授精预测和促进的制作方法

专利名称：授精预测和促进的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及授精，特别是涉及预测授精成功的机会的技术以及提高成功授精的概率的技术。
背景技术：
在世界范围内超过12%的生育人群怀孕困难，受到不育影响的大部分女性年龄在15到44岁之间。不育是这个年龄的女性中最常见的医学的失调。夫妇可以受助于辅助生殖技术，例如，体外授精(IVF)。IVF是一种卵细胞在子宫外体外地被精子授精的过程。当辅助生殖技术的其他方法失败时，IVF是不育症的主要治疗手段。该过程一般涉及激素控制排卵过程、从女性卵巢取出卵子、在流体或培养基中使精子对卵子授精来形成受精卵，受精卵成熟为胚胎。然后将形成的胚胎转移到患者的子宫，以意图建立成功的妊娠。虽然妊娠率即IVF之后的妊娠成功率在最近几年提高了很多，临床的研究报告说在工业国家中，可能在几次试验之后，平均妊娠率达到70%。许多研究致力于再进一步提高这种妊娠率的领域。到目前为止的研究提出，例如，通过改善胚胎植入率和降低流产率，几种不同的激素物质被认为提高妊娠率。在美国专利N0.6，649，344中提出了另一种技术。该专利文献公开了一种预测性标志物的分析，来表明在哺乳动物中能够体外成熟(IVM)和随后IVF的非可受精卵的存在。所述分析是基于测定月经周期期间的各个时间血液样品中抑制素A或雌二醇的存在和相对浓度。仍然需要一种技术，其容许鉴定具有成功妊娠的良好或不良概率的那些患者，特别是经历IVF的夫妇，以及一种改善成功妊娠的概率的技术。

发明内容
本发明的一个目的是提供能够鉴定具有成功妊娠的良好或不良概率的受试者的技术。本发明的另一个目的是提供可以用于提高女性成功妊娠的概率的技术。在此公开的实施方式满足了这些和其他目的。简要地，本发明的一个方面涉及预测IVF的结局的方法。所述方法包括测定获自受试者的样品，例如，体液样品、组织样品或卵子样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG (isoformof histidine rich glycoprotein)。然后根据身体样品中发现的亚型富组氨酸糖蛋白HRG的测定，就女性怀孕的概率预测该受试者的IVF的结局。本发明在另一个实施方式中，从样品中提取受试者的DNA。然后对HRG的外显子五的至少一部分进行单核苷酸多态性基因分型。根据基因分型的结果预测IVF的结局。更详细地，如果受试者在HRG基因的外显子五中SNP多态性被测定为Ser/Ser纯合体，就成功妊娠而言的IVF结局被预测为非常低。Pro/Ser杂合体受试者被预测为具有IVF成功妊娠的低概率，而Pro/Pro纯合体受试者被预测为具有IVF成功妊娠的相对提高的或更高的概率。本发明的其他方面涉及预测女性的生殖力状态的方法。所述方法然后涉及测定获自女性的身体的亚型富组氨酸糖蛋白HRG，或对从身体样品提取的DNA上HRG基因的外显子五的至少一部分进行SNP基因分型。所述方法然后根据测定的亚型富组氨酸糖蛋白HRG或根据SNP基因分型预测女性的生殖力状态。本发明的其他方面涉及提高经历IVF的女性的妊娠的成功。方法涉及向包含要体外授精或已经体外授精的卵子的流体或培养基施用脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG、或其包含全长HRG蛋白的氨基酸位置204的脯氨酸残基的氨基酸片段。脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG或其包含全长HRG蛋白的氨基酸位置204的脯氨酸残基的氨基酸片段在此也被用作生殖力促进药物，并可以用于阴道组合物中。本发明的再一方面涉及提高女性，例如经历IVF的女性的妊娠成功的方法。所述方法包括向该女性施用脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG或其包含全长HRG蛋白的氨基酸位置204的脯氨酸残基的氨基酸片段。附图简要说明参考以下的说明和附图，本发明和它进一步的目的和优点可以被更好的理解，在附图中:

图1说明了来自三个不同女性的卵泡液的Western印迹,表明不同的亚型富组氨酸糖蛋白HRG如何在凝胶上迁移。上部的/更大的条带相应于在感兴趣的位置中带有脯氨酸/脯氨酸的亚型(isoform)。下方的/较小的条带表明在感兴趣的位置中带有丝氨酸/丝氨酸的相应于蛋白的亚型。中间加载的样品来自同一位置带有丝氨酸/脯氨酸的杂合的女性。带有脯氨酸/脯氨酸的女性在体外授精之后怀孕，而其他人没有。图2是流程图，说明了根据一个实施方式预测体外授精的结局的方法，包括在蛋白质水平上分析HRG。图3是流程图，说明了根据另一个实施方式预测体外授精的结局的方法，包括在遗传学的水平上分析HRG。图4说明了胚胎的免疫组织化学。(A-C)6细胞胚胎，(D-F)胚囊。利用免疫组织化学，Dapi (蓝色)表明所有核的位置，HRG位置为红色。组合的照片重叠了 DAPI和HRG ；因而，在胚囊中观察到有和没有HRG的核。在胚囊中，在所有细胞的细胞质中以及在某些细胞核中见到HRG。在6细胞胚胎的核中没有见到HRG。图5说明了免疫组织化学染色，其中在㈧子宫内膜，⑶输卵管，(C)子宫肌层，(D)胎盘中检测到HRG，而在(E)阴性对照中没有检出。缩写是:ST =基质细胞，LE =腔上皮，MC =肌细胞，LU =腔，V =血管。褐色反应的出现表示阳性染色。发明详细说明本发明一般地涉及生殖力预测和生殖力促进。本发明的一个方面涉及体外授精(IVF)，特别是涉及预测IVF期间胚胎成功的植入的技术，以及提高IVF成功妊娠概率的技术。其他方面涉及预测女性的生殖力状态，以及提高妊娠成功的技术。本发明在此公开的实施方式基于预示物的发现，其可以用于预测生殖力状态和预测IVF的成功。这种预示物是富组氨酸糖蛋白(HRG)以及编码HRG的基因。
