使用抗cd200抗体的治疗方法

专利名称：使用抗cd200抗体的治疗方法
技术领域：
本发明的领域为医学、免疫学、分子生物学和蛋白质化学。背景
人CD200蛋白是通常在胸腺细胞(例如T细胞和B细胞)、神经元和内皮细胞上表达的Ia型跨膜糖蛋白。通过与其关联受体⑶200R结合，⑶200蛋白转导可阻抑T细胞介导的免疫应答的免疫调节信号。CD200敲除动物研究以及使用拮抗剂抗CD200抗体和重组⑶200-Fc融合蛋白的实验已证实⑶200蛋白在自身免疫性疾病中和在移植期间是免疫抑制剂。参见例如 Hoek 等(2000) Science 290:1768-1771 和 Gorczvnski 等(1999) J Immunol 1^:1654-1660。CD200和CD200R之间的相互作用导致细胞因子概况改变，并促进TH2 T细胞应答超过ThI应答。(参见例如Kretz-Rommel (2007) J Iimunol178:5595-5605)。概沭
本公开内容至少部分基于本发明人的这样的发现，即将抗CD200抗体给予自身免疫性疾病(自身免疫性溶血性疾病)动物模型导致由动物产生的疾病相关性自身抗体明显降低。给予抗⑶200抗体还导致小鼠中自身抗体产生的发作明显延迟。因为由宿主产生的自身抗体是多种自身免疫性疾病(例如重症肌无力和格-巴综合征(Guillain-Barr6syndrome))的病因或与多种自身免疫性疾病有关，本发明人认为抗CD200抗体可用于治疗患有多种自身免疫性疾病中的任一种的患者。因此，一方面，本公开内容的特征在于用于治疗人的自身免疫性疾病的方法。所述方法包括将足以降低/减少人中与自身免疫性疾病有关的自身抗体的浓度(或自身抗体的产生或表达)的量的抗CD200抗体给予患有自身免疫性疾病的人，从而治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中，给予抗⑶200抗体可降低人血液中的自身抗体浓度达至少10%、20%、50%、75%或超过75%。在一些实施方案中，将抗CD200抗体给予人可完全消除人中可检测的自身抗体。本公开内容的特征还在于用于预防自身免疫性疾病或延迟自身免疫性疾病发作的方法，所述方法包括给予患有自身免疫性疾病的人以下量的抗CD200抗体，从而预防或延迟自身免疫性疾病的发作，所述量足以(i)防止所述人形成、产生或表达与自身免疫性疾病相关的自身抗体，或Qi)延迟所述人形成与自身免疫性疾病相关的自身抗体，或延迟所述人的与自身免疫性疾病相关的自身抗体的产生或表达的发作。又一方面，本公开内容的特征在于用于治疗人的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括以足以在人中保持自身免疫性疾病相关自身抗体的降低的浓度的量和频率，将抗CD200抗体长期给予患有自身免疫性疾病的人，从而治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中，可与在给予抗CD200抗体前自身免疫抗体的浓度相比，以保持自身免疫抗体浓度降低大于10%、20%、50%、75%或大于75%的量和频率，将抗⑶200抗体给予人。本发明人还发现若干生物标志，其证实通过将抗⑶200抗体给予患有自身免疫性疾病的动物在人中发生免疫调节效应。例如，本发明人观察到在将抗CD200抗体给予动物后，动物中若干白细胞和骨髓细胞亚群的浓度降低。本发明人还发现在将抗CD200抗体给予动物后，例如脾中的F4/80+淋巴细胞的浓度增加。虽然本公开内容不受任何特定理论或作用机制的束缚，但本发明人认为针对这些生物标志中的一种或多种的出现监测用抗CD200抗体治疗的患者，实际上可用来确定抗CD200抗体是否能够在该抗体所给予的人中产生免疫调节效应。此外，一种或多种生物标志也可用于鉴定抗⑶200抗体(例如samalizumab (ALXN6000))的剂量——阈剂量，其通过其在人中的免疫调节效应足以达到对所述疾病有临床意义的作用(即足以治疗疾病例如癌症或自身免疫性疾病)。即如工作实施例中所述，抗CD200抗体能够在自身免疫性疾病小鼠模型中降低自身免疫抗体的表达。因此，本公开内容的特征还在于用于治疗人的病症的方法，所述方法包括以这样的量和频率将抗CD200抗体给予有需要的人，所述量和频率足以通过在人中保持一种或多种下列生理状况而治疗所述病症(i)与对照浓度相比，至少一种CD200+白细胞亚群的浓度降低(减少);( )与对照浓度相比，F4/80+细胞浓度增加；和(iii)与对照浓度相比，至少一种骨髓干细胞亚群的浓度降低(减少)。所述病症可以是开业医生合理认为可通过治疗性抗CD200抗体治疗的任何病症。这类疾病包括例如癌症或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，至少一种⑶200+白细胞亚群可以是选自以下的细胞亚群CD3+/CD200+ 细胞、CD45R+/CD200+ 细胞、CD5+/CD200+ 细胞、CD19+/CD200+ 细胞、CD138+/CD200+细胞和⑶200R+/⑶200+细胞。在一些实施方案中，至少一种骨髓干细胞亚群可以是选自以下的细胞亚群⑶200+骨髓细胞、Igk+/⑶200+骨髓细胞、⑶138+/⑶200+骨髓细胞、c_kit+/⑶200+骨髓细胞和c-kit+/⑶ZOO+Zlinv骨髓细胞。