用于治疗和/或防止动脉粥样硬化的包含抗原apob-100蛋白片段和蛋白载体的融合蛋白...的制作方法

文档序号:3586609阅读:493来源:国知局
专利名称:用于治疗和/或防止动脉粥样硬化的包含抗原apob-100蛋白片段和蛋白载体的融合蛋白 ...的制作方法
技术领域
本发明涉及治疗和/或预防动脉粥样硬化的融合蛋白及相关的组合物、方法和系统。
背景技术
目前动脉粥样硬化被看做是脂质-相关的和免疫-介导的动脉壁的慢性炎症性疾病。已鉴定出参与在动脉粥样硬化形成中的许多免疫组件并且临床前期研究已产生了有希望的结果,所述结果表明靶向这些组件的免疫调控疗法可减少动脉粥样硬化。

发明内容
本文提供了用于在个体中诱导免疫调控应答的方法和系统。在若干个实施方式中,由本发明的方法和系 统诱导的免疫调控应答与关于个体的动脉粥样硬化或其关联病况的疗治和/或预防作用关联。根据第^-个方面,描述了融合蛋白。融合蛋白包含apoB-100蛋白的抗原片段或其衍生物和蛋白载体,所述抗原片段和载体以片段:载体为1:1的摩尔比包含在能诱导抗原特异性调节性T细胞的融合蛋白中,所述抗原特异性调节性T细胞对apoB-100的抗原片段是特异性的。根据第二个方面,描述了治疗和丨或预防个体中的动脉粥样硬化的方法。方法包括给个体施用有效量的本文描述的融合蛋白,所述有效量在个体中引起抗原特异性Treg免疫调控应答,该抗原特异性Treg免疫调控应答对apoB-100的抗原片段或其衍生物是特异性的。根据第三个方面,描述了组合物。组合物包含本文描述的融合蛋白以及佐剂和/或赋形剂。在若干种实施方式中,佐剂和/或赋形剂是药物上可接受的且组合物是药物组合物。根据第四个方面,描述了生产融合蛋白的方法。方法包括使apoB-100的片段或其衍生物与合适的蛋白载体轭合以提供能诱导抗原特异性调节性T细胞的融合蛋白,抗原特异性调节性T细胞对apoB-100的片段或其衍生物是特异性的。根据第五个方面,描述了诱导抗原特异性调节性T细胞的方法。方法包括在允许诱导T调节性应答的条件下使调节性T细胞与本文描述的融合蛋白接触一段时间,其中所述接触导致调节性T细胞的抗原-特异性诱导,所述调节性T细胞对包含在融合蛋白中的apoB-100的片段或其衍生物是特异性的。本文描述的方法和系统可用在有关应用中,在所述应用中,期望个体中的动脉粥样硬化的斑块减少、斑块生长衰减和/或动脉粥样硬化的疗治或预防作用。本发明的一个或多个实施方式的细节在下文的附图和说明书中阐明。其他特性、目标和优势从说明书和附图和权利要求中显而易见。附图简述并入本说明书并构成其一部分的附图阐释了本发明的--个或多个实施方式,并与详细的说明书和实施例部分一起用来解释本发明的原理和实施。

图1显示了关于每周两次鼻内p210-CTB施用12周减少雌性apoev小鼠的主动脉根部中的动脉粥样硬化损伤大小的数据。(A)分别示出了来自三个组的数据:黑环表示来自p210-CTB组的动物,灰色环表示来自OVA-CTB组的动物,白环表示来自对照组的动物。*表示p〈0.05。(B-D)代表性的显微照片显示了来自每一组的油红0染色的主动脉根部切片(50X放大率)。(E)治疗12周后,用CTB融合蛋白的鼻免疫增加了来自apoe 7小鼠的胸主动脉的FoxP3和IL-1OmRNA水平。针对所有三个组的每一感兴趣的基因,示出了基于HPRT表达的mRNA转录物比率。*表示p〈0.05图2显示了诱导apoe+小鼠中的全身体液免疫应答的鼻免疫的数据。(A)小鼠血浆中的IgG-抗-p2 10的滴度;在插图中显示了滴定曲线。(B)来自相同小鼠的血浆中的p210-特异性IgM的滴度。*表示p〈0.05。图3显示了关于鼻免疫改变肺粘膜层中的T细胞亚组组成的数据。对于三个组中每一组的细胞内亚组标记物的流式细胞分析,产生细胞因子的CD4+T细胞占总CD4+T细胞的百分比。(A)干扰素 I ; (B) IL-17 ; (C) IL-4 ; (D)FoxP3。* 表示 p〈0.05。图4显示了关于鼻p210-CTB免疫在脾脏中诱导产生IL-1.0的CD4+T细胞和apoB-100-特异性的Treg的数据。A)针对细胞内IL-10染色的培养的脾脏细胞的流式细胞分析。(B)代表性的流式细胞图。(C)从已用人apoBlOO免疫的apoe+小鼠中产生2.5X105细胞/孔的脾脏效应细胞。刺激指数表示相对于未被刺激的细胞,当用人apoBlOO (20 u g/mL)刺激时,3H胸腺啼淀摄取的比率。每一组的最左边的条中表示单独的效应细胞的增殖。