HRG是丰富的多结构域血浆蛋白质，已知结合广泛的配体，包括纤维蛋白原、肝素和血小板反应蛋白。它涉及血管生成，兼具血管生成和抗血管生成性质。它被认为通过阻断血小板反应蛋白的抗血管生成作用，和/或通过结合于血纤蛋白溶酶原或结合于纤溶酶，帮助促进细胞迁移和侵入，而为促血管生成。然而，已经提出HRG的抗血管生成作用受到靶向粘着斑的信号转导的介导，从而中断血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞运动。另一种抗血管生成性质被认为通过阻止成纤维细胞生长因子(FGF)结合细胞外基质和内皮细胞表面来介导。从而这阻止了血管生成生长因子从细胞外基质释放，并且还向内皮细胞发送抗血管生成信号。HRG还涉及纤维蛋白溶解和凝血、补体激活，以及免疫复合物清除。HRG在肝实质性细胞中产生，并已经显示了作为游离蛋白质在血清中、以及在血小板的颗粒体中传输。HRG基因定位于人的染色体3q27上。该基因含有七个外显子和六个内含子。外显子五含有单核苷酸多态性(SNP)，在本领域中标为C/T rs9898，产生脯氨酸(Pro)和丝氨酸(Ser)多态性。这个位置上的丝氨酸引入了共有的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)。N-糖基化位点的引入导致向天冬酰胺(Asn)残基添加额外的糖类基团。作为糖基化的结果，与Pro亚型(isoform)相比，HRG的Ser亚型(isoform)的分子量稍微更高。这意味着来自受试者的HRG的特定亚型(isoform)可以通过分析HRG的分子量来测定。例如，当进行Western印迹分析时,有可能区分不同的亚型HRG,其分别表现为75kDa(Pro亚型)和77kDa(Ser亚型)条带。以下的序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)说明了 HRG基因的外显子5的核苷酸序列的一部分和相应的氨基酸序列。C/T rs9898多态性根据序列是明显的，产生在相关位点的脯氨酸(密码子CCC)或丝氨酸(密码子TCC)。...GTG CGG AAC TGC [C/T]CC AGA CAC CAT TTC...Val Arg Asn Cys Pro/Ser Arg His His Phe...
在Hermann等人的文献中，在ECHM研究中富组氨酸糖蛋白Prol86Ser多态性与心肌梗塞不相关，Thromb Haemost, 1998, 79 (2) =359-361, HRG的这种多态性一般表示为Prol86Ser，表示相关的氨基酸残基是HRG蛋白质的氨基酸编号186。然而，蛋白质数据库例如uniprot和NCBI，另外地将HRG的氨基酸编号204，S卩，Pro204Ser，作为多态性的相对位置。这种差异的原因是HRG蛋白包含可从蛋白上裂解的信号肽。具有信号肽的HRG带有氨基酸编号204作为多态性的相对位置，而在没有信号肽的HRG中这个多态性位置是氨基酸编号186。然而，在所有这些情况中，相关的Pro/Ser氨基酸和CCC/TCC密码子分别存在于上文提出的HRG蛋白和HRG基因的上下文或座位内。已经进行了研究，其验证了在女性妊娠成功和体外授精成功与亚型HRG和在HRG的上述位置的Pro或Ser的编码HRG的基因变体之间存在显著关联。在下文中，Ser亚型表述被用于表示在上述HRG的氨基酸序列的部分中指定位置处氨基酸为丝氨酸的亚型HRG，而Ρι.ο亚型表示这个位置的氨基酸编号为脯氨酸的亚型HRG。参考图2，因此，一个方面涉及预测女性的体外授精成功、或预测就是否成功妊娠而言的女性的体外受精结局的方法。所述方法任选地包括在步骤SI中从经历IVF的夫妇中的男性和女性的至少一人采集包含HRG蛋白的身体样品。根据这个方面，可以使用包含至少可检测数量的HRG的任何身体样品。这意味着可以使用身体组织样品和体液样品。一般地，体液样品是优选的，因为与身体组织样品相比它们一般更容易采集和操作。根据这个方面可以使用的非限制性的、但优选的体液样品是卵泡液样品、血浆样品和血液样品。根据该方面，获自女性和/或男性的身体样品中存在的亚型HRG在步骤S2中测定。作为选择，或除了测定获自经历IFV的女性和提供精子的男性的至少一人的身体样品的亚型HRG之外，所述精子在体外授精至少一个卵子以形成要植入到女性子宫中的至少一个胚胎，可以就亚型HRG而言研究获自至少一个卵子的样品。因此，除了从女性采集身体样品之外或作为补充，可以使用获自该女性的卵子的样品，或甚至是获自产生的胚胎的样品。如果卵子来自捐赠者而非要植入至少一个受精卵即胚胎的女性，测定来自卵子样品的亚型HRG是特别适合的。