在一些实施方案中，F4/80+细胞可以是F4/80+巨噬细胞。在一些实施方案中，至少一种⑶200+白细胞亚群或F4/80+细胞可存在于人的外周血液中。在一些实施方案中，白细胞或细胞驻留于脾中。在一些实施方案中，可以保持人的至少两种或所有三种生理状况的量和频率将抗体给予人。在一些实施方案中，自身免疫性疾病可为溶血性病症或自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，例如医学领域已知的任一种AIHA (见下文)。在一些实施方案中，自身免疫性疾病可选自慢性阻塞性肺病、I型糖尿病、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’s syndrome)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、格-巴综合征(Guillain-Barre syndrome)、IgA 肾病、硬皮病、斯耶格伦综合征(Sj5gren’s syndrome)、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、寻常型天疱疮、类风湿性关节炎、冷凝集素病、抗磷脂综合征、温型自身免疫性溶血性贫血(warm autoimmune hemolytic anemia)、阵发性冷性血红蛋白尿、桥本病(Hashimoto，sdisease)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、肺胆汁性肝硬化(pulmonary biliarycirrhosis)和米勒-费希尔综合征(Miller Fisher syndrome)、。在一些实施方案中，自身免疫性疾病可能是人类癌症的结果或可能与人类癌症相关。癌症可为液体肿瘤例如但不限于慢性淋巴细胞性白血病(例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病)或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，本文所描述的方法可包括将用于治疗自身免疫性疾病或癌症的至少一种另外的治疗剂给予人。本发明人发现将抗⑶200抗体给予动物导致动物脾中的⑶5+细胞(例如⑶5+白细胞)的浓度明显降低。⑶5是一种67 kDa跨膜糖蛋白，由T细胞和B细胞亚群(亦称为“BI 细胞”)表达。参见例如 Holodick 等(2009) Eur J Immunol 39(9) : 2383-2394。BI 细胞主要参与针对感染的宿主防御，CD5+ BI细胞自发地和组成型地表达免疫球蛋白。出处同上。亦已检测到通过CLL细胞进行的⑶5表达。在1992年，Almasri等人报告了⑶5+ CLL细胞表达较低水平的⑶20，其通过流式细胞术测定。Am J Hematol迎:259，261。另参见Marti 等(1992) “CD20 and CD5 expression in B-chronic lymphocytic leukemia (B_慢性淋巴细胞性白血病中的CD20和CD5表达)” Aim N. Y. AcacI Sci 651:480-483。利妥昔单抗是嵌合的单克隆抗CD20抗体，临床上获准用于尤其治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。参见例如 Christian和 Lin (2008) Semin Hematol 45(2) :95_103。利妥昔单抗作为单独的药剂和与例如CHOP方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)的组合两者都有效用于治疗CLL。出处同上。然而，Ennishi等人报告了 CLL细胞的⑶5表达与用组合的RCHOP方案(利妥昔单抗和CHOP方案)治疗的CLL患者中结局差之间的相关性。(2008) Annals of Oncology 19:1921,1924 (图I)。该报告提出存在自利妥昔单抗治疗收到较小益处的患者群，以及可能需要替代疗法。虽然本公开内容不受任何特定理论或作用机制的束缚，但是有可能CD5+ CLL细胞可能至少部分地因⑶20表达减少而对利妥昔单抗治疗不应。本发明人表明，含有抗⑶200抗体的治疗组合物可用于减少动物中的CD5+细胞群，因此认为该组合物特别可用于治疗对用抗CD20治疗治疗不应(例如利妥昔单抗抗性)的CLL患者亚群。因此，本公开内容的特征还在于用于治疗患有癌症或自身免疫性疾病的人的方法，所述方法包括以足以治疗癌症或自身免疫性疾病的量将抗CD200抗体给予患有癌症或自身免疫性疾病的人，其中所述癌症或自身免疫性疾病对用抗CD20治疗剂的治疗有抗性或疑似有抗性或可能变成有抗性。另一方面，本公开内容的特征在于用于治疗患有癌症的人的方法，所述方法包括以足以治疗癌症的量将抗CD200抗体给予患有癌症的人，其中所述癌症对用抗CD20治疗剂的治疗有抗性、疑似有抗性或可能变成有抗性。另一方面，本公开内容的特征在于用于治疗患有癌症的人的另一种方法，所述方法包括鉴定人为患有对用抗CD20治疗剂治疗有抗性的或疑似有抗性的癌症的人；以有效治疗所述癌症的量将抗CD200抗体给予所述人。在一些实施方案中，癌症可包含表达⑶5的癌细胞或由表达⑶5的癌细胞组成。