以相对于效应细胞的不同比率表示来自鼻免疫的动物的纯化的CD4+T细胞的加入。*p<0.05。图5显示了关于鼻P210-CTB免疫对动脉粥样硬化损伤大小的保护性作用不取决于T细胞中的TGF-0信号的数据。A)用p210-CTB(黑点)或OVA-CTB(灰点)免疫的apoe+x CD4dnTGFf3 RIItg小鼠的主动脉根部的损伤大小。免疫对IgG类⑶和IgM(C)的P210-特异性抗体滴度的作用。*p〈0.05。图6显示了关于免疫的小鼠中的损伤大小的数据。用P210-CTB(黑条)、OVA-CTB(灰色条)鼻处理的和未处理对照(白条)的apoe+小鼠的主动脉根部中的损伤面积分数。显示了平均值+SD值。*表示p<0.05。图7显示了关于通过FPLC分析的血浆脂蛋白谱的数据。粗线表示免疫组:黑色=p210-CTB’灰色=OVA-CTB,白色显示对照组。细线表示SEM0 CR/VLDL=乳糜微粒/非常低密度的脂蛋白;LDL=低密度脂蛋白;HDL=高密度脂蛋白。图8显示了关于在免疫的小鼠的损伤中的T细胞的数据,特别是apoe+小鼠的主动脉根部的动脉粥样硬化损伤的代表性免疫组织化学染色的数据。箭头表示FoxP3+细胞;它们是直接邻近的切片中的CD4+。图9显示了关于对apoB-100肽的血清IgCil抗体滴度的数据。来自用p210_CTB (黑条)'OVA-CTB (灰色条)处理的apoe+小鼠或对照(白条)apoe+小鼠的血清的ELISA分析。*表示p〈0.05。图10显示了关于对apoB-100肽的血清IgG2a抗体滴度的数据。用p210-CTB (黑条)、OVA-CTB (灰色条)处理的apoe+小鼠或对照(白条)apoe+小鼠。*表示p〈0.05。图11显示了关于免疫的小鼠的血清中的总IgG的数据。用p210-CTB(黑条)、OVA-CTB(灰色条)处 理的apoe'A小鼠或对照(白条)apoe 7小鼠。图12显示了关于免疫的小鼠的血清中的总IgM的数据。用p210-CTB(黑条)、OVA-CTB(灰色条)处理的apoe+小鼠或对照(白条)apoe_7'_小鼠。图13显示了关于免疫后的脾脏中的T细胞亚组的数据。显示了作为三个组中的任一组的每个CD4+T细胞的产生细胞因子细胞的百分比作为细胞内细胞因子表达的流式细胞分析。(A)干扰素-Y ;⑶ IL-17 ; (C) IL-4 ; (D) FoxP3。图14显示了关于对细胞分离的Treg抑制作用的消除的数据。用条(从黑色=p210-CTB组动物、灰色=OVA-CTB组动物和白色=对照组动物中产生)表示来自鼻免疫的小鼠的效应细胞和CD4+T细胞的共培养。当效应细胞和CD4+T细胞在Transwell板中彼此分开培养时,消除了 CD4+T细胞-介导的增殖抑制作用(接触抑制检验)。图15显示了关于来自共培养检验的上清液中的TGF-0和IL-10的细胞因子水平的数据。条纹条表示单独的效应细胞。通过单色条表示来自鼻免疫的小鼠的效应细胞和CD4+T细胞的共培养(从黑色=p210-CTB组动物、灰色=OVA-CTB组动物和白色=对照组动物中产生)。图16显示了关于具有在T细胞上的缺陷型TGFP受体免疫的小鼠中损伤大小的数据。用p210-CTB(黑条)或OVA-CTB(灰色条)鼻处理的apoe+x CD4dnTGFP RIItg小鼠的主动脉根部中的损伤面积分数。显示了平均值土SD值。*表示p〈0.05。图17显示了关于具有在T细胞上的缺陷型TGF P受体的/J、鼠的主动脉中的mRNA水平的数据。实时反转录PCR标准化为apoe+xCDAdnTGF PRIItg小鼠的胸主动脉中的HPRT。值得注意的是,功能性FoXp3+Treg细胞的发展取决于TGFP。因此,关于apoe 7 xCD4dnTGFf3 RIItg小鼠中的FoxP3-表达的细胞的关联性的详细信息需要进一步研究。图18显示了关于用LDL或OVA免疫的小鼠中的针对小鼠LDL的IgG抗体的数据。用小鼠LDL(mLDL)或卵白蛋白(OVA)免疫C57BL/6.J小鼠。用在包覆有小鼠LDL的孔中的血清稀释液,随后用碱性磷酸酶标记的抗-小鼠-1gG进行ELISA。SC,皮下施用;IN,鼻内施用。详细描述本文提供了在若干 种实施方式中适用于针对动脉粥样硬化的免疫保护的融合蛋白、组合物、方法和系统。