然后在步骤S3中根据身体样品和/或卵子/胚胎样品中测定的亚型HRG，预测女性的体外授精的估计的成功，或女性的体外授精的结局。体外授精的成功在此被认为是产生妊娠的体外授精。如果样品至少从女性或卵子采集是优选的，但是优选的从女性或卵子、以及男性都采集。作为选择，样品可以仅从涉及IVF、以及捐献精子用于体外授精女性的卵子的夫妇的男性采集。如在此处更详细地讨论的，Ser亚型为纯合体的女性具有非常低以及接近零的体外授精成功妊娠概率。具有Ser亚型和Per亚型的女性具有稍微更高的产生授精和妊娠的体外受精成功概率，虽然它们仍然是很低的成功率。这应当与Pro亚型为纯合体的女性相t匕，与具有Ser亚型的女性相比其具有显著的更好的体外授精成功概率。预期的是，就女性怀孕而言的IVF成功还取决于供给精子用于体外授精卵子的男性的亚型HRG。如在此进一步公开的，胚胎也产生HRG并认为来自胚胎的HRG对于成功妊娠的概率是重要的。成功妊娠的概率因此取决于胚胎的亚型HRG，其随后取决于提供卵子的女性和提供精子的男性的遗传构成。在优选的实施方式中，(身体)样品中亚型的测定通过估计(身体)样品中HRG的分子量来进行。由于Ser亚型的N-糖基化位点的引入，两种亚型HRG之间存在可检测的分子量差异。因此，根据这个实施方式可以使用可应用于(体液)样品并且能够区分亚型HRG,即，根据Western印迹分析测定的75kDa与77kDa的分子量的任何分子量测定技术。这种简单的具有成本效益和快速的技术是Western印迹,其容许在几小时内测定(身体)样品中的亚型HRG。然而,Western印迹应该仅被看作是可以使用的分子量测定技术的说明性的实例。不一定需要根据分子量测量来测定和鉴定两种亚型HRG。在可选择的方法中，ELISA测试可以用于检测(身体)样品中一种或两种亚型HRG的存在。ELISA测试是基于特异性结合Ser亚型但不结合Pro亚型的抗体、特异性结合Pro亚型但不结合Ser亚型的抗体，或优选的特异性结合Ser亚型但不结合Pro亚型的抗体以及特异性结合Pro亚型但不结合Ser亚型的抗体。在前两种情况中，仅需要使用单次ELISA测试。因此，如果ELISA测试证实了 Ser亚型的存在，预测的IVF成功被设置为低的，S卩，Ser亚型的纯合体或杂合体。如果ELISA测试使用抗体不能测出Ser亚型的存在，女性是Pro/Pro纯合体，因而具有相对更高的预测的IVF成功。如果抗体替换为特异性结合Pro亚型，ELISA没有检测任何HRG的存在，女性被确定为Ser/Ser纯合体，因而具有非常低的预测的IVF成功概率。Pro亚型的检出意味着该女性可能具有高的成功IVF概率(Ρι /Ρι 纯合体)或者低但不是极低的成功IVF概率(pro/Ser杂合体)。虽然优选的是进行两次不同的ELISA测试来验证女性是Ser/Ser纯合体、Pro/Pro纯合体还是Pro/Ser杂合体。例如，在ELISA测试中使用的针对两种不同亚型HRG的单克隆抗体可以根据本领域公知的技术来制造。简要地，单克隆抗体一般通过将骨髓瘤细胞与来自用所需抗原进行免疫的小鼠的脾脏细胞融合来制备。然而，新的进展允许使用兔B-细胞。作为选择可以使用本领域已知的生产抗体的其他技术。实际上，可以用于蛋白质诊断以验证特定亚型HRG存在的任何分析可以根据本发明来使用。当利用分子量测定方法来测定(身体)样品中的亚型HRG时，所述方法优选地涉及测定亚型HRG的75kDa和77kDa的至少一种的存在。在下文中，75kDa亚型表示通过Western印迹测定具有75kDa分子量的亚型HRG，其相应于Pro亚型。相应地，77kDa亚型表示通过Western印迹测定具有77kDa分子量的亚型HRG,其相应于Ser亚型。然后根据75kDa亚型的存在、77kDa亚型的存在，或根据75kDa和77kDa亚型两者的存在来进行IVF成功的预测。如果确定了(身体)样品包含HRG的77kDa亚型，所述预测涉及预测IVF低成功。此外，如果(身体)样品包含75kDa和77kDa亚型两者，IVF的成功概率被确定为是低的，而如果(身体)样品仅包含77kDa亚型，概率被预测为是非常低的。仅具有HRG75kDa亚型的相应(身体)样品的受试者被预测为具有相对高的IVF成功概率。在此对 于IVF的成功使用的表述“低”、“非常低”和“高”仅仅作为相对术语来给出，其定义了三种不同类别女性的成功概率如何，即，Ser/Ser纯合体、Pro/Ser杂合体和Pro/Pro纯合体。已经在两项不同的研究中进行了实验结果。在这些研究中，Ser/Ser纯合体女性都没有从IVF怀孕，因而它们被认为具有非常低的IVF成功概率。在两项研究中经历IVF的17%和33%的Pro/Ser杂合体女性怀孕，而57%和70%的Pro/Pro纯合体女性怀孕。低成功机会因而意味着从IVF怀孕的概率低于平均值，高成功机会则意味着妊娠的概率高于人类群体的平均值。IVF成功的预测不一定要在蛋白质水平上基于亚型HRG分析来进行。清楚地对比，SNP基因分型可以作为代替用于在DNA基础上进行分析。参考图3，因而另一个方面涉及预测女性的IVF成功、或预测女性的IVF结局的方法，通过在步骤Sll中任选地采集来自经历IVF的女性和/或男性受试者的身体。身体样品可以是身体组织样品或体液样品。