癌干细胞标记物及其用途的制作方法

专利名称：癌干细胞标记物及其用途的制作方法
癌干細胞标记物及其用途本发明尤其与这样的处理方法相关，其基于特异性结合肿瘤相关的糖抗原的试剂用于处理癌干细胞及相关疾病的用途。还提供了使用肿瘤相关的糖抗原作为癌干细胞标记物的诊断及预后方法。
背景技术：
肿瘤可视为由致瘤性癌细胞起始的异常器官，此过程需要通过积累的突变产生无限増殖的能力。在将肿瘤视为异常器官的理解中，可应用正常干细胞生物学的原理以更好地理解肿瘤是如何发展及扩散的。许多发现表示将正常干细胞和致瘤性细胞之间进行类比是恰当的。正常干细胞与致瘤性细胞二者都具有很强的増殖潜力井能够产生新的(正常或异常)组织。致瘤性细胞可被视为癌干细胞(CSC)或癌起始细胞(CIC—在本文中术语CSC与CIC作为同义词使用)，其与正常干细胞类似地经历了异常及调控不良的器官发生过程。肿瘤和正常组织都由杂合组合的细胞组成，具有不同表型特征及不同扩增潜力的。
癌干细胞被认为是具有干细胞样特性的肿瘤的特定部分，其起始并维持了瘤克隆。这些细胞具有自我更新的能力，但是也形成了产生表型多祥的癌细胞但具有较低致瘤性潜能的祖细胞。与并非癌干细胞的肿瘤细胞相比，这种干细胞样细胞的亚群在肿瘤形成和转移性肿瘤扩散方面是高效的。已经在广泛多种癌症，包括白血病、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤以及几乎所有类型的上皮肿瘤(癌)中鉴定出癌干细胞(CSC)。现在已经广泛接受了癌干细胞(CSC)通常为癌症发生的前提条件这一理论。癌干细胞表现出低的増殖速率、高的自我更新能力、倾向于分化成活跃增殖的肿瘤细胞，并显示出对化疗或放疗的抗性(參见例如，Van der Griend等人，2008)。可根据对原发性肿瘤内不同表面标记物形式的研究来表征癌干细胞。在数目不断増加的建议CSC标记物中，最显著并最为接受而且也在不同肿瘤类型的CSC中广泛分布的有两种CD44和CD133。有报道称CD44为癌干细胞的强标记物(Chu等人，2009 ；Takaishi等人2009)。来自结肠肿瘤的单个CD44+细胞可在体外形成球体并能够产生类似于原发性肿瘤特性的异种移植瘤(Du等人，2008)。⑶133也是癌干细胞的标记物。一开始⑶133被描述为特异性针对人造血干细胞的表面抗原以及小鼠神经上皮及几种其他胚胎上皮的标记物(Singh等人2004)。在大量的近期研究中，将⑶133单独或与其他标记物联合用于从结肠、肺和肝脏的恶性肿瘤中分离癌干细胞(Haraguchi等人，2008)。⑶133+肿瘤细胞比⑶133-肿瘤细胞更能有效地修复放射性诱导的DNA损伤(Bao等人，2006)。癌干细胞的存在对于癌症治疗有深远的意义。现有的疗法大部分是针对肿瘤细胞的大块群体而研发的，因为这些疗法是通过其缩小肿瘤实质的能力鉴定的。然而，癌干细胞经常对化疗有抗性并能使化疗失败(Sell等人，2008)。为设计(也)靶向癌起始细胞(本文中也称为癌干细胞)的治疗试剂，需要寻找优选地在良性肿瘤和/或正常非肿瘤细胞中不存在的癌干细胞的分子靶标，同时此靶标特异性针对癌干细胞。预期这些试剂对肿瘤(尤其是转移肿瘤)产生更持久的应答及疗效。因此，需要新的癌干细胞标记物以提供新型治疗性靶标以改进疗法。大多数已知的干细胞标记物为蛋白质。也已经发现其中多数为正常干细胞标记物，因此在非肿瘤干细胞上表达。这使得其不适合或不那么适合作为治疗性靶标。目前，正常和癌干细胞之间没有非常明显的区別。因此，非常需要能够鉴定其它合适的癌干细胞标记物，和使用这些标记物用于诊断和预后方法和/或发展靶向癌干细胞的疗法。发明概述本发明基于肿瘤相关糖抗原为合适的癌干细胞标记物这一发现。因为几乎所有迄今描述的癌干细胞标记物都为蛋白质，因此发现肿瘤相关糖抗原如⑶176、⑶174和⑶173表达于癌干细胞这一点很出乎意料。因此，这 些肿瘤相关糖抗原为用于癌干细胞的合适的标记物，进ー步地，其提供攻击癌干细胞的疗法的合适的治疗性靶标。根据本发明的第一方面，提供了特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂，用于处理表达所述肿瘤相关糖抗原的癌干细胞。还提供了药物组合物，其包含用于处理表达所述肿瘤相关糖抗原的癌干细胞的相应结合试剂。根据第二方面，提供了用于鉴定包含对用特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂的处理易感的癌干细胞的癌的方法，其中所述处理对癌干细胞有效，所述方法确定获自患者的癌样品是否含有表达由结合试剂特异性针对的肿瘤相关糖抗原的癌干细胞，其中癌干细胞上所述肿瘤相关糖抗原的存在表示此癌对用特异性结合所述肿瘤相关糖抗原的结合试剂进行的处理易感，其中所述处理对癌干细胞有效。根据第三方面，提供了对癌进行诊断、分期和/或预后和/或其对处理的易感性进行监视的方法，包括分析分离自患者的样品中细胞上肿瘤相关糖抗原表达的步骤，其中表达肿瘤相关糖抗原的细胞的存在表示所述样品中存在癌干细胞。根据第四方面，提供了哺乳动物癌干细胞的组合物，其中组合物中至少50%、优选地至少75%的细胞为癌干细胞，其表达肿瘤相关糖抗原。