门的仪器和专业技术人员，检测成本昂贵，而且耗时相对较长，这极大地限制了其在基层单位的应用。我国幅员辽阔，农村散养犬较多，在开展狂犬病免疫效果评估中，急需快速、简便、可以现场使用的诊断试剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法。本发明要解决的另一技术问题是提供一种上述3F3Rmg重组融合蛋白在制备检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒中的应用，该试剂盒操作简单、灵敏度高、特异性强，适合犬狂犬病抗体的检测。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案3F3Rmg重组融合蛋白，由 3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg融合基因所编码。3F3Rmg融合基因具有序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列。上述3F3Rmg重组融合蛋白，具有序列表SEQ. ID. No. 2的氨基酸序列。上述3F3Rmg重组融合蛋白的制备方法，该制备方法包括以下步骤<1>利用特异性引物分别从pMD-3F3kFv和pMD_RV_G重组基因中分别扩增出 3F3ScFv和Rmg基因，采用SOE-PCR方法拼接成3F3Rmg融合基因；<2>将3F3Rmg融合基因插入到原核表达载体pET_Trx中，构建重组质粒 pET-I^rx-SFSRmG，转化表达菌株BL21 (DE3)PlysS中，在IPTG的诱导下表达出3F3RmG融合蛋白。特异性引物为
3F3ScFv_U :cgc gga tcc cag gtg cag ttg gga gtg tea，3F3ScFv-D :ggt gca tcc ttc ate tat ttc caa ctt tgt ccc cga ；Rmg-U :aca aag ttg gaa ata gat gaa gga tgc acc aat ctg，Rmg-D :ccg gaa ttc tat aat gcc gtt gaa aat c&c0该制备方法还包括以下步骤<3>通过Ni+亲和层析纯化、谷胱甘肽法复性、透析和浓缩后获得了具有生物学活性的3F3Rmg融合蛋白，经红细胞凝集试验证实该融合蛋白既能够与人红细胞结合但不会发生凝集，又能够与Rmg抗体反应，具有双功能特性。人红细胞为人A型、B型、AB型、0型红细胞。上述3F3Rmg重组融合蛋白在制备检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒中的应用。检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括0. 2ug/ul的重组融合蛋白的诊断液和2%的人红细胞溶液。该诊断试剂盒每剂包括诊断液50ul和人红细胞溶液20ul。1988年，Kemp等首先报道了建立检测HIV抗体的自体红细胞凝集试验快速检测方法。只需采集待检人一滴血，5min内即可得知结果，操作程序简单，目测诊断结果，无需昂贵的特殊仪器和专门人员。其基本原理是以红细胞作为指示剂，利用重组双功能融合蛋白既能与红细胞结合又能与被检抗体/抗原结合，通过被检样品中抗体/抗原的桥联作用，使红细胞发生肉眼可见的凝集，根据红细胞的凝集情况即可快速进行结果判定。基于上述原理， 本发明获得了具有双功能特性的狂犬病病毒3F3Rmg重组融合蛋白，它由抗人红细胞表面抗原单链抗体基因(3F3ScFv，见序列表SEQ. ID. No. 7的碱基序列)和犬狂犬病病毒G基因主要抗原表位区基因(Rmg，见序列表SEQ. ID. No. 8的碱基序列)拼接而成的3F3Rmg融合基因所编码。3F3Rmg重组融合蛋白既能与人红细胞结合但不会发生凝集，又能与狂犬病G抗体反应，在抗体桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。应用该重组融合蛋白，发明人又制备了检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，其操作简单、灵敏度高且特异性强， 特别适合犬狂犬病抗体的检测，满足了基层现场使用快速、简便的要求。
具体实施例方式一、3F3Rmg重组融合蛋白的制备1.重组PCR引物设计(引物均由北京博迈德公司合成)根据重叠延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因与3F3kFv基因序列，设计4条重组PCR引物(见表1)。其中引物3F3kFv-U/3F3kFv-D用于扩增合成3F3kFv基因，引物 Rmg-U/Rmg-D 用于扩增合成 Rmg 基因。3F3ScFv 3，末端 15 个碱基(ggt gca tcc ttc ate) 和Rmg 5’端15个碱基(aca aag ttg gaa ata)为互补序列用于基因的拼接，拼接顺序为 3F3Rmg0 3F3ScFv-U 中 “gga tcc” 禾口 Rmg-D 中 “gaa ttc” 的部分为引入的 BamHI、EcoRI 酶切位点。表13F3ScFv、Rmg基因引物序列
权利要求
1.一种3F3Rmg重组融合蛋白，其特征在于由3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg 融合基因所编码。
2.根据权利要求1所述3F3Rmg重组融合蛋白，其特征在于所述3F3Rmg融合基因具有序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列。
3.根据权利要求2所述3F3Rmg重组融合蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.ID. No. 2 的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述3F3Rmg重组融合蛋白的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤<1>利用特异性引物分别从pMD-3F3kFv和pMD_RV_G重组基因中分别扩增出3F3kFv 和Rmg基因，采用SOE-PCR方法拼接成3F3Rmg融合基因；<2>将3F3Rmg融合基因插入到原核表达载体pET_Trx中，构建重组质粒 pET-I^rx-SFSRmG，转化表达菌株BL21 (DE3)PlysS中，在IPTG的诱导下表达出3F3RmG融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的3F3Rmg重组融合蛋白的制备方法，其特征在于所述特异性引物为3F3ScFv-U :cgc gga tcc cag gtg cag ttg gga gtg tea，3F3ScFv-D :ggt gca tcc ttc ate tat ttc caa ctt tgt ccc cga ；Rmg-U :aca aag ttg gaa ata gat gaa gga tgc acc aat ctg，Rmg-D :ccg gaa ttc tat aat gcc gtt gaa aat
6.根据权利要求5所述的3F3Rmg重组融合蛋白的制备方法，其特征在于该制备方法还包括以下步骤<3>通过Ni+亲和层析纯化、谷胱甘肽法复性、透析和浓缩后获得了具有生物学活性的 3F3Rmg融合蛋白，经红细胞凝集试验证实该融合蛋白既能够与人红细胞结合但不会发生凝集，又能够与Rmg抗体反应，具有双功能特性。
7.根据权利要求6所述的3F3Rmg重组融合蛋白的制备方法，其特征在于所述人红细胞为人A型、B型、AB型、0型红细胞。
8.根据权利要求1至7任一所述3F3Rmg重组融合蛋白在制备检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，其特征在于该诊断试剂盒包括0. 2ug/ul的所述重组融合蛋白的诊断液和2%的人红细胞溶液。
10.根据权利要求9所述的检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，其特征在于该诊断试剂盒每剂包括所述诊断液50ul和所述人红细胞溶液20ul。
全文摘要
本发明公开了一种3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法，该重组融合蛋白由3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg融合基因所编码，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。它的双功能特性使得其既能与人红细胞结合但不会发生凝集，又能与狂犬病G抗体反应，在抗体桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。应用该重组融合蛋白制备的检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，其操作简单、灵敏度高且特异性强，特别适合犬狂犬病抗体的检测，满足了基层现场使用快速、简便的要求。
文档编号C07K19/00GK102492042SQ20111043491
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者吴健敏, 周松峰, 廖文军, 白安斌, 袁书智, 覃绍敏, 陈凤莲, 马玲, 黄红梅 申请人:广西南宁惠朋动物药品有限责任公司, 广西壮族自治区兽医研究所