本文中使用的术语“融合蛋白”表示通过源自各自蛋白的两种或多种多肽的附着产生的蛋白。特别地,可通过重组DNA技术产生融合蛋白并且融合蛋白典型地用在生物研究和疗法中。还可通过化学共价轭合产生融合蛋白,使用或不用融合蛋白的多肽部分之间的键。本文中使用的术语“附着”或“附着的”,是指通过键合(bond)、连接(link)、力(force)或系结(tie)的连接或联合(uniting)以便将两个或多个组分保持在一起,其包括直接或间接附着,例如第一多肽与第二多肽或材料直接键合的情况,也包括其中在第一多肽和第二多肽或材料之间放置一种或多种中间化合物特别是多肽的实施方式。本文中使用的术语“蛋白”或“多肽”表示包含两种或多种氨基酸单体和!或其类似物的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物(包括全长的蛋白和肽)及其类似物和片段。三个或多个氨基酸的多肽还被称为寡肽。本文中使用的术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指任何二十个天然存在的氨基酸,包括具有非天然侧链的合成氨基酸,也包括D光学异构体和L光学异构体。术语“氨基酸类似物”是指下述氨基酸,其中已用不同的原子、同位素或用不同的官能团替代一个或多个个别原子,但在其他方面与其天然氨基酸类似物相同的氨基酸。特别地,在若干实施方式中,描述了适用于在个体中引起抗原特异性调节性T细胞应答的融合蛋白、组合物、方法和系统。本文中使用的术语“抗原”是指当其被弓I入身体时能刺激免疫应答的任何物质。抗原包含外源性抗原(通过例如吸入、摄入或注入已从外部进入身体的抗原)和内源性抗原或自身抗原(已在身体内产生的抗原)。特别地自身抗原”是这样的抗原,所述抗原尽管是正常组织成分,但其是体液或细胞介导的免疫应答的靶标。示例性自身抗原包含与通过低密度脂蛋白和其成分蛋白Ap0BlOO提供的动脉粥样硬化形成和/或动脉粥样硬化关联的自身抗原。本文中使用的术语“调节性T细胞”或“Treg”表示抑制其他细胞免疫应答的免疫系统组件,并且其包 括表达CD8跨膜糖蛋白的T细胞(CD8+T细胞);表达CD4、CD25和Foxp3的T细胞(CD4+CD25+调节性T细胞);和由技术人员可鉴定的具有抑制功能的其他类型T细胞。Treg包括天然存在的T细胞和体外产生的T细胞二者。使用的术语“抗原-特异性”表示对某些抗原的免疫应答,特别是免疫耐受性,其特征在于对另一抗原基本上较少或没有免疫应答(特别是免疫耐受性)。因此,在适当条件
F对一种或多种自身抗原特异性的抗原特异性调节性T细胞能将对一种或多种自身抗原的特异性免疫应答减到最小,同时对其他抗原或自身抗原的免疫应答基本上较少或没有最小化作用。本文描述了包含与动脉粥样硬化形成和/或动脉粥样硬化关联的自身抗原的融合蛋白和相关方法及系统,所述融合蛋白和相关方法及系统能引起自身抗原特异性Treg应答并在若干种实施方式中可用于治疗和/或预防个体中的动脉粥样硬化或其关联的病况。本文中使用的术语“动脉粥样硬化”表示炎症性病况,特别是其中由于脂肪物质比如胆固醇堆积而导致动脉壁变厚的病况。在一些情况下,用抑制素疗法治疗动脉粥样硬化(I)。在若干情况下,动脉粥样硬化是影响动脉血管的综合征、动脉壁中的慢性炎症性应答,动脉粥样硬化很大程度上归因于巨噬细胞、白细胞的累积并由低密度脂蛋白(载有胆固醇和甘油三酯的血浆蛋白)促成,而没有通过功能性高密度脂蛋白(HDL)充分去除来自巨噬细胞的脂肪和胆固醇(见apoA-1 Milano)。在一些情况下,动脉内D旲中的脂J页存留和修饰引起有自身免疫应答的慢性炎症性过程并发展动脉粥样硬化损伤(2)。已描述了作为对该过程的贡献因素的获得性免疫和天然免疫二者的机制(3-6)。虽然天然免疫的模式识别受体被认为是解释胆固醇摄取的原因并有助于巨噬细胞和内皮细胞的活化,但内膜中的识别低密度脂蛋白(LDL)颗粒的抗原-特异性T细胞提供加速动脉粥样硬化形成的强的促炎症刺激物。动脉粥样硬化通常是指动脉的硬化或堵塞(furring)。其被认为是由动脉内的多个斑块的形成引起的。典型地,对低密度脂蛋白(LDL)的自身免疫应答促进动脉粥样硬化进展(progression),而用LDL的免疫可诱导防止动脉粥样硬化的或致动脉粥样硬化的应答。本文中使用的术语“治疗”(动词或名词形式)表示下述任何行为,所述行为是医药上或手术上对病况的医疗护理的--部分或医药上或手术上对病况进行处理。本文中使用的术语“预防”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为,所述行为减少个体中的来自病况的死亡率或发病率负担。