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在一些实施方案中，将超过I个剂量(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19或20或更多个剂量)的抗⑶200抗体给予人。在一些实施方案中，将超过10 (例如超过15、20、25、30或35或更多)个剂量的抗⑶200抗体给予人。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。实体瘤包括例如肺癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、神经组织癌(例如成神经细胞瘤)、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌和膀胱癌。在一些实施方案中，癌症是液体肿瘤。液体肿瘤包括例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病例如B细胞或T细胞型慢性淋巴细胞性白血病)和多发性骨髓瘤。骨癌包括而不限于骨肉瘤和骨癌。又一方面，本公开内容的特征在于用于治疗患有液体肿瘤的人的方法。所述方法包括以足以治疗液体肿瘤的量将抗CD200抗体给予患有液体肿瘤的人，其中至少一部分的液体肿瘤细胞表达CD5。所述方法可包括确定该部分的液体肿瘤细胞是否表达CD5。另一方面，本公开内容的特征在于用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，所述方法包括鉴定人为患有包含表达CD5的细胞的液体肿瘤的人；并以足以降低人的CD5表达液体肿瘤细胞的浓度的量将抗CD200抗体给予人，从而治疗所述液体肿瘤。另一方面，本公开内容的特征在于用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，所述方法包括将抗CD200抗体和抗CD20治疗剂给予患有液体肿瘤的人，从而治疗所述液体肿瘤,其中在给予所述抗体和药剂之前，至少一部分的液体肿瘤细胞表达CD5。 另一方面，本公开内容的特征在于用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，其中所述方法包括鉴定人为患有包含表达CD5的肿瘤细胞的液体肿瘤的人；并将抗CD200抗体和抗CD20治疗剂给予人，从而治疗所述液体肿瘤。在一些实施方案中，可在给予抗⑶200抗体之前给予抗⑶20治疗剂。在一些实施方案中，所述抗CD200抗体在给予抗CD20治疗剂之前给予。可以同时给予抗CD200抗体和抗CD20治疗剂。可采用相同的给药途径(例如静脉内给药)或不同的途径给予抗体。在一些实施方案中，可将抗⑶200抗体和抗⑶20治疗剂作为与人⑶200和与人CD20结合的双特异性抗体同时给予人。也就是说，给予人的治疗剂具有抗CD200抗体和抗CD20治疗剂两者的性质。在一些实施方案中，双特异性抗CD200抗体/抗CD20抗体是DVD-Ig 抗体。在一些实施方案中，至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%或60%或更多的液体肿瘤
细胞表达⑶5。液体肿瘤可以是例如慢性淋巴细胞性白血病或多发性骨髓瘤。液体肿瘤可以是例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，抗CD20治疗剂是抗CD20抗体例如但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、TRU-015> veltuzumab、奥瑞珠单抗或 AME_133v。在一些实施方案中，抗⑶20治疗剂与毒素缀合。例如，在一些实施方案中，抗⑶20治疗剂是毒素-抗体缀合物。毒素可以是例如小分子药物或毒性多肽(例如蓖麻毒蛋白或肥皂草蛋白)。在一些实施方案中，毒素可为细菌毒素、真菌毒素或植物毒素。在一些实施方案中，毒素可为放射性试剂，例如但不限于9°Y、186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Pb、212Bi、213Bi、123I、125I、131I、mIn、211At、32P、177Lu JSc^5RK1ci9PcU153Sm 或 199Au。在一些实施方案中，毒素-抗体缀合物是9°Y-替伊莫单抗(ibritumomab)或131I-托西莫单抗。