实际上，来自包含受试者的DNA的受试者的任何身体样品可以用于该方法中。身体样品优选地是体液样品，例如，血浆或血液样品。作为选择，或另外地，可以使用获自体外授精的一个或更多个卵子的样品。利用本领域公知的技术在步骤Sll中从(身体)样品提取受试者的DNA。从(身体)样品提取DNA的非限制性实例是使用Qiagen提供的DNA提取试剂盒。然后使用步骤Sll中提取的DNA，在步骤S12中对HRG的外显子五的至少一部分进行SNP基因分型。对于在HRG基因的外显子五中存在的C/T rs9898多态性，SNP基因分型特别验证HRG的特定核苷酸序列。经历IVF的女性的IVF的成功和IVF的结局，即，怀孕的概率根据步骤S13中的SNP基因分型来预测。与上文连同图2讨论的和在蛋白质水平上进行的方法类似地，上文公开的基于核苷酸的分析可以对涉及IVF的女性、男性或女性和男性两者来进行。此外，或作为选择，基于核苷酸的分析可以对卵子或授精后产生的胚胎来进行。如本领域公知的，SNP基因分型涉及能够测定特定座位处单个碱基对突变的技术。各种技术可以用于进行SNP基因分型，以测定受试者在HRG的相关位置上对于脯氨酸或丝氨酸是杂合体还是纯合体。可以使用的非限制性的技术包括以下的。通过特别工程化的单链寡核苷酸探针的方式，在SNP检测中使用动态等位基因特异性杂交(DASH)和分子信标。如果分子信标被设计以匹配野生型等位基因(...AACTGCCCCAGACAC.)，另一个以匹配等位基因的突变体(...AACTGCTCCAGACAC...)，两者可以用于鉴定个体的基因型。如果在分析期间仅检测到第一探针的荧光波长，则受试者对于野生型是纯合的。如果仅测出第二探针的波长，受试者对于突变体等位基因是纯合的。最后，如果检测到两种波长，受试者是Ser/Pro杂合体。可以使用的进一步的技术包括SNP微阵列，其中探针在小的芯片上排列。基于酶的方法也可以使用，包括限制性片断长度多态性(RFLP);基于PCR的方法，例如，四引物ARMS-PCT ;基于flap核酸内切酶(FEN)的方法；引物延伸；用于SNP基因分型的Taqman分析；寡核苷酸连接酶分析。进一步的技术包括单链的构象多态性；温度梯度凝胶电泳(TGGE);变性高效液相层析法(DHPLC);高分辨率熔化分析和Applied Biosystems出售的 SNPIexsold。进行SNP基因分型以确定受试者的HRG等位基因。这意味着进行SNP基因分型以验证受试者是具有核苷酸胞嘧啶(C)以形成编码脯氨酸的密码子CCC的等位基因，还是具有核苷酸胸腺嘧啶(T)而不是C以形成编码丝氨酸而不是脯氨酸的密码子TCC的等位基因。如上文已经彻底讨论的，T等位基因纯合体的女性具有非常低的成功IVF概率，C/T杂合体女性具有低概率的成功IVF，C/C纯合女性具有相对高的成功IVF概率。还可能的是对HRG的外显子五，或HRG基因中包含相关等位基因座位的外显子五的至少一部分进行测序。测定的核苷酸序列用于推断受试者是T等位基因的纯合体、C等位基因的纯合体还是杂合体，即，在染色体3中的一个的座位上包含T等位基因和另一个染色体3的座位上的C等位基因。HRG不仅仅是IVF中妊娠结局的标志物或预示物。在此呈现的实验数据进一步支持了 HRG可以用作标志物或预示物，用于预测一般女性的生殖力状态。在一个方面中，该方法涉及测定获自女性的身体样品中亚型HRG。身体样品可以是任何早先讨论的身体样品。然后根据测定的亚型HRG预测女性的生殖力状态。然后可以利用HRG亚型来预测女性是否具有弓I起提高的流产概率的异常或受损的生殖力状态的风险。例如，在早期妊娠中，仅存在亚型HRG的77kDa在习惯性流产的组中是更常见的，也称为复发性流产或复发性妊娠失败(RPL)。然后根据如上所述的身体样品中亚型HRG的75kDa和/或77kDa的存在，进行生殖力状态的预测。特别地，根据获自女性的身体样品中亚型HRG的77kDa的存在，优选地根据亚型HRG的77kDa的存在但亚型HRG的75kDa的缺乏，女性被预测为具有异常的或受损的生殖力状态，例如，具有增加的习惯性流产风险。相应地，根据身体样品中亚型HRG的77kDa的缺乏但亚型HRG的75kDa的存在，女性被预测为具有正常的生殖力状态。
根据这个方面的亚型HRG的测定可以按照上文描述的预测经历IVF的女性妊娠结局的相同方式来进行。女性的生殖力状态的预测不一定根据亚型HRG来进行，而是代之以通过提取获自女性的身体样品的DNA来进行。对提取的DNA上HRG基因的外显子五的至少一部分进行如上文讨论的SNP基因分型，根据SNP基因分型预测女性的生殖力状态。在一个实施方式中，如果外显子五的至少一部分的核苷酸序列具有C/T rs9898多态性的T等位基因，特别是对于T等位基因是纯合的，女性被预测具有异常或受损的生殖力状态，例如，具有增加的习惯性流产风险。相应地，如果外显子五的至少一部分的核苷酸序列具有c等位基因，优选地对于C/T rs9898多态性的C等位基因是纯合的，女性被预测具有正常的生殖力状态。提取身体样品的DNA和进行SNP基因分型可以如早先描述的进行。在此呈现的实验数据表明，HRG的Pro亚型的存在看起来对于通过IVF方式成功妊娠是关键的，或至少是非常重要的。因而一个方面涉及提高经历IVF的女性的妊娠成功的方法。