这在第一、第二和第三预防水平下发生,其中:a)第一预防避免疾病发展山)第二预防行为的目标在于早期疾病治疗,从而增加干预机会,以预防疾病进展和症状出现;和c)第三预防,通过恢复功能并减少疾病-相关的并发症来减少已确定的疾病的负面影响。本文中使用的术语“病况”(condition),如其通常所表示的,表示与正常的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)不一致的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分),其中所述正常的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)是与完整的身体、精神和可能地社会福利状态关联的。本文描述的病况包括但不限于病症(disorder)和疾病(disease),其中术语“病症”表示与身体或其任何部分的功能异常关联的活的个体的病况,术语“疾病”表示下述活的个体的病况,其损害身体或其任何部分的正常功能并典型地通过有区别的体征和症状被证明。示例性的病况包括但不限于损伤、失能、病症(包括精神和身体病症)、综合征、感染、个体的反常行为和个体身体或其部分的结构和功能的非典型性变化。本文中使用的关于两个项目的措辞“与…关联的”表示两个项目之间的关系使得第一个项目的发生伴随着第二个项目的发生,其包括但不限于原因-结果关系和体征/症状_疾病关系。本文中使用的术语“个体”表示单个生物体,比如高等动物和特别地脊椎动物(比如哺乳动物),更特别地人类。在若干种实施方式中,通过片段:载体为1:1比例包含直接附着或通过连接器(linker)附着的apoB-100的抗原片段和蛋白载体的融合蛋白,提供抗原特异性调节性T细胞应答的诱导。本文中使用的术语“片段”表示任何长度的多肽的一部分。技术人员知道该术语包括具有对应于讨论的多肽部分的序列的任何来源的肽。Ap0BlOO的抗原片段因此是呈现抗原性质的apoB-100的一部分。本文描述的apoB-100的抗原片段还包括其可能的衍生物。本文中使用的关于第一多肽( 例如,apoB-100抗原片段)的术语“衍生物”,表示结构上与第一多肽相关并通过下述修饰源自第一多肽的第二多肽,所述修饰引入不在第一多肽中存在的特性同时保留第一多肽的功能性质。因此,通过对与不在原始多肽或其部分中存在的其他功能可能或不可能关联的氨基酸序列的修饰,apoB-100的抗原片段的衍生多肽通常与原始多肽或其部分不同。但是apoB-100的抗原片段的衍生多肽保留了与apoB-100或其抗原片段有关的那些抗原性质相当的抗原性质。基于讨论的片段的特异性抗原性质,用在阅读本发明公开后技术人员可鉴定的方法,可检验保留的一种或多种抗原性质。示例性方法包括用候选衍生物使动物(例如小鼠)免疫,测定动物中的对衍生物特异性的抗体产生(例如通过ELISA,比如免疫测定ELISA)并将针对候选衍生物的测定的抗体产生与片段的对应抗体产生比较。测定其他抗原性质的其他方法可由技术人员阅读本发明后确定。本文中使用的术语“蛋白载体”表示运输特异性物质或物质组通过细胞内隔室(compartment)的蛋白或跨越细胞I旲在细胞外液体中(例如在血液中)运输特异性物旗或物质组的蛋曰。不例性载体蛋曰包括霍乱毒素B亚基、亲和素、BTG蛋曰、牛G球蛋曰、牛免疫球蛋白G、牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白、Edestein、来自铜绿假单胞菌的胞外蛋白A、HC(来自巨蟹(crab Paralithodes camtschatica)的血蓝蛋白)、罗曼蜗牛血蓝蛋白(HPII)、人血清白蛋白(IISA)、KTI (来自大豆的Kunits型胰蛋白酶抑制剂)、匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、LPH( 来自美洲鲎的血蓝蛋白)、卵白蛋白、Pam3Cys-Th、聚赖氨酸、猪甲状腺球蛋白(PT G)、纯化的蛋白衍生物(PPD)、兔血清白蛋白(RSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(S TI)、向日葵球蛋白(SFG)和由技术人员可鉴定的其他分子。其他载体包括具有免疫原性活性的分子,所述分子包括细胞因子(比如IL-10、IL12、IL-4IL-16)和转化生长因子^ (TGF运)。在一些实施方式中,在片段的C-端或N-端进行载体附着。