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在一些实施方案中，抗⑶200抗体抑制⑶200和⑶200R之间的相互作用。在本文所述任一方法的一些实施方案中，抗⑶200抗体可含有以下配对的⑶R组包含氨基酸序列GFTFSGFAMS (SEQ ID NO:4)的重链CDRl (HCDRl);包含氨基酸序列SISSGGTTYYLDSVKG (SEQ ID NO:5)的重链 CDR2 (HCDR2);包含氨基酸序列GNYYSGTSYDY(SEQ ID NO:6)的重链 CDR3 (HCDR3);包含氨基酸序列RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:7)的轻链CDRl (LCDRl);包含氨基酸序列RASNLES (SEQ ID NO:8)的轻链⑶R2 (LCDR2);和包含氨基酸序列QQSNEDPRT (SEQ ID NO :9)的轻链 CDR3 (LCDR3)。在本文所述任一方法的一些实施方案中，抗CD200抗体含有以下配对的CDR组包含氨基酸序列GFNIKDYYMH (SEQ ID NO: 10)的HCDRl ;包含氨基酸序列WIDPENGDTKYAPKFQG (SEQ ID NO: 11)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列KNYYVSNYNFFDV (SEQ IDNO: 12)的HCDR3 ;包含氨基酸序列SASSSVRYMY (SEQ ID NO: 13)的LCDRl ;包含氨基酸序列DTSKLAS (SEQ ID NO: 14)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列FQGSGYPLT (SEQ ID NO: 15)的LCDR3。在本文所述任一方法的一些实施方案中，抗CD200抗体含有以下配对的CDR组包含氨基酸序列GFNIKDYYIH (SEQ ID NO: 16)的HCDRl ;包含氨基酸序列WIDPEIGATKYVPKFQG (SEQ ID NO: 17)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列LYGNYDRYYAMDY (SEQ IDNO: 18)的HCDR3 ;包含氨基酸序列KASQNVRTAVA (SEQ ID NO: 19)的LCDRl ;包含氨基酸序列LASNRHT (SEQ ID NO:20)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列LQHWNYPLT (SEQ ID NO:21)的LCDR3。在本文所述任一方法的一些实施方案中，抗CD200抗体含有以下配对的CDR组包含氨基酸序列GYSFTOTIIL (SEQ ID NO:22)的HCDRl ;包含氨基酸序列HIDPYYGSSNYNLKFKG (SEQ ID NO :23)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列SKRDYFDY (SEQ IDNO:24)的HCDR3 ;包含氨基酸序列KASQDINSYLS (SEQ ID NO:25)的LCDRl ;包含氨基酸序列RANRLVD (SEQ ID NO:26)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列LQYDEFPYT (SEQ ID NO:27)的LCDR3。在本文所述任一方法的一些实施方案中，抗CD200抗体含有以下配对的CDR组包含氨基酸序列GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 28)的HCDRl ;包含氨基酸序列GVNPNNGGALYNQKFKG (SEQ ID NO :29)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列RSNYRYDDAMDY (SEQ IDNO:30)的 HCDR3 ;包含氨基酸序列KSSQSLLDIDEKTYLN (SEQ ID N0:31)的 LCDRl ;包含氨基酸序列LVSKLDS (SEQ ID NO:32)的 LCDR2 ;和包含氨基酸序列WQGTHFPQT (SEQ IDNO :33)的 LCDR3。在本文所述任一方法的一些实施方案中，抗CD200抗体含有以下配对的CDR组包含氨基酸序列AFNIKDHYMH (SEQ ID NO: 34)的HCDRl ;包含氨基酸序列WIDPES⑶TEYAPKFQG (SEQ ID NO:35)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列FNGYQALDQ (SEQ IDNO:36)的HCDR3 ;包含氨基酸序列TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO:37)的LCDRl ;包含氨基酸序列STSNLAS (SEQ ID NO: 38)的 LCDR2 ;和包含氨基酸序列RQYHRSPPIFT (SEQ ID NO:39)的 LCDR3。在一些实施方案中，抗CD200抗体和/或抗CD20抗体是IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgM、IgAU IgA2、IgA、IgD或IgE抗体。在一些实施方案中，抗CD200抗体和/或抗CD20抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗⑶200抗体或抗⑶20抗体是选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv片段、微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)或三链抗体(triabody)的抗原结合抗体片段。