根据相关的方面，提供了用于分离干细胞的方法，包括对表达肿瘤相关糖抗原的癌干细胞进行选择性的富集。根据第五方面，提供了用于根据本发明的方法的试剂盒，包括特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂以及用于根据本发明的方法的说明书。根据第六方面，提供了就表达肿瘤相关糖抗原的癌干细胞的有效性，筛选候选治疗试剂例如化疗试剂或其他抗癌药物的方法，所述方法包括a.将所述试剂与根据本发明的细胞组合物相接触，以及b.确定所述试剂针对所述肿瘤相关糖抗原阳性的癌细胞的有效性。本领域技术人员从以下说明和附随的权利要求中了解本发明的其他目标、特征、优点及方面。然而，要理解的是以下描述、附随的权利要求及具体实施例代表本申请优选的实施方式，是以说明的方式给出的。本领域技术人员在阅读以下内容后会清楚公开的发明的精神和范围内的多种变化和修饰。定义如本文所使用的，以下词句除了在使用其的上下文中有另有说明外，一般优选地意欲具有如下文提出的意义。“结合试剂”可以为任何能够结合靶标物质如肿瘤相关糖抗原的化合物或化合物复合体。优选地，结合试剂能够特异性结合靶标物质。通过筛选结合试剂库以鉴定/获得结合靶标物质的结合试剂来获得合适的结合试剂。各结合试剂库的实例为例如展示有结合试剂的卩遼菌体或卩遼菌粒的库。用于在体外获得例如抗体的方法也在Hudson和Souriau(Hudson, P. J. and Souriau, C. (2003) "Engineered antibodies"Nat. Med. 9, 129-134)中有描述。只要其能识别和结合靶标物质，在本文中是肿瘤相关糖抗原，结合试剂可以具有任何结构。结合试剂可选自抗体、其抗原结合片段或衍生物或者具有提供了结合功能的蛋白质骨架的结合试剂如anticalin或植物凝集素。结合试剂还可以为提供了结合功能的肽或融合蛋白质。对具有与抗体类似的结合功能的结合试剂的概述见于Hey等人(Hey等人，(2005) Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical andindustrial application", Trends in Biotechnology23 (10)，514-522)。抗体衍生物还包括具有相同结合功能但例如改变的氨基酸序列的抗体或抗体片段。术语“抗体”具体指的是包含由ニ硫键相连的至少两条重链和两条轻链的蛋白质。术语“抗体”包括天然发生的抗体以及抗体的所有重组形式，例如，表达于原核细胞中的抗体、非糖基化抗体、人源化抗体及嵌合抗体。每条重链由重链可变区(Vh)和重链恒定区(Ch)组成。每条轻链由轻链可变区(VJ和轻链恒定区(Q)组成。重链恒定区包含三个或 在IgM-或IgE-型抗体的情况下四个重链恒定区(CH1、Ch2、Ch3和CH4)，其中第一个重链结构域CHl与可变区临近并与通过铰链区第二个恒定区Ch2相连。轻链恒定区仅由一个恒定结构域构成。可变区可进ー步划分为超可变区(称为互补决定区(CDR))，其分散于称为骨架区(FR)的更保守的区域之间，其中各个可变区包含三个⑶R以及四个FR。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。重链和轻链可变区包含ー个与抗体相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导所述免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞如效应子细胞以及经典补体系统的第一组分Clq)的结合。IgA和IgM分子通常具有J链，但也明确地包括由其衍生的如不具有J链的分子。进ー步地，根据本发明的术语“抗体”还包括单链抗体以及重链抗体，即，只由一条或多条(尤其是两条)重链组成的抗体，和纳米抗体，g卩，只由单个单体可变结构域组成。抗体的“抗原结合片段或衍生物”具体而言为蛋白质或糖蛋白，其能够如參考抗体那样结合至例如抗原的相同表位。因此，本文中抗体的抗原结合片段或衍生物通常指的是功能性的抗原结合片段。优选地，所述抗原结合片段包含完全抗体的至少20个氨基酸、更优选地至少100个氨基酸，优选地包含抗体的结合区域。在具体的优选实施方式中，抗体的抗原结合片段包含重链可变区域。显示全长抗体的片段能起到抗体的抗原结合功能。抗体片段的实例包括(i) Fab片段，由各个重链和轻链的可变区和第一恒定结构域构成的单价片段；(i i )F (ab) 2片段，包含例如由铰链区的ニ硫桥连在一起的两条Fab片段的ニ价片段；