在^-种实施方式中,可通过重组DNA技术和相关的方法,比如克隆、嵌合构建体、聚合酶链式反应和由技术人员可鉴定的其他程序,提供作为单个多肽的融合蛋白。在一些实施方式中,使用也由技术人员可鉴定的方法,通过将片段与载体的化学连接进行附着。在一些实施方式中,apoB-100的抗原片段包含人apoB-100 (p210)的氨基酸3136-3155和/或在实施例部分中阐释的从肽中选择的额外片段。特别在一些实施方式中,融合产物的片段部分可包含肽P2、PlU P25、P32、P45、P74、P102、P129、P143、P148、P154、P162、P210、P219、P240 中的一种或多种。更特别地,在^ -些实施方式中,融合产物的片段部分可包含肽P2、P45、P102和P210中的一种或多种。在一种实施方式中,其中融合蛋白的片段部分包含多于一种肽,至少在这些实施方式的一些中,片段部分可在下述构建体中包含高至10种肽,期望所述构建体与那些癌症疫苗或感染性疫苗(比如在其全文通过引用并入本文的(35)中描述的那些)具有类似作用。当阅读本发明后技术人员将能针对期望的免疫原性、预防和/或疗治作用鉴定合适的肽组
—人口 o在一些实施方式中,载体蛋白可包含霍乱毒素B亚基的至少 t 单体,所述霍乱毒素B亚基是通过能结合(例如在肠上皮细胞的表面上的)G:M-1受体的重组五聚体B低聚物形成的。特别地,在一些实施方式中,可通过重组五聚体B低聚物分子的具有近似
11.6kDa分子量的五个相同单体中的至少一个形成载体蛋白。在这些实施方式的一些中,单体紧紧连接进胰蛋白酶抗性五聚体环状结构中,具有近似58kDa分子量。
在^-些实施方式中,使用产生融合蛋白(具有免疫原性肽的单个或多个拷贝)的生物遗传工程改造和当阅读本发明后由技术人员可鉴定的程序,抗原片段可与载体分子附着。在一些实施方式中,使用(用或不用连接基团的)化学共价轭合和当阅读本发明后由技术人员可鉴定的程序,抗原片段可与载体分子附着。在一些实施方式中,融合产物或抗原片段可用在脉粥样硬化的治疗中和/或用于诱导调节性T细胞。在一些实施方式中,通过接种的抗原—特异性免疫调控是用来预防或治疗与动脉粥样硬化形成关联的慢性炎症性疾病的一种方法。在这些情况的^-些中,通过以抗原-特异性方式调动保护性免疫应答,可避免由于对感染的宿主防护的妨碍导致的副作用。示例性方案包括在用LDL、f3 2-糖蛋白-lb或热激蛋白60/65免疫的小鼠和兔中治疗动脉粥样硬化的描述的方案,以及减少高血脂动物中的动脉粥样硬化疾病的肠胃外(7-10)和口服(11-14)免疫。其他方案。在一些实施方式中,可通过若干 不同的机制,比如保护性抗体的产生、致病性T细胞克隆的缺失或失活(无反应性)或通过调节性T细胞(Treg)介导的抑制性细胞免疫的诱导(15-1.6),实现抗原-特异性免疫保护。在这些实施方式的一些中,可进行用免疫显性肽序列的免疫,在若干情况下可替代用LDL颗粒的免疫(17-18)。在一种实施方式中,可进行促进抗原-特异性调节性T细胞的选择性靶向的免疫方案。主要通过免疫途径测定触发的免疫应答的类型。在若干种实施方式中,可 使用各种施用途径(包括皮下、肌肉、肠胃外和全身和粘膜施用比如口服和/或鼻施用),给个体施用本文描述的融合产物或抗原片段。特别地,气道和肠的被覆粘膜含有淋巴组织,当与抗原接触时,引起抗-炎症性、免疫抑制性应答
(19)。呼吸器官和肠粘膜层的不同的免疫特征导致通过鼻途径或口服途径的抗原接触时的保护性免疫类型部分不同(20)。在一些实施方式中,霍乱毒素B亚基(CTB)促进经由鼻和口粘膜层的抗原摄取并诱导保护性免疫(21,22)。在一些实施方式中,在使调节性T细胞活化并使针对Apo B的致病性自身免疫下调的条件下,进行一段时间的载体/佐剂/肽疫苗施用。特别地,在一些实施方式中,通过鼻施用ApoBlOO肽-CTB融合蛋白(p210-CTB),进行融合蛋白施用。在一些实施方式中,用P210-CTB治疗显著减少apoe+小鼠中的动脉粥样硬化并且所述治疗与抗原-特异性Treg活性的诱导关联。在一些实施方式中,用apoB-100融合蛋白的鼻内免疫诱导抗原-特异性调节性T细胞并减少动脉粥样硬化。在若干种实施方式中,与CTB融合的ApoBlOO肽的鼻施用使动脉粥样硬化衰减并诱导调节性Trl细胞,所述调节性Trl细胞抑制对载脂蛋白B-100的T效应物应答。在一些实施方式中,本文描述的融合产物、组合物和/或组合方法可用作诱导防止动脉粥样硬化免疫(包括诱导抗原—特异性调节性T细胞)的新颖策略。特别地,在若干种实施方式中,通过apoB-100的免疫显性肽和免疫调控CTB连接的融合蛋白的鼻施用,我们已经能诱导对apoB-100的防止动脉粥样硬化的免疫应答,所述免疫应答包括扩展抗原-特异性调节性CD4+T细胞并抑制主动脉损伤发展。