又一方面，本公开内容的特征在于用于为患有液体肿瘤的患者选择疗法的方法，所述方法包括鉴定患者为患有包含表达CD5的肿瘤细胞的液体肿瘤的患者；并为所述患者选择用于治疗所述液体肿瘤的抗CD200抗体。另一方面，本公开内容的特征在于用于处方开给患有液体肿瘤的患者疗法的方法，所述方法包括鉴定患者为患有包含表达CD5的肿瘤细胞的液体肿瘤的患者；并且处方开给患者用于治疗所述液体肿瘤的抗CD200抗体。抗CD200抗体可为双特异性抗体，例如包含第一抗原结合部位和第二抗原结合部位的双特异性抗体，其中第一抗原结合部位与⑶200结合，第二抗原结合部位与⑶20结合。又一方面，本公开内容的特征在于包含第一抗原结合部位和第二抗原结合部位的双特异性抗体，其中第一抗原结合部位与CD200结合，第二抗原结合部位与CD20结合。双特异性抗体可为例如 IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgA、IgD 或 IgE 抗体。在一些实施方案中，双特异性抗CD200/抗CD20抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或人抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体可用于任何本文所描述的方法(例如治疗癌症或自身免疫性疾病)。又一方面，本公开内容的特征在于(i)编码双特异性抗体的核酸；( )包含所述核酸的载体(例如表达载体)；和(iii)包含所述载体的细胞。另一方面，本公开内容的特征在于用于产生所述抗体的方法，所述方法包括在足以允许在细胞中产生抗体的持续时间和条件下培养所述细胞。所述方法还可包括从细胞或从细胞在其中培养的培养基中分离双特异性抗体的步骤。在一些实施方案中，双特异性抗体是单链双抗体，串联单链Fv片段，串联单链双抗体或包含单链双抗体和免疫球蛋白重链恒定区的至少一部分的融合蛋白。在一些实施方案中，双特异性抗体是双重可变域免疫球蛋白。在一些实施方案中，第一抗原结合部位结合人⑶200蛋白，例如包含SEQ IDNO: 1-3中任一个所示氨基酸序列的人CD200蛋白。在一些实施方案中，第二抗原结合部位结合人⑶20蛋白，例如包含SEQ ID NO:40-42中任一个所示氨基酸序列的人⑶20蛋白。在一些实施方案中，第二抗原结合部位在包含SEQ ID N0:41中所示氨基酸序列的至少一部分(例如至少4个氨基酸)和SEQ ID NO: 42中所示氨基酸序列的至少一部分(例如至少4个氨基酸)的表位上与人CD20蛋白结合。在一些实施方案中，第一抗原结合部位获自samalizumab。在一些实施方案中，第二抗原结合部位获自利妥昔单抗、奥法木单抗、TRU-015> veltuzumab、奥瑞珠单抗或AME-133V。双特异性抗体可与异源部分(例如可检测标记或毒素)缀合或含有异源部分。“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，意指氨基酸的任何肽连接的链，不论长度或翻译后修饰如何。本文所述CD200蛋白可含有或可以是野生型蛋白质，或可以是具有至多 50 个(例如至多 1、2、3、4、5、6、7、8、9，10、12、15、20、25、30、35、40 或 50 个)保守氨基酸取代的变体。保守取代通常包括下列组别内的取代甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。本文所述⑶200蛋白和⑶20蛋白还包括蛋白质的“抗原性肽片段”，其比全长蛋白质短，但仍保持全长蛋白质在哺乳动物中诱导抗原应答的能力的至少10% (例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99. 5%或100%或更多)(见下文“用于产生抗体的方法”)。CD200蛋白或CD20蛋白的抗原性肽片段包括蛋白质的末端及内部缺失变体。缺失变体可缺少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸区段(两个或更多个氨基酸的区段)或非邻接的单个氨基酸。抗原性肽片段的长度可为至少 6 (例如至少 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、
50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200 或更多)个氨基酸残基(例如SEQ ID NO: 1-3中任一个的至少6个连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，人⑶200蛋白的抗原性肽片段的长度为少于225 (例如少于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、
41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、