(iii)由重链的可变区和第一恒定区结构域ChI构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的重链和轻链可变区构成的Fv片段；(V) scFv片段，由単一多肽链构成的Fv片段；(vi)由两条Fv片段共价相连构成的(Fv)2K段；(vii)重链可变结构域；以及(viii)由以重链和轻链可变区之间的相连只能在分子间发生而不能分子内发生的方式共价连接的重链可变区和轻链可变区构成的多价抗体。术语“抗体或者其抗原结合片段或衍生物”还包括単一结构域的抗体。具有不同聚糖侧链的抗体或抗体片段也在此定义理解之内。可使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段或衍生物。“特异性结合”优选地表示结合试剂如抗体或抗原结合片段或衍生物，相比于与另ー种靶标的结合，其与其特异性针对的靶标如表位结合地更强。如果试剂结合第一种靶标的解离常数(Kd)比其结合第二种靶标的解离常数低，则其对第一种靶标的结合相比于第二种靶标更强。优选地所述试剂特异性结合的靶标的解离常数比对所述试剂不特异性结合的靶标的解离常数低，是超过1/2、更优选地超过1/5，更优选超过1/10，甚至更优选超过1/20、1/50、1/100、1/200、1/500或1/1000。优选地，特异性结合指的是解离常数为10 μ M或更低、更优选地为3 μ M或更低、I μ M或更低、700ηΜ或更低、500ηΜ或更低、300ηΜ或更低、200ηΜ或更低、优选地为IOOnM或更低、70ηΜ或更低、50ηΜ或更低、30ηΜ或更低、20ηΜ或更低、并且最优选地IOnM或更低、5ηΜ或更低、2ηΜ或更低或InM或更低的结合。解离常数优选地在标准条件下測量，尤其是在生理条件下。如果特异性结合靶标化合物(如CD176)的结合试剂用于具体方法以结合至所述靶标化合物，优选地选择能够使所述结合试剂对其他尤其是类似的化合物(如其他糖抗原)的结合在此方法中检测不到或不干扰检测和/或确定其与靶标的结合的条件。特异性结合靶标结构如根据本发明的肿瘤相关糖抗原的结合试剂还包括以下实施方式，其中只要能够特异性地识别靶标结构，结合试剂还结合除了靶标结构外的其他结构。例如，术语“特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂”包括结合肿瘤相关糖抗原并也结合其他结构的结合试剂，尤其是所述肿瘤相关糖抗原所连接的载体分子。优 选地，所述其他的结构，尤其是肿瘤相关糖抗原的载体分子，在没有肿瘤相关糖抗原时不受结合试剂的结合，或只是在结合非特异性靶标时相比于特异性靶标以高得多的(如上文限定的)解离常数结合。如本文所使用的，术语“蛋白质”具体而言指的是氨基酸的分子链或超过ー种氨基酸链的复合体。蛋白质可包含任何天然发生的氨基酸以及人工氨基酸，并可为生物或合成来源。可对蛋白质进行天然(翻译后修饰)或合成的修饰，通过例如糖基化、酰胺化、羧基化和/或磷酸化。蛋白质包含至少两个氨基酸，但不需要为任何特定的长度；此术语不包括任何的大小限制。在本申请中，术语“蛋白质”“多肽”和“肽”交換使用。优选地，蛋白质包含至少10个氨基酸、优选地至少50个氨基酸、至少100个氨基酸以及最优选地至少100个氨基酸。根据本发明，术语“患者”具体而言指的是人类、非人灵长类或其他动物，具体而言为哺乳动物如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类如小鼠或大鼠。在ー个具体优选的实施方式中，患者为人类。根据本发明的术语“癌症”具体而言指的是白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、骨髄瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宮内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、脑癌、子宫癌、肠道癌、肝癌、结肠癌、胃癌、小肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食道癌、结肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巣癌和肺癌，以及其转移癌。如本文使用的，癌指的是增值过度的病况。该术语指的是恶性及非恶性细胞群体，但优选地指恶性细胞及其细胞群体。这些障碍具有ー种或多种细胞亚群的过度细胞増殖，其经常看上去与周围组织在形态上和基因型上有差异。过度的细胞増殖可通过与ー般群体对照和/或通过与具体患者在例如患者人生的较早时间点进行对照而确定。过度增殖的细胞障碍可在不同的动物类型及人类中发生，并产生不同的物理表现，取决于受影响的细胞。通过“肿瘤”具体而言指的是通过错调控的细胞増殖形成的一组细胞或组织。肿瘤显示了正常组织的结构组织和功能性协作上的部分或全部缺失，并通常来自不同的组织实质，其可为良性或恶性的。具体而言，术语肿瘤指的是恶性肿瘤。根据ー个实施方式，术语“肿瘤细胞”还包括非实体癌的细胞，如白血病细胞。根据另ー个实施方式，非实体癌的细胞不在术语“肿瘤细胞”范围内。通过“转移”具体而言指的是癌细胞从其原始位点扩散到身体的其他部分。转移的形成是非常复杂的过程，一般涉及癌细胞从原发性肿瘤的脱离，进入身体循环并稳定下来在身体内其他位置的正常组织中生长。当肿瘤细胞转移时，新肿瘤叫做ニ级或转移肿瘤，其细胞一般与原始肿瘤中的细胞类似。这意味着，例如，如果乳腺癌转移到肺，ニ级肿瘤是以异常乳腺细胞构成，而不是异常肺细胞。