专利名称：新型肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型肽。具体地，本发明涉及一种有效用于治疗和/或预防软骨损伤或关节炎的新型肽。
背景技术：
软骨组织是由基质和软骨细胞组成。其中，基质的胶原蛋白纤维(胶原蛋白、蛋白多糖)以及非胶原蛋白将水吸入或排出软骨，从而在保持软骨独特的物理性质中发挥重要作用。关节疾病中常伴有软骨组织损伤，关节的软骨组织大致可分为四个区域，即最外层的浅表切线区(STZ)、中间区、深区和I丐化区(Clouet J et al. , Drug DiscoveryToday(2009) 14 :19/20，913-925)。浅表切线区是一个基质比例相对较低的区域，其中的胶原纤维沿关节面密集排列并出现细胞形态薄且扁平的软骨细胞，该区可吸收关节运动的剪切力。中间区比浅表切线区厚，是由厚胶原蛋白纤维和球形软骨细胞组成，用于承受负荷，·因为具有高比例的含蛋白多糖和水的基质。深区含有丰富的多糖和非胶原蛋白以及最高含量的基质成分，但含水量最低，用于通过纵向排列相对少量的接近球形的软骨细胞和胶原蛋白纤维来赋予组织稳定性。钙化区具有被称为潮标的特殊结构，并且发挥将软骨组织固定在骨组织上的功能。构成关节的软骨组织受损引起关节炎的发作，伴随有肿胀、发热和疼痛。关节炎的发作是不分种族的，根据其致病原因可被划分为约100种类型。关节炎的最常见形式是骨关节炎，一种主要由老化引起的退变性关节病。其它的关节炎实例包括自身免疫性疾病的类风湿关节炎和银屑病关节炎，以及由感染引起的化脓性关节炎。特别地，退变性关节炎是一种老年人的代表性疾病，关节的老化是退变性关节炎的主要致病原因。此外，由于退变性关节炎的发病率也与各种因素结合的相互作用有关，如遗传因素、营养不均衡、缺乏运动、过度运动或损伤、以及向关节施加沉重的负荷的行为，例如劳累过度或习惯性不良姿势及由于肥胖引起的超负荷，因此退变性关节炎也是一种高频率见于年轻人群的疾病(GegOUtPP et al. , Joint Bone Spine(2008)669-671)。因外伤或退变性变化引起的关节支撑组织弱化，导致用于吸收冲击的软骨组织受伤，从而增加了骨与骨的摩擦弓丨起疼痛和炎症。炎症加速关节周围形成骨赘，限制了关节的活动性并导致更严重的疼痛。关节炎是一种发病率高、覆盖年龄范围广的疾病，并且受损组织不易于自发性再生或修复。因此，关节炎是患者的社会活动长期受到限制和生活质量恶化的主要原因。目前可用的治疗措施大致可分为保守疗法，如运动疗法，包括控制体重、饮食疗法、注射疗法和药物疗法；以及手术疗法，如使用生长因子的组织再生、植入人工培养的细胞以及用于关节严重受损时的人工关节置换(Clouet J et al. , Drug DiscoveryToday(2009) 14 :19/20,913-925)。对关节不产生沉重负荷范畴内的运动疗法有加强关节周围组织的作用，可延缓症状进一步加重，但并不会使损伤组织再生，且在病情严重的情况下，由于疼痛，运动疗法难以开展。为了促进关节的组织再生或减轻炎症，已经使用软骨组成成分，如葡萄糖胺或软骨素、具有抗炎作用的鱼油以及其他中药成分(Derfoul A et al. , OsteoarthritisCartilage (2007) 15,646-655 ；Tiraloche G et al. , Arthritis Rheum. (2005) 52,1118-1128 ；McAlindon TE et al. , JAMA (2000) 283 (11) : 1469-147 ;和 Zainal Z et al.，Osteoarthritis Cartilage (2009) 17 (7) :896-905)。此外，也已经使用注射透明 质酸(HA)的方法，通过减少损伤区域的摩擦来缓解疼痛和预防症状加重，所述透明质酸是一种关节滑液成分(Waddell DD et al.，Arthroscopy (2010) 26 (I) :105-11 ；and Wang CT et al. , J.Bone Joint Surg.Am. (2004) 86-A 538-545)。