16、15、14、13、12、11、10、9、8或7)个氨基酸残基(例如少于SEQ ID NO: 1_3中任一个的225个连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，全长CD200蛋白的抗原性肽片段的长度为至少6个，但少于225个氨基酸残基。在一些实施方案中，人CD200蛋白可具有与具有SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所述氨基酸序列的人CD200蛋白有以下同一性或大于以下同一性的氨基酸序列70% (例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)(见下文)。在一些实施方案中，人⑶20蛋白可具有与具有SEQ ID N0:40所述氨基酸序列的人⑶200蛋白有以下同一性或大于以下同一性的氨基酸序列70% (例如 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%)。氨基酸序列同一性百分比(%)定义为在比对序列和引入空位(必要时)以达到最大序列同一性百分比后，与参比序列中的氨基酸相同的候选序列的氨基酸的百分比。为了测定序列同一性百分比目的的比对可以属于本领域技术内的多种方法实现，例如应用可公开获取的计算机软件例如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或 Megalign (DNASTAR)软件。对于测量比对的合适参数(包括在待比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法)，可通过已知方法确定。示例性人CD200蛋白和人CD20蛋白及其抗原性肽片段的氨基酸序列是本领域已知的，并且在下文中给出。本文所用术语“抗体”是指完全或完整抗体分子(例如IgM、IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD或IgE)或其任何抗原结合片段。该术语抗体包括例如嵌合化或嵌合抗体、人源化抗体、去免疫化抗体和完全人抗体。抗体的抗原结合片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F (ab，)2片段。scFv片段是包括scFv得自其中的抗体的重链和轻链可变区两者的单条多肽链。另外，胞内抗体
13(intrabody)、微型抗体、三链抗体和双抗体(参见例如Todorovska等(2001) J IimunolMethods 248(1):47-66 Hudson 和 Kortt (1999) J Immunol Methods 231 (I):177-189 Poljak (1994) Structure 2 (12):1121-1123 Rondon 和 Marasco (1997) Annual Reviewof Microbiology过:257-283，其各自的公开内容均通过引用以其整体结合到本文中)也包括在抗体的定义中，并适用于本文所述的方法。该术语“抗体”还包括双特异性抗体(包括DVD-Ig抗体；见下文)。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆、优选人或人源化抗体。除非另有定义，否则本文所用所有科技术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。万一发生抵触，则以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法与材料，尽管类似于或等同于本文所述方法与材料的方法与材料也可用于实施或测试本文公开的方法和组合物。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用以其整体结合到本文中。本公开内容的其它特征和优势，例如用于治疗利妥昔单抗抗性癌症(例如慢性淋巴细胞性白血病)的方法，根据下面的描述、实施例和随附权利要求书，将是显而易见的。附图
简沭
图I是线图，显示在经抗CD200抗体治疗的具有自身免疫性溶血性疾病的小鼠中抗小鼠RBC自身抗体产生的延迟。Y轴代表在各组小鼠中自身抗体产生的发生率(%)。X轴代表检出各小鼠中存在自身抗体的时间。所评价的7组小鼠包括用大鼠RBC免疫、但未经抗体治疗的小鼠(No Rx);用大鼠RBC免疫并经对照抗体治疗的小鼠(Cntrl Ab);用大鼠RBC免疫并经抗CD200抗体治疗的小鼠(抗体I);用大鼠RBC免疫并经环孢菌素治疗的小鼠(CsA);用大鼠RBC免疫并经对照抗体和环孢菌素A治疗的小鼠(Cntrl Ab + CsA);用大鼠RBC免疫并经抗CD200抗体和环孢菌素A治疗的小鼠(抗体I + CsA);和既不用大鼠RBC免疫、也未经抗体或环孢菌素治疗的小鼠(No-imm No Rx)。图2是线图，显示在自身免疫性溶血性疾病小鼠模型中抗CD200抗体对抗RBC抗体效价的影响。C57BL/6小鼠在研究的第O天经腹膜内(i. p.)给予2 X IO8大鼠RBC I次，并在此后于研究的其余时间中每周给予I次。然后将经大鼠RBC免疫的小鼠用5 mg/kg或I mg/kg具有效应子功能的抗CD200抗体治疗(抗体I ;Ab I);用5 mg/kg的不具有效应子功能的抗⑶200抗体治疗(抗体2 ;Ab 2);或用5 mg/kg对照抗体治疗(Cntl)。