肺中的肿瘤叫做转移乳腺癌，不是肺癌。根据本发明，癌的“分期”优选地指的是对癌的进程及程度的分类。优选的癌分期系统是恶性肿瘤的TNM分类，其中T描述的是肿瘤的大小及其是否侵入附近的组织，N描述的是所涉及的区域性淋巴结，而M描述了远处的转移情況。根据患者中的情况，对这些參数 中每个给出具体值，其中一般较高的数字表示更严重的情况(T (0-4),N (0-3),M (0/1))。另外，对于更详细的分类，可确定进一歩的參数并/或可使用前綴。进ー步地，可根据ncc在癌分期系统中总结 m分类，其參考O期-IV期的癌。根据本发明，“样品”具体而言指的是但不限于组织样品、体液和/或细胞样品，并可通过常规方式如通过组织活检(包括穿刺活检)或通过取含有或疑似含有癌细胞的血、支气管排出物、痰、尿、排泄物或其他体液或组织切片、样片等获得。根据本发明，术语“样品”还包括各样品的级分或组分。如本文所描述的，术语“细胞増殖”及“増殖”具体而言指的是通过细胞分裂进行的细胞扩增。术语“癌干细胞”具体而言涉及但不限于在合适的条件下能在体外产生非分化细胞的聚合体(称为肿瘤球)的细胞。形成球体的细胞能够自我更新；当将其分离并在相同条件下生长时，其将再次形成球体。在体内，癌干细胞特征在于其形成转移的潜力及干细胞标记物如CD44的表达。其还可提供药物抗性。术语“癌干细胞”及“癌起始细胞”在本文用作同义词。术语“肿瘤相关糖抗原”具体而言指的是表达于癌和/或肿瘤细胞尤其是恶性癌和/或恶性肿瘤细胞上的糖抗原。术语“肿瘤特异性糖抗原”具体而言指的是主要或甚至专门表达在癌和/或肿瘤细胞上的糖抗原，而因此其在非癌或非肿瘤细胞上只以很低的量生长。优选地，术语“肿瘤特异性糖抗原”指的是主要或优选地专门表达在恶性癌和/或恶性肿瘤细胞上的糖抗原，而因此其在非癌或非肿瘤细胞、良性癌和/或良性肿瘤细胞和/或在同一患者的健康组织中只以很低的量生长。优先地，肿瘤特异性糖抗原不在大多数正常细胞上表达，甚至更优选地，其只在少数正常细胞或细胞类型上表达，甚至更优选地，在这些正常细胞上的表达具有特定的定位，例如，严格处于顶部或在紧密的连接之间，因此，系统性尤其是i. V.施用的结合分子不会或仅仅到达正常细胞上的抗原，甚至更优选地，其在正常上皮细胞上不表达，最优选的是其在正常细胞上不表达。在特定实施方式中，肿瘤特异性糖抗原在表达时可连接于载体分子。这种载体分子具体而言为蛋白质、肽或糖类。“CD176”指的是肿瘤相关的 Thomsen-Friedenreich 抗原(TF)。TFWTFa 和 TF β两种形式存在，其可与蛋白质或糖脂相连。Core-I为ニ糖Gali3 l-3GalNAc，其具体而言以α -异构构象的O-糖苷键连接于肿瘤细胞中羟基氨基酸丝氨酸或苏氨酸或蛋白质。Core-I对应TFa结构。而此ニ糖为发现于正常细胞的许多膜糖蛋白上的隐藏的广泛的核心结构，其在肿瘤细胞上的暴露及由此产生的抗原新生限制在少数特异性载体蛋白质上。已经表示CD176表达于多种癌细胞表面上，如乳腺癌(Imai等人，2001 ；Goletz等人，2003)、结肠癌(Cao等人，1995)、肝细胞癌(Cao等人，1999)、数种白血病(Cao等人，2008)以及其他类型的癌上。作为功能性分子实体，癌细胞表面上的CD176參与细胞的侵入和转移特性(Cao等人，1995)。此后，术语CD176优选地指肿瘤特异性core-1结构Gal β l_3GalNA α 1_0_。“⑶175”指的是Tn抗原，其为具有GalNAc α 1-0-结构的肿瘤相关糖抗原。其在高比例的情况下表达于大多数上皮癌及数种白血病中。其还在一定程度上表达于良性肿瘤。CD 175为肿瘤特异性抗原。“⑶175s”指的是s-Tn抗原(也称为唾液酸化-Tn或TAG-72)，其为具有NeuAca 2_6GalNAca 1-0-结构的肿瘤相关糖抗原。其在高比例的情况下表达于大多数上皮 癌及数种白血病中。“CD173”指的是血液O型抗原(也称为2型H)，其为具有Fuca l-2Gali3 l-4GlcNAci3 I-结构的肿瘤相关糖抗原。其表达于红血细胞及血液O型个体的内皮细胞上。其在除了 O型之外的血型的患者中为癌相关抗原。“CD174”指的是路易斯Y抗原(也称为Le Y)，其为具有Fuca l-2Gal^ l-4[Fuca l_3]GlcNAc β I-结构的肿瘤相关糖抗原。CD174在许多上皮癌、数种白血病及造血祖细胞上为肿瘤特异性的。“CA19-9”指的是唾液酸化-Le a 抗原，其为具有 NeuAc a 2_3Gal β 1-3 [Fuc α 1-4]GlcNAc β l-3Gal β I-结构的肿瘤相关糖抗原。其在肠胃及胰腺癌上高度表达而不在乳腺、肾或前列腺肿瘤上表达。“⑶34”，一种膜糖蛋白(105_120kDa)，为熟知的造血祖细胞的标记物。其还表达于大多数白血病细胞上。“⑶44”为具有多种分子量的粘附分子(H-CAM，Pgp-I)。其为细胞表面透明质酸受体，与基质金属蛋白酶相互作用且在细胞迁移中起重要作用。已将CD44描述为乳腺、卵巣、胰腺、前列腺、结肠、胃及其他癌症类型中的癌干细胞标记物(见Li等人，2007及Takaishi等人，2009)。