虽然，据报道有些保守疗法具有有利的治疗效果，但其疼痛缓解或治疗效果是微不足道的或机制尚不完全清楚。因此，有必要从这些疗法的治疗应用的角度作进一步检验(McAlindon TE et al. , JAMA(2000)283(11) :1469-147) 阿司匹林、对乙酰氨基酚或各种非甾体类抗炎药(NSAIDs)和甾体类药物，如可的松，已被用于缓解炎症或疼痛。然而，这些药物疗法并不是能实现修复损伤组织的基础疗法。此外，据报道长期服用这类药物具有如胃肠道、组织或骨损伤等不良副作用(Clouet J et al. ,Drug Discovery Today(2009) 14 :19/20，913-925 ；Glass GG Dis.Mon.(2006)343-362 ;Zhang W et al. , Ann. Rheum. Dis. (2004)63,901-907) ；Frampton JE etal. , Drugs(2007)67(16) :2433-72 ；and McDonough AL. Phys Ther. (1982)62(6) :835-9)。为了再生或修复损伤的软骨组织，有人试图使用含有芹菜苷元、或生长因子或其一部份，如 FGF、BMP7/0P-1 或 TGFP I 的组合物(Clouet J et al. , Drug DiscoveryToday (2009) 14 :19/20,913-925 ;Shi S et al.，J. Biol. Chem. (2009)284(1) :6697-6704;and Moore EE et al. ,Osteoarthritis Cartilage (2005) 13,623-631)。然而，由于直接且重复地给关节炎患者注射由高分子量蛋白质组成的生长因子具有局限性，这种生长因子实际应用给患者还需要对其给药方式进行进一步研究。当上述保守疗法没有疗效或剧烈疼痛持续时，可以使用人工关节来置换损伤关节的手术治疗。然而，人工关节有一个约10年的有限寿命，所以在适当情况下需要再次手术。在这种情况下，再次手术有其局限性，因为去除骨头间狭窄的人工关节具有难度，需要植入一个更大的人工关节和需要更广泛的周围骨组织。由于存在这些问题，将人工关节置换应用于年轻人时应当更加谨慎。随着人工细胞培养技术的进步，最近报道了一些方法，包括从多能干细胞或自体骨髓间质干细胞人工培养软骨细胞以及植入所培养的软骨细胞(Csaki C et al.，AnnAnat. (2008) 190 (5) =395-412)。不幸的是，软骨细胞植入仍然有大量的问题需要解决，如不容易获得足够数量的自体细胞、以及将其应用于大量患者的技术和成本问题，如植入细胞的附着、再生效率和安全性。随着我们进入老龄化社会，患有关节炎的老龄人群正在不断增加。此外，由于过度运动、营养失衡、肥胖等，关节疾病的发病率在年轻人群中也在增加。为了减少造成的经济损失和社会开支并且提高老龄人群的生活质量，迫切需要开发一种先进的抗关节炎药物，其能够实现软骨组织基本的更加方便、安全、根本的再生和修复，而不是传统的减轻炎症或疼痛的保守饮食疗法或药物疗法，也不是如人工关节置换或植入人工培养的软骨细胞等手术疗法。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供了一种新型肽或其药学上可接受的盐。进一步地，本发明的目的是提供一种用于治疗和/或预防软骨损伤和关节炎中的至少一种的组合物。进一步地，本发明的目的是提供一种有效治疗软骨损伤或关节炎的组合物。技术方案
本发明提供一种由式⑴表示的肽X1-Leu-Xg-Leu-X3 (I)其中，X1表示 Glu 或 Asp, X2 表示 His、Lys 或 Arg, X3 表示 Asp 或 Glu ;Glu、Asp、Leu、His、Lys和Arg分别为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸；或其药学上可接受的盐。所述肽优选为肽(SEQID NO 1 ;Glu-Leu-His-Leu-Asp)，其中 X1 表示 Glu，X2 表示His, X3 表不 Asp0根据R基团(同时连接到氨基酸上的羧基、氨基和氢原子以外的可变基团)的属性将氨基酸分类。Glu或Asp被归类为酸性氨基酸，具有带负电荷的(酸性)R基团；而把8、Lys或Arg被归类为碱性氨基酸，具有带正电荷的(碱性)R基团。酸性氨基酸具有在pH