一组小鼠也仅用溶媒治疗。最后一组小鼠不接受免疫或抗体治疗(NC)。Y轴表示反映为0D405 X血清稀释因子的相对荧光强度，X轴代表研究开始之后的天数。图3是柱形图，显示自经抗CD200抗体治疗小鼠分离的脾细胞的抗原诱导的增殖的降低。Y轴代表在分离自各细胞群体的核酸中3H-胸苷放射性的每分钟平均计数。X轴代表单只小鼠，每组描绘3只。对于每只小鼠，4种检测结果是用仅培养基、小鼠红细胞(mRBC)、大鼠红细胞(rRBC)或牛血清白蛋白(BSA)所诱导的脾细胞增殖。组别I的小鼠经剂量为5 mg/kg的具有效应子功能的抗CD200抗体(抗体I)治疗。组别2的小鼠经剂量为I mg/kg的抗体I治疗。组别3的小鼠经不与⑶200结合的对照抗体治疗，组别4的小鼠不用抗体治疗或不用大鼠红细胞免疫。图4是柱形图，显示在经抗⑶200抗体治疗的小鼠中⑶200+脾细胞的降低。C57BL/6小鼠在研究的第O天经腹膜内(i.p.)给予2 x IO8大鼠RBC I次，和在此后于研究的其余时间中每周给予I次。然后将经大鼠RBC免疫的小鼠用5 mg/kg或I mg/kg的具有效应子功能的抗CD200抗体治疗(抗体I ;Ab I);用5 mg/kg的不具有效应子功能的抗⑶200抗体治疗(抗体2;Ab 2);或用5 mg/kg对照抗体治疗(Cntl)。一组小鼠也仅用溶媒治疗。最后一组小鼠不接受免疫或抗体治疗(Un-imm, No-Ab)。Y轴代表总的有活力的脾细胞群体中的⑶200+细胞百分比。X轴代表单只小鼠，每组描绘3只。发明详沭
本公开内容涉及抗CD200抗体，并涉及抗体在治疗自身免疫性疾病或癌症的方法的应用。其特征还在于用于为患有自身免疫性疾病和/或癌症的患者选择或处方开给治疗方式的生物标志。另外，本公开内容的特征在于使用与一种或更多种另外的治疗剂(抗CD20治疗剂)组合的抗CD200抗体的治疗方法。虽然绝无意限制，但是在下文中详述说明了示例性抗CD200抗体及其CD200结合片段、缀合物、药物组合物和制剂、生物标志和利用任何前述物质的方法，并以工作实施例为例予以说明。杭CD200 杭体
本公开内容特征在于与人CD200多肽结合的抗体(有时所述抗体在本文中称为“抗CD200抗体”)。特征还在于所述抗体的抗原结合(CD200结合)片段。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体与人CD200蛋白的表位结合。例如，所述抗CD200抗体可与包含以下氨基酸序列或由其组成的人CD200蛋白的表位结合
MERLVIRMPFSHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQVVTQDEREQLYTPASLKCSLQNAQEALIVTffQKKKAVSPENMVTFSENHGVVIQPAYKDKINITQLGLQNSTITFffNITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVYVQPIVSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSGIENSTVTLSHPNGTTSVTSILHIKDPKNQVGKEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKGYffFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYffKRHRNQDREP (SEQ ID NO: I ;Genbank 检索号NP_005935. 2)。SEQ ID NO: I表示全长的前体人⑶200同种型A蛋白的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体与包含以下氨基酸序列或由其组成的人CD200蛋白的表位结合
MERLTLTRTIGGPLLTATLLGKTTINDYQVIRMPFSHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQVVTQDEREQLYTPASLKCSLQNAQEALIVTWQKKKAVSPENMVTFSENHGVVIQPAYKDKINITQLGLQNSTITFffNITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVYVQPIVSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSGIENSTVTLSHPNGTTSVTSILHIKDPKNQVGKEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKGYWFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYWKRHRNQDREP (SEQ IDN0:2 ;Genbank 检索号 ΝΡ_001004196· 2)。SEQ ID NO: 2 表示全长 CD200 同种型 B 蛋白的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗CD200抗体与具有以下氨基酸序列的人CD200蛋白中存在的表位结合