其还为正常多能干细胞的标记物。在一些癌症类型上产生⑶44的剪接变体，如结肠癌上的⑶44v6。“CD133” (prominin, 120kDa)为5次跨膜结构域糖蛋白。该基因编码865氨基酸的糖蛋白，并在整个动物界中保守。已经将其描述为许多癌症类型中的癌干细胞标记物(例如，结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌以及肝细胞癌，以及黑色素瘤和成神经细胞瘤)。“CD164”(MGC_24，24kDa)为造血祖细胞的标记物，也是胃癌的癌干细胞标记物(见Masuzawa 等人，1992)。术语“细胞”和“多种细胞”及“细胞群体”交換使用，具体而言指的是ー种或多种细胞，尤其是哺乳动物细胞。该术语包括细胞或细胞群体的后代。本领域技术人员会认识至IJ“细胞”包括単一细胞的后代，而且由于天然、随机或有意的突变和/或变化，此后代不必(在形态学或总的DNA互补上)与原始亲本细胞完全同一。“有效量”具体而言是足以影响有益的或想要的临床结果的量。有效量可以在一次或多次施用中进行施用。作为活性成分的结合试剂的有效量具体而言为足以诊断、减弱、减轻、稳定、逆转、减缓或延迟疾病状态进展的量。活性成分的毒性和治疗效カ可根据标准制药步骤在细胞培养物和/或实验动物中确定，包括例如确定LD5tl(对50%的群体产生致死性的剂量)以及ED5tl (对50%群体有治疗效应的剂量)。毒性和治疗效应之间的剂量比例为治疗指数，并可表示为LD5tZED5tl比例。表现出大的治疗指数的结合试剂是优选的。获自细胞培养物和/或动物研究的数据可用于对用于人的剂量范围进行配制。活性成分的剂量一般在循环浓度的范围内，其包括低毒性的ED5tlt5剂量可根据所使用的剂型以及所应用的施用途径在所述范围内变动。发明详述
本发明是基于肿瘤相关糖抗原表达于癌干细胞上并因此作为癌干细胞标记物这一发现。此发现很出乎意料，因为迄今所描述的癌干细胞标记物几乎都是蛋白质。因此，本发明涉及肿瘤相关的糖抗原，优选的肿瘤特异性糖抗原作为癌干细胞标记物的用途，所述肿瘤特异性糖抗原优选地选自CD176、CD175、CD175s、CD174、CD173和CA19-9，更优选地选自 CD176、CD175 和 CD175s。根据第一个方面，本发明提供了特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂用于处理表达所述肿瘤相关糖抗原的癌干细胞的用途。本发明人显示了数种肿瘤相关糖抗原如⑶176、⑶174和⑶173表达于癌干细胞上并因此成为新型癌干细胞标记物。鉴定肿瘤相关糖抗原作为癌干细胞标记物提供了用于特异性结合肿瘤相关糖抗原的试剂的新型治疗应用。特异性结合相应的肿瘤相关糖抗原的试剂现在可以治疗性地应用于靶向表达所述癌干细胞肿瘤相关糖抗原的癌干细胞。这提供了靶向并优选地杀死癌干细胞的治疗性处理的机会。相应的治疗试剂可例如用于靶向并因此破坏对常规化疗有抗性的癌干细胞。因此，本发明提供了改善的癌症疗法。根据ー个实施方式，肿瘤相关糖抗原主要地或甚至专门地表达于癌干细胞上。根据另ー个实施方式，肿瘤相关糖抗原表达于癌干细胞以及并非是癌干细胞的癌细胞上。如果肿瘤相关糖抗原表达于两种细胞群体上，则此具有优点是用所述特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂靶向两种细胞群体进行处理。这在例如少量但有记载的情况下很重要，这些情况中肿瘤生长期间具有癌干细胞特性的新细胞例如通过上皮-间充质转变(EMT)而发展。根据ー个实施方式，特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂有治疗活性。相应实施方式的ー个实例是使用治疗活性的抗体或者其抗原结合片段或衍生物作为结合试剂。治疗活性的抗体或者其抗原结合片段或衍生物优选地能够诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，其优选地导致靶标细胞的裂解，特别是表达所述肿瘤相关糖抗原的癌干细胞的裂解。根据ー个进ー步的实施方式，特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂起靶向分子的作用并与至少ー种治疗试剂偶联。可通过共价或非共价方式进行偶联。当特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂起靶向分子作用时，其可以自身为治疗活性的或其可能不是治疗活性的。在其不是治疗活性的情况下，其起到分子载体的基础作用，将实际的治疗试剂(如放射性药物、化疗试剂或毒素)带向所需的靶标作用ー侧，即表达肿瘤相关糖抗原的癌干细胞。偶联至特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂的治疗试剂可为例如化疗试剂或其他抗癌药物。所述偶联的治疗试剂优选地破坏或杀死所靶向的癌干细胞或抑制其増殖。