7.O带负电荷的R基因，并且还具有一个羧基。碱性氨基酸具有在pH 7. O带正电荷的R基因。属于相同类别的氨基酸具有相似的性质。所述肽的每个组成氨基酸可能是L-型、D-型和/或DL-型，本发明的肽的组成氨基酸包含了所有这些形式。所述药学上可接受的盐的实例包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。此外，本发明提供本发明的肽或其药学上可接受的盐在用于治疗和/或预防软骨损伤或关节炎中的用途。因此，本发明提供一种组合物，所述组合物包含本发明的肽或其药学上可接受的盐作为活性成分，用于治疗和/或预防软骨损伤和关节炎中的至少一种。所述“治疗和/或预防”可通过选自再生软骨组织、抑制软骨组织基质降解酶的表达和抑制软骨组织骨化中的至少一种来实现，并且所述关节炎优选为伴随有软骨和软骨下骨退变的关节病。此外，本发明提供一种含有本发明的肽或其药学上可接受的盐和转化生长因子β I (TGF β I)的组合物。所述组合物中的肽或其药学上可接受的盐和TGF0 I的重量比例范围可以是
I 20-40。本发明的组合物可以是药物组合物，所述药物组合物可以通过添加药学上可接受的载体配制而成。
本发明的肽可以通过常用的肽合成工艺制备而成。例如，可以用Schroder和Lubke (The Peptides, Vol. I, Academic Press, New York, 1965)所述的制备方法以及类似的方法，也可以用液相合成法或固相合成法来制备。形成肽键的方法的实例包括叠氮法、酸氯化法、对称酸酐法、混合酸酐法、碳二亚胺法、亚胺加成法、活化酯法、羰基二咪唑法、氧化还原法以及采用Woodward试剂K的方法。在进行偶联反应之前，可将不参与反应的羧基、氨基等基团保护起来，参与偶联反应的羧基和氨基可通过本领域中已知的方法进行活化。竣基保护基团的实例包括成酷基团，如甲基、乙基、节基、对硝基节基、叔丁基和环己基。氨基保护基团的实例包括苄氧羰基、叔丁氧羰基、异冰片基氧羰基和/或9-芴甲 氧擬基。羧基的活化形式的实例包括对称酸酐、叠氮化物和活性酯(醇酯，如五氯苯酚、2，4- 二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、N-羟基-5-降冰片烯-2，3- 二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺或I-羟基苯骈三氮唑)。活化的氨基的实例是酰胺磷酸盐。所述反应是在溶剂，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、吡啶、二氧六环、四氢呋喃、水、甲醇或它们的混合物中进行。反应温度范围可以是约-30至50°C，该温度范围是所述反应通常采用的。去除肽保护基团的反应可根据保护基团的种类而变化，但应该是一种能够去除保护基团而又不对肽键产生任何影响的方法。可以通过酸处理来去除保护基团，例如用氯化氢、溴化氢、氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这些酸的混合物进行处理。此外，可以在液氨中用金属钠还原或用钯碳催化还原。通过酸处理进行去除保护基团的反应时，可以使用添加剂，如苯甲醚、苯酚或苯甲硫醚。反应完成后，本发明制备的肽可以通过传统的肽纯化工艺回收，例如，提取、分离、再沉淀、再结晶或柱层析。此外，可使用传统的方法将本发明的肽转化为变体或其药学上可接受的盐。本发明的肽可以通过自动化肽合成仪合成或通过基因工程技术生成。例如，目标肽可以通过以下方法生成通过基因操纵制备编码由融合头和和本发明的肽组成的融合蛋白的融合基因；将所述融合基因转化宿主微生物；在宿主微生物中以融合蛋白形式表达所述目标肽；然后用蛋白酶或化合物从所述融合蛋白中裂解并分离本发明的肽。