在若干种实施方式中,使用LDL免疫的肠胃外或口服途径,用本文描述的融合蛋白、方法和系统对抗原-特异性Treg的诱导提供了动脉粥样化保护。此外,实施例部分中阐释的关于在天然发展动脉粥样硬化并因此在接种时已对斑块抗原(比如LDL颗粒)敏感的apoe+小鼠中的抗原-特异性防止动脉粥样硬化的免疫粘膜层免疫的诱导的结果支持下述结论:在有先前存在的损伤的人中类似的方法被预期可以提供免疫。
在一些实施方式中,本文描述的融合蛋白触发其中防止动脉粥样硬化作用与apoB-100-特异性效应T细胞的Treg抑制的诱导并行的动脉粥样化保护机制,并且增加IL-10+CD4+T细胞。特别地,在一些实施方式中,通过抗原-特异性、IL-1.0+调节性Trl细胞的诱导,用P210-CTB的鼻免疫预防动脉粥样硬化。仅用于指导目的的本文提供的并且不意图被限制的可能的解释是:在若〒情况下动脉粥样化保护不涉及免疫抑制性细胞因子TGF-,因为在于T细胞上缺乏功能性TGF-受体的小鼠中用p210-CTB的鼻免疫也减少动脉粥样硬化。在一些实施方式中,本文描述的融合蛋白提供与在Treg(25)的研究中报道的类似的抗原-特异性以及抗原-依赖性作用。特别地,在一些实施方式中,Treg抑制具有相同的抗原特异性的常规效应T细胞。在一些实施方式中,Treg以抗原 依赖性方式对抗原提呈细胞发挥主要作用。在一些实施方式中,抗原-特异性动脉粥样化保护与通过对P210而不是OVA特异性的Treg的apoBlOO-特异性效应T细胞的抑制是并行的。这些发现支持动脉粥样硬化中的自身抗原-特异性Treg的保护作用。在一些实施方式中,已鉴定出通过抗原接触在外周中诱导Treg的两个主要类型:FoxP3+诱导的Treg(ThS)14和Trl细胞(26)。Trl细胞是FoxP3阴性的、分泌IL-10并被认为当调节的免疫由鼻免疫诱导时发挥主要作用(27)、(28)。在--些实施方式中,其中动脉粥样化保护由鼻免疫诱导并与抑制性T细胞活性和产生IL-10的CD4+T细胞关联,本文描述的融合蛋白的施用与通过P210-CTB的Trl诱导关联。具有抗原-特异性抑制活性的CD4+T细胞得自脾脏——已知的Trl细胞储存器(26)。在一些实施方式中,如通过在鼻免疫的小鼠的主动脉中FoxP3mRNA的增加表示的,施用本文描述的融合蛋白后,F0XP3+Treg可在该模型中促成动脉粥样化保护。在一些实施方式中,这些细胞可不仅直接起控制促炎症效应T细胞的作用而且促进Trl细胞的活化
(19)。在一些实施方式中,其中检测到TGF-13信号取消,Trl细胞不会消减动脉粥样化保护。在一些实施方式中,其中Treg标记物还在OVA-CTB免疫的小鼠中提高,抗原非特异性作用可协同抗原-特异性作用以赋予保护。在一些实施方式中,ApoBlOO肽序列的抗体由鼻免疫诱导,但不会与天然的小鼠LDL颗粒交叉作用。而且,在一些实施方式中,其中颗粒抗体滴度不与损伤大小相关并且在apoB-100-CTB免疫的和OVA-CTB免疫的小鼠之间在脂蛋白谱中没有检测到差异,动脉粥样化保护与免疫调控而不是抗体-依赖性的LDL的消除关联。在一些实施方式中,本文描述的融合蛋白与合适的佐剂和/或赋形剂一起包含在组合物中。本文中使用的术语“佐剂”表示药理或免疫试剂,其改变其他试剂(例如,药物、疫苗)的作用,同时当其自身给出时,其几乎没有(如果有的话)直接的作用。它们通常包括在疫苗中以提高受者对提供的抗原的免疫应答同时将注入的外源材料保持在最小量。佐剂的类型包括:刺激免疫系统并增强对疫苗的应答、而其本身而言不具有任何特异性抗原作用的免疫佐剂。本文中使用的术语“赋形剂”表示用作药物活性成分的载剂的非活性物质。示例性赋形剂可用来增大含有非常有效的活性成分的配方,以允许便利的、准确的剂量。除了它们在单剂量中的用途,赋形剂可在制造过程中使用,以帮助处理有关的活性物质。取决于施用的途径和药物形式,可使用由技术人员可鉴定的不同的赋形剂。