所述方法则涉及向含有要体外授精以得到一个或更多个胚胎的卵子的培养基施用HRG的Ρι.ο亚型或其氨基酸片段(肽)。在此进一步描述的氨基酸片段包含全长HRG蛋白中氨基酸编号204的脯氨酸残基。这意味着通过向培养基添加Pro亚型，在体外授精之前、期间或之后，卵子暴露于HRG的Ρι.ο亚型或含有Pro的氨基酸片段。在优选的实施方式中，HRG的Pro亚型或氨基酸片段优选地在卵子的体外授精之前和/或期间添加到流体或培养基中。在这个方面的特定实施方式中，提供卵子的女性以及提供精子的男性的至少一人被确认为是Pro/Ser杂合体或Ser/Ser纯合体。在实施方式的一个方面中，HRG的Pro亚型或对应于HRG蛋白质的包含氨基酸编号204的氨基酸Pro的片段被用作生殖力促进物质。所述肽优选地包含至少10个氨基酸，优选地至少14个氨基酸。优选的这样的肽或含有构成HRG的14氨基酸片段的Pro的氨基酸片段的实施方式是 Phe-Ser-Val-Arg-Asn-Cys-Pro—Arg-Hi s-Hi s-Phe-Pro-Arg-Hi s (SEQ ID NO:9) ο在这个肽序列中，相应于HRG中氨基酸编号204的脯氨酸的相关的脯氨酸残基以粗体表不。在进一步的实施方式中，所述肽优选地包含至少15个氨基酸，更优选的至少20个氨基酸，例如，至少25个氨基酸，至少30个氨基酸或更优选的至少35个氨基酸。所述肽优选地具有与HRG蛋白质的片段相同的氨基酸序列，并包含位置204的氨基酸Pro。脯氨酸残基优选地在肽的中央。所述肽不一定具有与HRG蛋白的相应部分的100%同源性。实施方式还涵盖了与HRG蛋白具有至少80 %、优选地至少85 %、更优选的至少90 %或至少95 %同源性的肽。然而，所述肽包含脯氨酸，优选地靠近肽序列的中央，虽然一个或几个其他氨基酸可以不同于HRG蛋白的氨基酸序列。已经测试了具有氨基酸序列Arg-Gly-Gly-Glu-Gly-Thr-Gly-Tyr-Phe-Val-Asp-Phe-Ser-Val-Arg-Asn-Cys-Pro-Arg-His-His-Phe-Pro-Arg-His-Pro-Asn-Val-Phe-Gly-Phe-Cys (SEQ ID NO:7)的肽，可以用作根据该实施方式的生殖力促进试剂。—个方面涉及包含上文定义的肽的分子，用于制造生殖力促进药物。所述分子优选地是SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:7中限定的肽，或包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在特定的实施方式中，所述分子是脯氨酸亚型HRG，或包含上述信号肽的脯氨酸亚型HRG，或没有信号肽的脯氨酸亚型HRG。进一步相关的方面是提高妊娠的成功或促进女性的生殖力的方法，包括向所述女性施用如上所述的分子。所述方法优选地包括向所述女性施用SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:7中限定的、或包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的分子。在特定的实施方式中，所述分子是脯氨酸亚型HRG (有或者没有信号肽)。如果女性正经历IVF，所述分子可以在胚胎植入女性的子宫之前、期间和/或之后向所述女性施用。在特定的实施方式中，至少在受精卵植入女性的子宫之前，分子优选地意图被施用给女性。优选地在胚胎植入之前通过将所述分子，例如，HRG的Ρι.ο亚型注射到女性的子宫内膜来进行。可选择的或另外的施用位点可以是通过宫颈到子宫的腔内。这个方面还可以与向包含卵子/胚胎的介质施用分子，例如，HRG的Pro亚型来组合。在特定的实施方式中，如果女性和贡献精子来为女性的至少一个卵子体外受精的男性中的至少一人对于丝氨酸亚型HRG是杂合体，或优选的是纯合体，如上所述的分子例如Pro亚型的施用是特别有效的。所述分析，即，HRG的肽或PiO亚型优选地作为阴道组合物提供，其包含HRG的肽或Pro亚型以及适用于阴道内施用的至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。通常适合用于阴道内施用的几种类型的制剂，包括阴道的片剂、硬胶囊和软凝胶胶囊、乳膏剂、凝胶、栓剂、阴道栓剂、泡沫、软膏剂、薄膜、卫生棉条、阴道环、灌洗液和溶液。制剂有益地是阴道胶囊剂、片剂或插入物，阴道凝胶或乳膏剂或阴道溶液的形式。适合的药学上可接受的载体或赋形剂的实例可以选自Garg et al., Compendiumof Pharmaceutical Excipients for Vaginal Formulations, PharmaceuticalTechnology Drug Delivery 2001, pages 14-24 中列出的赋形剂。还可以或作为选择可能的是筛选HRG产生的胚胎。胚胎产生的特定亚型则确定了分子例如HRG的Pro亚型是否应当施用到包含胚胎的流体或培养基中，和/或施用给将植入胚胎的女性。因而，如果胚胎产生了单独的或与Pro亚型一起的HRG的Ser亚型，分子例如HRG的Pro亚型向培养基和/或向女性的施用应当启动。这些方面中采用的HRG的Pro亚型优选地是人HRG的Pro亚型，更优选地是重组的人HRG的Pro亚型。