所述肽或其药学上可接受的盐的剂量范围为肠外给药150 μ g/天至Img/天，优选0. 5mg/天至Img/天。口服给药的剂量比肠外给药高I. 2至I. 5倍。本发明的肽或组合物主要通过肠外途径给药，例如局部注射(关节腔内注射)、静脉注射或皮下注射、或经鼻给药。此外，视需要，也可采用口服给药。本发明的肽或其药学上可接受的盐或本发明的组合物结合药学上可接受的载体可以制备成所需的剂形，如注射剂、粉末剂、滴鼻剂、颗粒剂、或片剂。所述药学上可接受的载体可以根据本领域的技术人员所熟知的多种因素制备，如考虑到以下的非限制性因素要使用的有特定生理活性的物质及其浓度、稳定性和预期的生物利用度；接受治疗的疾病、障碍或情况；接受治疗的主体及其年龄、大小和综合情况；以及组合物的拟施药途径，例如局部给药、静脉注射、肌肉注射、透皮、口服或经鼻给药。通常，用于施用生理活性物质的药学上可接受的载体实例，除口服给药途径外，可包括05胃(5%葡萄糖水溶液)、含5%体积或更少的葡萄糖的水溶液、以及生理盐水。在局部病灶内注射时，可采用多种注射水凝胶来加强治疗效果和提高药物疗效的持续时间。此外，药学上可接受的载体可包含加强活性成分稳定性的其他成分，如防腐剂或抗氧化剂。本发明的肽或组合物可根据本领域中已知的任何适当方法，根据要治疗的疾病和成份优选地制备成所需的剂型，例如“Remington' s Pharmaceutical Sciences”中所述的方法(MackPublishing Co. , Easton,PA (latest edition))。本发明的肽可储存于生理盐水溶液中并可加入甘露醇或山梨醇后冷冻干燥于安瓿中。所述冻干的肽可在使用前溶于生理盐水或类似的溶液中以便重建。
进一步地，本发明提供一种用于治疗和/或预防软骨损伤或关节炎的方法，包括向有需要的哺乳动物，包括人类，施用本发明的肽或其药学上可接受的盐。进一步地，本发明提供一种本发明的肽或其药学上可接受的盐的医药用途，优选用于治疗和/或预防软骨损伤或关节炎。本发明的肽或其药学上可接受的盐或本发明的组合物中所述的详细内容应当适用于本发明的用途以及治疗和/或预防的方法，只要它们之间没有相互矛盾。有益效果本发明的肽或其药学上可接受的盐可有效用于治疗和/或预防软骨损伤或关节炎，并对软骨组织再生、抑制软骨组织基质降解酶的表达和/或抑制软骨组织骨化显示出效果。
图I显示本发明的一个实施方式中损伤软骨组织的变化的照片。图2显示本发明的一个实施方式中以苏木素-伊红染色观察到的软骨组织再生效果的结果。图3显示本发明的一个实施方式中以胶原蛋白染色观察到的软骨组织再生效果的结果。图4显示本发明的一个实施方式中以苏木素-伊红染色观察到的软骨组织再生效果的结果。图5显示本发明的一个实施方式中培养的软骨组织细胞中II型胶原蛋白的基因表达变化结果。图6显示本发明的一个实施方式中培养的软骨组织细胞中MMP13的基因表达变化结果。图7显示本发明的一个实施方式中培养的软骨组织细胞中X型胶原蛋白的基因表达变化结果。图8显示本发明的一个实施方式中通过肉眼观察退变性关节炎模型确认的软骨再生效果的结果的照片。
图9显示本发明的一个实施方式中对退变性关节炎模型以苏木素-伊红染色确认的软骨再生效果的结果。图10显示本发明的一个实施方式中对退变性关节炎模型以番红O染色确认的软骨再生效果的结果。图11显示本发明的一个实施方式中对退变性关节炎模型以Masson三色染色确认的软骨再生效果的结果。
具体实施例方式现参考下面的实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅用于说明本发明，不应解释为限制本发明的范围和精神。实施例I肽的制备 应本发明人的要求，由Peptron公司(South Korea)制备具有SEQ IDNO. I (Glu-Leu-His-Leu-Asp)所示的氨基酸序列的肽。具体地，采用自动化肽合成仪(ASP48S, Peptron Inc.),通过Fmoc SPPS (9-荷甲氧羰基固相肽合成法)将氨基酸单元从C-末端逐个连接。使用NH2-His (Trt) _2_氯-三苯甲基树脂，将肽C-末端的第一个氨基酸连接到树脂上。