在一些实施方式中,组合物包含与载体分子和可能的毒素/类毒素(破伤风毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚基、以及BSA、HAS、rHSA、KLH、卵白蛋白)融合的apoB-100 (单个或多个拷贝)的选择的(免疫原性)肽片段。在一些实施方式中,佐剂和赋形剂是药物上可接受的并且得到的组合物是药物组合物。在这些实施方式的一些中,药物组合物是疫苗。在一些实施方式中,佐剂是例如通过抗原-提呈细胞促进抗原摄取的、增强抗原的免疫原性的疫苗配方的组分(17,29)。令人感兴趣地,两个研究记录了弗氏完全佐剂在高胆固醇血Idlr+和apoe+小鼠中的防止动脉粥样硬化作用(30-31)。在最近的研究中,铝佐剂的皮下施用显示了在高胆固醇血小鼠中增加抗原摄取和细胞免疫应答活化(32)。在一些实施方式中,在用本文中描述的OVA-CTB免疫的小鼠主动脉中的对apoB-100肽的特异性抗体应答和免疫调控细胞因子谱与此类佐剂作用^-致。这进一步强调了在免疫制剂中使用最佳免疫调控组分的重要性。在若干种实施方式中,通过将LDL蛋白组分载脂蛋白B-100的肽靶向鼻粘膜层来诱导保护性粘膜层的免疫应答,提供防止动脉粥样硬化的疫苗。通过阅读本公开,本领域技术人员可鉴定出涉及实施本文描述的融合产物方法的进一步细节和试剂盒的一般制造和包装,所述方法包括进行所述方法的系统,其可以为部件以及相关组合物的试剂盒形式,所述组合物包括供体、受体、化合物和其他试剂以及组合物的合适的载体、试剂或辅助试剂。
实施例本文描述的融合蛋白及相关的组合物方法和系统在下述实施例中进一步阐释,所述方法和系统通过阐释的方式提供并且不是意图限制。特别地,下述实施例阐释了用包含与CTB融合的人apoB-100 (p210)的氨基酸3136-3155的融合蛋白(也称作p210-CTB)进行的示例性免疫。本领域的技术人员将意识到:针对P210-CTB详细描述的特征对于根据本发明的包含apoB-100的另一抗原肽和载体分子的其他融合蛋白也同样适用。更具体地,在下述实施例中,从与CTB融合的人apoB-100 (p210)15的氨基酸3136-3155中制得重组蛋白——p210-CTB。除了在小鼠中C-末端上2-残基插入之外,该序列与对应的鼠类序列是等同的。作为对照,卵白蛋白的氨基酸323-339与CTB融合(OVA-CTB)。8-周大的雌性apoe+小鼠每周两次接受具有1.5 y G(在15 U L中)p210-CTB或OVA-CTB的鼻喷雾。稍后在12周分析损伤和免疫参数。在另一组实验中,使用相同的方案对apoe+x CD4dnTGF0RII小鼠(23)免疫。所有的实验由Stockholm地区伦理委员会批准。使用标准方案,在主动脉根部的低温恒温切片中分析动脉粥样硬化损伤(24)。通过免疫测定ELISAlb分析对p210和对小鼠LDL颗粒的抗体。如在线增刊(Online Supplement)中描述的进行其他检验。以下述方式分析抗原-特异性Treg活性:用apoB-100对apoe+小鼠皮下免疫以产生效应T细胞。来自这些小鼠的CD4+T细胞接触抗原并且活化记为DNA合成。将来自用P210-CTB鼻内免疫的apoe+小鼠的CD4+T细胞添加至效应T细胞制剂并且Treg活性记做DNA合成的抑制(见在线增刊)。在CD4+T细胞....t进行细胞内染色以表征细胞因子产生和T细胞亚型。关于使用的程序的其他细节和获得的结果在下面报告。实施例1:肽文库的产生通过关注 在LDL中发现的单个蛋白,载脂蛋白B_100(apo B),表征了特异性免疫表位。产生了由长度为20个氨基酸残基的302个肽组成的肽文库,其覆盖全部的人类apoB的4563氨基酸序列。产生的肽具有5个氨基酸重叠,以在中断点上覆盖所有的序列。如下文表2中所示的,从apo B的N-末端开始,肽编号为1-302。
权利要求
1.融合蛋白,其包含 apoB-100蛋白的抗原片段或其衍生物和 蛋白载体, 其中所述抗原片段和所述蛋白载体以I 的片段:载体摩尔比包含在所述融合蛋白中;且 其中所述融合蛋白能诱导抗原特异性调节性T细胞,所述抗原特异性调节性T细胞对所述apoB-100的抗原片段是特异性的。
2.根据权利要求1的融合蛋白,其中所述抗原片段包含选自下述组的一种或多种肽:P2、P11、P25、P32、P45、P74、P102、P129、P143、P1.48、P154, P162、P210、P219 和 P240。
3.根据权利要求1的融合蛋白,其中所述抗原片段包含选自下述组的一种或多种肽:P2、P45、P102 和 P210。
4.根据权利要求1的融合蛋白,其中所述抗原片段包含P210。