这可直接由偶联的治疗试剂完成或间接通过诱导所靶向的癌干细胞和/或待治疗的患者中合适的生物学机制而完成。根据ー个实施方式，肿瘤相关糖抗原选自⑶176、⑶175、⑶175s、⑶174、⑶173和CA19-9。优选地，肿瘤相关糖抗原选自⑶176、⑶173、⑶174和⑶175或⑶175s。在上文中描述了与这些肿瘤相关糖抗原相关的细节。本发明人显示了这些肿瘤相关糖抗原是新颖的并且是合适的癌干细胞标记物。优选地，肿瘤相关糖抗原为肿瘤特异性的。这具有的优点是降低了非肿瘤即非癌细胞受处理所影响的风险。关于优选的肿瘤特异性的细节也在上文描述；參考相应的公开。根据ー个实施方式，癌干细胞是用至少共表达ー种干细胞标记物的所述结合试剂进行处理的，其优选地为糖蛋白。本发明人已经发现肿瘤相关糖抗原如特别是CD176、CD173和⑶174与其他干细胞标记物如⑶44和⑶133共表达，已知这些标记物为癌干细胞标记 物。根据ー个优选的实施方式，处理表达是(糖)蛋白的至少ー种干细胞标记物的癌干细胞，此标记物携帯被结合试剂特异性结合的肿瘤相关糖抗原。在特定实施方式中，结合试剂还结合携带肿瘤相关糖抗原的(糖)蛋白。然而，只有存在肿瘤相关糖抗原时才能发生特异性结合。本发明人已经证明作为癌干细胞标记物的肿瘤相关糖抗原例如CD176经常几乎专门地携带于已知为正常及癌干细胞的标记物如⑶34、⑶44、⑶133、⑶164的蛋白质上和/或携帯于肿瘤相关(糖)蛋白。这表示正常(糖)蛋白干细胞标记物和/或肿瘤相关(糖)蛋白在恶性转化为癌干细胞的其糖基化过程中经历了特征性变化，而致使出现(表达)本文鉴定为癌干细胞标记物的肿瘤相关糖抗原。因此，鉴定肿瘤相关糖抗原为新型癌干细胞标记物提供了用于处理癌干细胞的有用的治疗性靶标。根据ー个实施方式，癌干细胞表达ー种或多种选自⑶34、⑶44、⑶44v6、⑶133和⑶164的干细胞标记物。优选地，所述肿瘤相关糖抗原携带于选自⑶34、⑶44、⑶44v6、CD 133和CD 164的糖蛋白上。例如，已经发现⑶176、CD 175和⑶175s尤其表达于CD44和CD 133 上。根据ー个实施方式，癌干细胞源自为具有ー种或多种以下特征的癌a)其为实体瘤；b)其为白血病；c)其为多发性骨髄瘤或淋巴瘤；d)其为上皮来源的肿瘤；和/或e)其为选自肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巣癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌以及头颈癌的肿瘤。对于此实施方式，其中癌干细胞表达作为肿瘤相关糖抗原的⑶176、⑶175或CD175s,癌干细胞优选地为白血病或形成实体瘤的癌，即，其为除白血病和淋巴瘤之外的癌。优选地，癌为上皮恶化，更优选地选自肺癌、乳腺癌及肝癌。如本文实施例中提供的，⑶176表达于这些癌类型的癌干细胞上。进ー步地，发现⑶176与例如⑶34在白血病上共表达。对于此实施方式，其中癌干细胞表达作为肿瘤相关糖抗原的CA19-9，所述癌干细胞根据本发明的实施方式为形成实体瘤的癌。优选地，所述癌为胃肠癌。根据ー个实施方式，结合试剂特异性结合所述肿瘤相关糖抗原，其为肿瘤特异性糖抗原。优选地，在生理条件下及因此在治疗性应用所述结合试剂的条件下，结合试剂不结合表达于非癌细胞、非肿瘤细胞、良性癌细胞和/或良性肿瘤细胞上的抗原，尤其是糖抗原。使用相应的肿瘤特异性结合试剂具有数种优点。其确保当用于治疗吋，结合试剂只识别并因此只结合靶标细胞以及因此的表达肿瘤特异性糖抗原的细胞而不结合非靶标细胞，具体而言为表达几乎相似抗原(具体而言为糖抗原)的良性或正常细胞。这确保了肿瘤、相应的癌特异性疗法，因此降低了不想要的副作用的风险。合适的肿瘤特异性结合试剂随后描述，具体而言是在其中肿瘤特异性糖抗原为CD176或CD175的实施例中。根据ー个优选的实施方式，特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂，起是抗体或者其抗原结合片段或衍生物。合适的实例在上文及实施例中有描述。根据本发明的用作结合试剂的抗体或者抗体的抗原结合片段或衍生物具有ー种 或多种以下特征a)其介导癌和/或肿瘤细胞尤其是癌干细胞的ADCC和/或⑶C ；b)其诱导和/或促进癌和/或肿瘤癌细胞尤其是癌干细胞的凋亡；c)其抑制靶标癌和/或肿瘤细胞尤其是癌干细胞的増殖；d)其诱导和/或促进癌和/或肿瘤细胞尤其是癌干细胞的细胞吞噬；和/或e)其诱导和/或促进细胞毒性试剂的释放。根据ー个实施方式，CD176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物用于处理表达⑶176的癌干细胞。优选地，所述⑶176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物包含至少ー个互补决定区(⑶R)，其选自具有SEQ ID No. I的氨基酸序列的⑶RHl ;具有SEQ IDNo. 2或3的氨基酸序列的⑶RH2 ；以及具有SEQ ID No. 4或5或6的氨基酸序列的⑶RH3。更优选地，其包含至少两个⑶R，如⑶RHl和⑶RH2、⑶RHl和⑶RH3或⑶RH2和⑶RH3，每ー个具有如上文限定的氨基酸序列。