用于合成肽的所有氨基酸都被三苯甲基(Trt)、叔丁氧羰基(Boc)、叔丁基(t-Bu)等保护，其中N-末端被Fmoc保护，且在酸中去除所有残基。使用2- (1H-苯并三唑_1_基)-I，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)/羟基苯并三唑(HOBT)/N-甲基吗啡啉(NMM)作为耦合试剂。(I)将被保护的氨基酸(8当量)和耦合试剂HBTU (8当量)/HOBt (8当量)/NMM (16当量)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室温下反应2小时。⑵通过在DMF中加入20%哌啶，然后在室温下反应5分钟，重复两次来去除Fmoc。重复步骤(I)和(2)的反应来制备肽骨架，并使用三氟乙酸(TFA)/1，2_乙二硫醇(EDT)/苯甲硫醚/三异丙基硅烷(TIS)/水=90/2. 5/2. 5/2. 5/2. 5 将肽从树脂上分离。将肽用 Vydac Everest C18 柱(250mmX 22mm，
10μ m)通过反相HPLC纯化，然后用含O. 1% (v/v)三氟乙酸的水-乙腈线性梯度(10%至75%乙腈(v/v)进行分离。使用LC/MS(Agilent HPllOO系列)确认纯化肽的分子量，然后将其冷冻干燥。实施例2-12肽的制备用与实施例I相同的方法来制备实施例2-12的肽，区别是用下表I中所列的氨基酸序列来代替实施例I中的氨基酸序列。表I
实施例序号氨基酸序列SEQ ID NO
实施例 2Glu-Leu-His-Leu-Glu2
实施例 3Glu-Leu-Lys-Leu-Asp3
实施例 4Glu-Leu-Lys-Leu-Glu权利要求
1.一种如式⑴所示的肽Xj-Leu-Xg-Leu-X3 (I)其中，X1 表示 Glu 或 Asp, X2 表示 His、Lys 或 Arg, X3 表示 Asp 或 Glu ;Glu、Asp、Leu、His、Lys和Arg分别为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸，或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求I所述的肽，其中X1表示Glu,X2表示His, X3表示Asp。
3.一种用于治疗或预防软骨损伤和关节炎中至少一种的组合物，包含权利要求I或2所述的肽或其药学上可接受的盐作为活性成分。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述治疗或预防是通过软骨组织再生、抑制软骨组织基质降解酶的表达和抑制软骨组织骨化中的至少一种。
5.如权利要求3所述的组合物，其中所述关节炎是伴有软骨与软骨下骨退变的关节病。
6.如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
7.一种组合物，包含权利要求I或2所述的肽或其药学上可接受的盐和转化生长因子β I (TGF β I)。
全文摘要
本发明提供了由式(I)的X1-Leu-X2-Leu-X3所示的肽，其中X1表示Glu或Asp，X2表示His、Lys或Arg，X3表示Asp或Glu；Glu、Asp、Leu、His、Lys和Arg分别为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸；或其药学上可接受的盐；一种用于治疗或预防软骨损伤和关节炎中的至少一种的组合物，所述组合物包含所述肽或其药学上可接受的盐作为活性成分；以及一种包含所述肽或其药学上可接受的盐和TGFβ1的组合物。上述肽或其药学上可接受的盐可有效地用于治疗和/或预防软骨损伤和/或关节炎，并且能够显示出再生软骨组织、抑制软骨组织基质降解酶的表达和/或抑制软骨组织骨化的作用。
文档编号C07K7/06GK102892776SQ201180004884
公开日2013年1月23日 申请日期2011年6月22日 优先权日2010年6月30日
发明者金海镇, 李济旭, 权永准, 文银贞 申请人:因首太克株式会社