5.根据权利要求1至4的任一项的融合蛋白,其中所述蛋白载体选自下述组:霍乱毒素B亚基、亲和素、BTG蛋白、牛G球蛋白、牛免疫球蛋白G、牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白、Edestein、来自铜绿假单胞菌的胞外蛋白A、HC(来自巨蟹 的血蓝蛋白)、罗曼蜗牛血蓝蛋白(HPII)、人血清白蛋白(IISA)、KTI (来自大豆的Kuni ts型胰蛋白酶抑制剂)、匙孔虫戚血蓝蛋白(KL0、LPH(来自美洲鲎的血蓝蛋白)卵白蛋白、Pam3Cys-Th、聚赖氨酸、猪甲状腺球蛋白(PTG)、纯化的蛋白衍生物(PPD)、兔血清白蛋白(RSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)、向日葵球蛋白(SFG)。
6.根据权利要求1至4的任一项的融合蛋白,其中所述蛋白载体是细胞因子。
7.根据权利要求1至4的任一项的融合蛋白,其中所述蛋白载体是霍乱毒素B亚基。
8.治疗和!或预防个体中的动脉粥样硬化的方法,所述方法包括: 给所述个体施用有效量的根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白, 所述有效量在所述个体中引起抗原特异性Treg免疫调控应答, 所述抗原特异性Treg免疫调控应答对所述apoB-1OO的抗原片段或其衍生物是特异性的。
9.根据权利要求8的方法,其中通过口服或鼻或鼻施用途径进行所述施用。
10.根据权利要求8的方法,其中通过皮下施用途径进行所述施用。
11.根据权利要求8的方法,其中通过肌肉施用途径进行所述施用。
12.包含根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白以及佐剂和!或赋形剂的免疫原性组合物。
13.根据权利要求的12的免疫原性组合物,其中所述佐剂和/或赋形剂是药物上可接受的且所述组合物是药物组合物。
14.生产融合蛋白的方法,所述方法包括: 使apoB-100的抗原片段或其衍生物与合适的蛋白载体以1:1的片段:载体摩尔比附着以提供能诱导抗原特异性调节性T细胞的融合蛋白,所述抗原特异性调节性T细胞对所述apoB-100的片段或其衍生物是特异性的。
15.根据权利要求14的方法,其中所述apoB-100的抗原片段包含P2、P11、P25、P32、P45、P74、P102、P129、P143、P148、P154、P162、P210、P219 和 P240 中的一种或多种。
16.根据权利要求14或15的方法,其中所述合适的蛋白载体包含下述的一种或多种:霍乱毒素B亚基、亲和素、BTG蛋白、牛G球蛋白、牛免疫球蛋白G、牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白、Edestein、来自铜绿假单胞菌的胞外蛋白A、IIC (来自巨蟹的血蓝蛋白)、罗曼蜗牛血蓝蛋白(HPH)、人血清白蛋白(HSA)、KU (来自大豆的Kmiits型胰蛋白酶抑制剂)、匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、LPH(来自美洲鲎的血蓝蛋白)卵白蛋白、Pam3Cys-Th、聚赖氨酸、猪甲状腺球蛋白(PTG)、纯化的蛋白衍生物(PPD)、兔血清白蛋白(RSA)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)和向日葵球蛋白(SFG)。
17.根据权利要求14或15的方法,其中所述蛋白载体是细胞因子。
18.根据权利要求14至17的任--项的方法,其中通过生物遗传工程改造进行所述附 着。
19.根据权利要求14至17的任一项的方法,其中通过化学共价轭合进行所述附着。
20.诱导抗原特异性调节性T细胞的方法,所述方法包括使调节性T细胞与根据权利要求I至7的任一项的融合蛋白接触,所述接触在允许T调节性应答的诱导的条件下进行一段时间, 其中所述接触导致对包含在融合蛋白中的所述apoB-100的片段或其衍生物特异性的调节性T细胞的抗原-特异性诱导。
全文摘要
包含apoB-100的抗原片段和合适的载体的融合蛋白及相关的组合物、方法和系统。
文档编号C07K19/00GK103221425SQ201180018092
公开日2013年7月24日 申请日期2011年2月7日 优先权日2010年2月5日
发明者扬·尼尔森, 约兰·K·翰森, 扬·霍姆格伦 申请人:卡迪瓦克斯有限责任公司, 扬·霍姆格伦
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1