可以选择添加到培养基或施用给女性的分子例如HRG的Ρι.ο亚型的浓度，以处于人类女性人口中正常的HRG的浓度范围内。这种浓度范围可以使用本领域公知的技术由本领域的技术人员非发明性地确定。进一步的方面还涉及分子例如HRG的Ρι.ο亚型作为药物或药剂用于治疗中。特定的方面涉及分子例如HRG的Ρι.ο亚型，用于提高女性的妊娠的成功，特别是经历体外授精的女性，以及特别是所述女性和/或贡献精子的男性是HRG的Pro/Ser杂合体或Ser/Ser纯合体。进一步特别的方面涉及分子例如HRG的Pro亚型用于制造药物的用途，所述药物用于提高这样的女性的妊娠的成功。实骀为了分析在生育/不育症中HRG的重要性,来到Akademiska sjukhuset, Uppsala的生殖中心的24名女性被要求参与到研究中。采集和冷冻来自卵巢和血浆的卵泡液。进行Western印迹，我们发现全长两种亚型HRG对应于分子量75kDa和77kDa。根据分析的样品，4名女性看起来是Ser/Ser的纯合携带者,其凝胶上仅一条分子量77kDa的条带。6名女性是杂合的携带者，其凝胶上有两个条带(脯氨酸/丝氨酸)，14名女性仅有较小的蛋白质，表明她们对于脯氨酸/脯氨酸是纯合的。该研究由Uppsala的医学学院的地区伦理委员会批准，从在研究中包括的每个患者处得到了告知同意。对参与的患者没有进行补偿。所有的研究患者被包括在瑞典Uppsala的Uppsala大学医院的妇幼健康学院中。良好调节的血管生成对于适当的胚胎植入、胚胎发育和妊娠发展是重要的。监视女性生殖道和早期胚胎中血管生成调节物的存在和分布，对于更好地理解生育力、胚胎发育和妊娠的分子问题是重要的。HRG是涉及血管生成的糖蛋白。早先没有研究它在女性生殖道或在胚胎中的存在。卵泡液、培养基和胚胎获自经历IVF的患者。来自内生殖器和胎盘的活检物在手术时采集。通过免疫组织化学和Western印迹研究HRG的存在。使用PCR来测定组织中或胚胎的HRG表达。我们在卵泡液、女性生殖道和胎盘以及在胚胎中鉴定出HRG。此外，在胚囊中观察到HRG表达。因此，HGF的血管生成性质看起来影响生育力。卵泡液、培养基和胚胎的采集从经历了用于IVF的控制性超排卵的夫妇中采集卵泡液、培养基和胚胎。在卵细胞获取的同一天采集血浆样品。在卵细胞获取时，采集50mL的卵泡液到离心管(Falcon，NJ，USA)中，对每个患者单独地集中。小心避免血液污染。样品暂时冷冻在_20°C，每周移到-70°C冷冻器中。用于胚胎培养的培养基(CCM, Vitrolife, Kungsbacka, Sweden)在四个样品中集中。三个样品分别含有胚胎培养5天、6天或7天的培养基。这些样品包括培养基，在其中生长了相同数量的发育阻滞的胚胎。第四个样品是仅从胚囊培养物收集的培养基。在每个样品中，对来自六对到十对夫妇的胚胎集中培养基。培养基在_20°C冷冻一周。在第2天或第3天对于胚胎移植或低温保存质量不够的人类着床前胚胎根据常规方案培养在培养基(G-l PLUS/G-2 PLUS, Vitrolife AB, Kungsbacka, Sweden)中。从 2细胞期到孵化的胚囊的各个阶段收获它们，用于免疫组织化学。输卵管、子宫内膜、胎盘和子宫肌层的活检物的采集在腹腔镜灭菌下，从健康的女性志愿者通过刮除术采集输卵管和子宫内膜活检物。使用的输卵管处于月经周期的卵泡、排卵后和黄体期。在排卵后六天采集子宫内膜样品。子宫肌层的活检物和胎盘样品在正常的健康妊娠进行剖腹产后直接采集。组织样品在生理盐溶液(NaCI 9mg/ml)中清洗，固定在4%多聚甲醛中达24小时，保存于70 %乙醇中数周，直到根据常规程序包埋在石蜡中。卵泡液的Western印迹使用4-12%梯度 Bis-Tris NuPAGE(NP0321, Invitrogen, CA, USA))分离样品，对于还原条件，添加商业上可获得的还原剂(NP0004, L1-COR, Invitrogen, CA, USA)。分离的蛋白质样品转移到为低背景荧光优化了的Immobilon-FL膜(IPFL00010，MillipOre Corp,USA)上，用封闭缓冲液(927-40000，L1-Cor Biosciences, UK)孵育。用针对HRG的富含His/Pro 结构域的抗 HRG 抗体(HRG-0119, Lena Claesson-ffelsh, Department of MedicalGenetics and Pathology, Uppsala University, Uppsala, Sweden)进行 Western 印迹。免疫反应性位点使用Odyssey红外成像系统(Westburg)通过突光标记的抗兔IRDye800抗体(611-732-127/Rockland, USA)检测。在Western印迹分析中检测到全长两种亚型HRG，相应于75kDa和77kDa分子量的条带，参见附图1。对于来自24名女性的卵泡液样品，四份具有单一的77kDa条带(Ser/Ser纯合体)，六份具有双条带(Pro/Ser杂合体)，14份具有单一的75kDa条带(Pro/Pro纯合体)。因而这个群体的总体Ser等位基因频率是0.29。经历IVF的24名女性中，九人怀孕。这些孕妇中Ser等位基因频率显著更低。仅一名女性是Pro/Ser杂合体,其他八名怀孕女性是Pro/Pro纯合体。这意味着仅0.06的Ser等位基因频率。此外，单个Pro/Ser杂合体女性的妊娠由于胎儿具有致死的畸形而不得不停止。经IVF治疗没有怀孕的15名女性的四名是Ser/Ser纯合体，六名是Pro/Ser杂合体，仅五名是Pro/Pro纯合体。这得到了 0.43的Ser等位基因频率。怀孕的组和不怀孕的组之间的差异是显著的。Ser/Ser纯合体和Pro/Ser杂合体的组以及Pro/Pro纯合体的组之间的差异也是显著的。下文的表I给出了关于经历IVF的24名女性的卵泡液的HRG中遗传变异的Western印迹数据。表I