最优选地，其包含所有三个⑶R，即⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，每ー个具有如上文限定的氨基酸序列。备选地，⑶RHl具有SEQ ID NO :14-17中任何一项的氨基酸序列，和/或⑶RH2具有SEQ ID NO: 18-27中任何一项的氨基酸序列。具体而言，这些⑶R存在于⑶176特异性抗体或者其功能性活性片段或衍生物的重链可变区中。CD176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物的重链可变区优选地包含或由SEQ IDNo. 46-79中任何一项的氨基酸序列组成。进ー步地，所述⑶176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物的重链可变区优选地包含至少ー个互补决定区(⑶R)，选自具有SEQID No. 7或8或9的氨基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID No. 10或11的氨基酸序列的CDRL2以及具有SEQ ID No. 12或13的氨基酸序列的⑶RL3。更优选地，其包含至少两个⑶R，如⑶RLl和⑶RL2、⑶RLl和⑶RL3、或⑶RL2和⑶RL3，每ー个具有如上文限定的氨基酸序列。最优选地，其包含所有三个⑶R，即为⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，每ー个具有如上文限定的氨基酸序列。备选地，⑶RLl具有SEQID NO:28-45任何一项的氨基酸序列。具体而言，这些⑶R存在于⑶176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物的轻链可变区中。CD176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物的轻链可变区优选地包含或由SEQ ID No. 80-94中任何一项的氨基酸序列构成。在优选的实施方式中，⑶176特异性抗体包含以下互补决定区(⑶R)组中的ー种
权利要求
1.特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂，用于处理表达所述肿瘤相关糖抗原的癌干细胞。
2.根据权利要求I的结合试剂，其中肿瘤相关糖抗原选自⑶176、⑶175、⑶175s、CD174、CD173 和 CAI9-9
3.根据权利要求I或2的结合试剂，其中癌干细胞具有一项或多项下列特征 a)该癌干细胞表达至少一种干细胞标记物，其为携带所述肿瘤相关糖抗原的糖蛋白； b)该癌干细胞表达一种或多种干细胞标记物，其选自⑶34、⑶44、⑶44v6、⑶133和CD164; c)所述肿瘤相关糖抗原是携带于该癌干细胞所表达的肿瘤相关糖蛋白上的； d)所述肿瘤相关糖抗原为肿瘤特异性的；和/或 e)所述肿瘤相关糖抗原主要或专门地表达于癌干细胞上而不表达于并非癌干细胞的癌细胞上。
4.根据权利要求1-3中任何一项的结合试剂，其中癌干细胞来自具有一项或多项下列特征的癌 a)其为实体瘤； b)其为白血病； c)其为多发性骨髓瘤或淋巴瘤； d)其为上皮来源的肿瘤；和/或 e)其为选自肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌和头颈癌的肿瘤。
5.根据权利要求1-4中任何一项的结合试剂，其中所述结合试剂具有一项或多项以下特征 a)其为抗体或者抗体的抗原结合片段或衍生物； b)其为人、鼠、人源化或嵌合抗体或者相应的抗原结合片段或衍生物； c)其为单链抗体片段、多价抗体、Fab片段和/或IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同种型的免疫球蛋白和/或其亚型； d)其为具有一项或多项下列特征的抗体或者抗体的抗原结合片段或衍生物 i.其介导癌细胞的ADCC和/或⑶C； ii.其诱导和/或促进癌细胞的凋亡； iii.其抑制癌细胞的靶标细胞的增殖； iv.其诱导和/或促进癌细胞的吞噬作用；和/或 V.其诱导和/或促进细胞毒性试剂的释放； e)其特异性结合为肿瘤特异性糖抗原的所述肿瘤相关糖抗原； f)其不结合表达于非癌细胞、非肿瘤细胞、良性癌细胞和/或良性肿瘤细胞上的抗原，尤其是糖抗原；和/或 g)其特异性结合表达于癌干细胞和正常癌细胞上的肿瘤相关糖抗原。