权利要求
1.一种预测经历体外授精的女性的妊娠结局的方法，包括: 测定获自所述女性和捐献用于体外授精至少一个卵子以形成要植入所述女性子宫的至少一个胚胎的精子的男性的至少一人的身体样品中的亚型富组氨酸糖蛋白HRG、或者测定获自所述至少一个卵子的卵子的样品中的亚型富组氨酸糖蛋白HRG ;和 基于所测定的亚型富组氨酸糖蛋白HRG预测经历所述体外授精的所述女性的妊娠结局。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，预测妊娠结局包括根据所述身体样品或所述获自所述卵子的样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的75kDa的存在、亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的存在、或根据亚型富组氨酸糖蛋白HRG的75kDa和亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的同时存在，来预测经历所述体外授精的所述女性的妊娠结局。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，预测妊娠结局包括根据所述身体样品或获自所述卵子的所述样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的存在，来预测经历所述体外授精的所述女性低的妊娠成功。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，预测妊娠结局包括根据所述身体样品或获自所述卵子的所述样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的75kDa和亚型富组氨酸糖蛋白HRG77kDa的同时存在，来预测经历所述体外授精的所述女性低的妊娠成功，和根据所述身体样品或获自所述卵子的所述样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的仅77kDa的存在，来预测经历所述体外授精的所述女性非常低的妊娠成功
5.一种预测女性的生殖力状态的方法，包括: 测定犹自所述女性的身体样品中亚型S组氣Ife糖蛋白HRG ;和 根据所述测定的亚型富组氨酸糖蛋白HRG预测所述女性的生殖力状态。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，预测生殖力状态包括根据所述身体样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的75kDa的存在、亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的存在、或根据亚型富组氨酸糖蛋白HRG的75kDa和亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的同时存在，来预测所述女性的生殖力状态。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，预测所述女性的生殖力状态包括根据所述身体样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的存在，来预测所述女性具有异常的/受损的生殖力状态，以及根据所述身体样品中亚型富组氨酸糖蛋白HRG的77kDa的缺乏但亚型富组氨酸糖蛋白HRG的75kDa的存在，来预测所述女性具有正常的生殖力状态。
8.根据权利要求1 7的任一项所述的方法，其中，测定所述亚型包括评估所述身体样品中富组氨酸糖蛋白HRG的分子量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，评估所述分子量包括用Western印迹评估富组氨酸糖蛋白HRG的所述分子量。
10.根据权利要求1 9的任一项所述的方法，其中，测定所述亚型包括测定富组氨酸糖蛋白HRG中具有脯氨酸作为氨基酸编号204的亚型富组氨酸糖蛋白、以及HRG中具有丝氨酸作为氨基酸编号204的亚型富组氨酸糖蛋白的至少一种的存在。
11.一种预测经历体外授精的女性的妊娠结局的方法，包括: 提取获自所述女性和捐献用于体外授精至少一个卵子以形成要植入所述女性子宫的至少一个胚胎的精子的男性的至少一人的身体样品中的DNA、或者提取获自所述至少一个卵子的卵子的样品中的DNA ； 对所述提取的DNA进行富组氨酸糖蛋白HRG的外显子五的至少一部分的单核苷酸多态性SNP基因分型；和 根据所述SNP基因分型预测经历所述体外授精的所述女性的妊娠结局。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，预测妊娠结局包括如果所述外显子五的至少一部分的核苷酸序列具有C/T rs9898多态性的T等位基因，预测经历所述体外授精的所述女性低的妊娠成功。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，预测妊娠结局包括如果所述女性和所述男性的至少一人被测定为对于所述C/T rs9898多态性的所述T等位基因是杂合的，预测经历所述体外授精的所述女性低的妊娠成功，以及如果所述女性和所述男性的至少一人被测定为对于所述C/T rs9898多态性的所述T等位基因是纯合的，预测经历所述体外授精的所述女性非常低的妊娠成功。
14.一种预测女性的生殖力状态的方法，包括: 提取获自所述女性的身体样品的DNA ； 对所提取的DNA进行富组氨酸蛋白质HRG的外显子五的至少一部分的单核苷酸多态性SNP基因分型；和 根据所述SNP基因分型预测所述女性的生殖力状态。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，预测生殖力状态包括如果所述外显子五的至少一部分的核苷酸序列具有C/T rs9898多态性的T等位基因，预测所述女性异常的/受损的生殖力状态。
16.根据权利要求11 15的任一项所述的方法，其中，进行所述SNP基因分型包括测定包含C/T rs9898多态性的所述HRG基因的外显子五的至少一部分的核苷酸序列。
17.根据权利要求1 16的任一项所述的方法，其中，所述身体样品是体液样品。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述体液样品是卵泡液样品、血浆样品或血液样品。
19.一种提高经历体外授精的女性的妊娠成功的方法，包括在至少一个卵子在体外被来自男性的精子授精以形成要植入到所述女性子宫的至少一个胚胎之前、期间或之后，向包含来自所述女性的至少一个卵子的培养基施用包含SEQ ID NO:9所定义的氨基酸序列的分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，施用所述分子包括向所述培养基施用包含SEQID NO:7所定义的氨基酸序列的分子，优选地脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，所述女性和所述男性的至少一人对于丝氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG是杂合体或纯合体。
22.一种包含SEQ ID NO:9所定义的氨基酸序列的分子，用于制造生育力促进药物。
23.根据权利要求22所述的分子，其中，所述分子包含SEQID NO:7所定义的氨基酸序列，优选地脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG。
24.一种阴道组合物，包括包含SEQ ID NO:9所定义的氨基酸序列的分子和至少一种药学上可接受的载体。
25.根据权利要求24所述的阴道组合物，其中，所述分子包含SEQID NO:7所定义的氨基酸序列的分子，优选地脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG。
26.一种提高女性的妊娠成功的方法，包括向所述女性施用包含SEQ ID N0:9所定义的氨基酸序列的分子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，施用所述分子包括向所述女性施用包含SEQID NO:7所定义的氨基酸序列的分子，优选地脯氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中，所述女性经历体外授精，以及施用所述分子包括在胚胎向所述女性的子宫植入之前、期间和/或之后施用所述分子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述女性和男性的至少一人对于丝氨酸亚型富组氨酸糖蛋白HRG是杂合体或纯合体，所述男性提供精子以体外授精所述女性的至少一个卵子以形成所述胚胎。
30.根据权利 要求26 29的任一项所述的方法，其中，施用所述分子包括向所述女性的子宫内膜中注射所述分子。
31.根据权利要求26 29的任一项所述的方法，其中，施用所述分子包括向所述女性的子宫的腔中注射所述分子。
全文摘要
本发明根据富组氨酸糖蛋白(HRG)基因的核苷酸分析或HRG的蛋白质分析，来预测就成功妊娠的概率而言女性的体外授精(IVF)的结局或女性的生殖力状态。脯氨酸亚型HRG或其氨基酸片段可以进一步用于提高女性的妊娠成功。
文档编号C07K14/47GK103189748SQ201180017744
公开日2013年7月3日 申请日期2011年3月30日 优先权日2010年4月1日
发明者卡琳·科勒赫德, 海伦娜·阿克鲁德 申请人:卡罗林斯卡学院创新有限公司