6.根据权利要求5的结合试剂，其中所述抗体或者所述抗体的所述功能活性片段或衍生物选自 a)⑶176特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物，其优选地具有至少一种以下特征 i)其包含至少一个互补决定区(⑶R)，优选地至少两个⑶R，更优选地所有三个⑶R，选自具有SEQ ID No. I的氨基酸序列的CDRHl、具有SEQ ID No. 2或3的氨基酸序列的CDRH2以及具有SEQID No. 4或5或6的氨基酸序列的⑶RH3 ； ii)其包含至少一个互补决定区(⑶R)，优选地至少两个⑶R，更优选地所有三个⑶R，选自具有SEQ ID No. 7或8或9的氨基酸序列的⑶RLl、具有SEQ ID No. 10或11的氨基酸序列的⑶RL2以及具有SEQ ID No. 12或13的氨基酸序列的⑶RL3 ； iii)其包含含有SEQID No. 46-79中任何一项的氨基酸序列的重链可变区； iv)其包含含有SEQID No. 80-94中任何一项的氨基酸序列的轻链可变区； V)其在生理条件下不与 Gal a l-3GaINAc a , Gal a l_3GalNAc ^、GalNAc a、Neu5Ac a 2_3Gal3 l_3GalNAca 、Gal ^ 1 — 3 ( Neu5Ac a 2-6 ) GaINAc a 、GlcNAc P l-2Gal P l_3GalNAc a、GlcNAc a l_3Gal P l_3GaINAc a、GalNAc a l_3Gal P 和 /或3’ -O-Su-Gal ^ l-3GalNAc a特异性地相互作用； b)抗体或者其抗原结合片段或衍生物，其显示了与(a)中限定的抗体有交叉特异性； c)CD173特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物； d)CD174特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物； e)CD175特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物； f ) CD175s特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物；和/或 g)CA19-9特异性抗体或者其抗原结合片段或衍生物。
7.药用组合物，其包含特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂，用于处理表达所述肿瘤相关糖抗原的癌干细胞，其中结合试剂、癌干细胞以及肿瘤相关糖抗原具有如权利要求1-6中任何一项所限定的一项或多项特征。
8.根据权利要求1-6中任何一项的结合试剂或根据权利要求7的药用组合物，用于治疗的用途，以减小肿瘤大小、消除恶性细胞、防止转移、防止复发、降低或杀死扩散的癌、延长存活时间和/或延长肿瘤相应的癌进展时间。
9.一种方法，用于鉴定包含对用特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂的处理易感的癌干细胞的癌，其中所述处理影响癌干细胞，所述方法包括确定获自患者的癌样品是否包含表达该结合试剂特异性针对的肿瘤相关糖抗原的癌干细胞，其中癌干细胞上存在所述肿瘤相关糖抗原表示该癌对用特异性结合所述肿瘤相关糖抗原的结合试剂的处理易感，且其中所述处理影响这些癌干细胞。
10.一种用于对癌进行诊断、分期和/或预后和/或对治疗易感性进行监视的方法，包括分析分离自患者的样品中的细胞上肿瘤相关糖抗原表达的步骤，其中表达肿瘤相关糖抗原的细胞的存在表示所述样品中存在癌干细胞。
11.根据权利要求9或10的方法，其中用特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂对来自所述患者的样品进行染色.
12.根据权利要求9-11中任何一项的方法，其中肿瘤相关糖抗原选自CD176、CD175、CD175s、CD174、CD173 和 CA19-9
13.根据权利要求9-12中任何一项的方法，其中共表达至少一种第二种癌干细胞标记物的细胞的存在表示存在癌干细胞。
14.根据权利要求9-13中任何一项的方法，其中测试了至少一种另外的糖蛋白癌干细胞标记物的共表达，所述标记物选自⑶34、⑶44、⑶44v6、⑶133和⑶164。
15.根据权利要求9-14中任何一项的方法，其中对染色形式的分析提供了癌干细胞的相对分布，此分布情况预测了癌的致瘤性。
16.哺乳动物癌干细胞的组合物，其中组合物中至少50%、优选地至少75%的细胞为表达肿瘤相关糖抗原的癌干细胞。
17.—种试剂盒，用于根据权利要求9-15中任何一项的方法，包含特异性结合肿瘤相关糖抗原的结合试剂及用于根据权利要求9-15中任何一项的方法的说明书。
18.就针对表达肿瘤相关糖抗原的癌干细胞的有效性筛选候选治疗试剂的方法，该方法包括 a)将所述试剂与权利要求16的细胞组合物接触，以及 b )确定所述试剂针对所述肿瘤相关糖抗原阳性的癌细胞的有效性。
全文摘要
本发明尤其与这样的处理方法相关，其基于特异性结合肿瘤相关的糖抗原的试剂用于处理癌干细胞及相关疾病的用途。还提供了使用肿瘤相关的糖抗原作为癌干细胞标记物的诊断及预后方法。
文档编号C07K16/30GK102753199SQ201180006592
公开日2012年10月24日 申请日期2011年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者S·戈勒茨, U·卡斯滕 申请人:葛莱高托普有限公司