VIRMPFSHLSTYSLVWVMAAWLCTAQVQVVTQDEREQLYTTASLKCSLQNAQEALIVTWQKKKAVSPENMVTFSENHGVVIQPAYKDKINITQLGLQNSTITFWNITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVYVQPIVSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSGIENSTVTLSHPNGTTSVTSILHIKDPKNQVGKEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKGYffFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYffKRHRNQDRGELSQGVQKMT (SEQ ID NO: 3 ;Genbank 检索号CAA28943. I ;McCaughan 等(1987) Iwmunogenetics 25:329-335 的图 3)。SEQ ID NO:3 是全长人CD200蛋白的示例性序列。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体与CD200蛋白的胞外部分内的表位结合。例如，在某些实施方案中，所述抗CD200抗体可结合到CD200蛋白的以下表位上，
15所述表位在以下片段内或与以下片段重叠(i) SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列的氨基酸1-233 ；(ii) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的氨基酸1-258 ;或SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的氨基酸1-229。在某些实施方案中，所述抗CD200抗体与缺乏前导序列的人CD200蛋白的表位结合。例如，本文所述的抗CD200抗体可结合到CD200蛋白的以下表位上，所述表位在以下片段内或与以下片段重叠SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列的氨基酸31-233，其对应于缺乏氨基端前导序列的成熟形式的人CD200同种型A的胞外部分。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体可结合到CD200蛋白的以下表位上，所述表位在以下片段内或与以下片段重叠SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的氨基酸56-258，其对应于缺乏氨基端前导序列的成熟形式的人CD200同种型B的胞外部分。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体可结合到⑶200蛋白的以下表位上，所述表位在以下片段内或与以下片段重叠SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸27-229，其对应于缺乏氨基端前导序列的成熟形式的人CD200的胞外部分。“表位”是指在蛋白(例如人⑶200蛋白)上由抗体所结合的位置。“重叠表位”包括至少I个(例如2、3、4、5或6个)共同氨基酸残基。在某些实施方案中，所述抗CD200抗体特异性结合到人CD200蛋白(例如具有SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的人CD200蛋白，或成熟形式的CD200蛋白的胞外域)。术语“特异性结合”是指两种分子构成在生理条件下相对稳定的复合物(例如抗⑶200抗体与⑶200蛋白之间的复合物)。通常，当缔合常数(Ka)大于IO6 M—1时，就认为结合是特异性的。因此，抗⑶200抗体与⑶200蛋白特异性结合的Ka可为至少(或大于) ο6 (例如至少或大于 Io7Uo8Uo9UoiciUoiiUo12Uo13Uo14 或 ο15 或更高)m'与人⑶200蛋白特异性结合的抗体的实例描述于例如美国专利号7，408，041 ;7，427，665 ；7，435，412 ;和7，598，353，各专利的全部公开内容都通过引用以其整体结合到本文中。若干示例性的抗⑶200抗体的氨基酸序列描述于例如美国专利号7，408，041。例如,所述抗⑶200抗体可包含以下Fab抗体之一的重链和轻链可变区的氨基酸序列dlB10、dlA5、dlB5、c2aB7、clAlO或c2aA10，其示于美国专利号7，408，041的图23，图23所示序列通过引用以其整体结合到本文中。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体含有美国专利号7，408, 041的图23所示的Fab抗体之一的配对的重链⑶R和轻链⑶R组。例如，本文所述的抗⑶200抗体含有来自dlBlO Fab抗体的配对的⑶R组包含以下序列的重链 CDRl (HCDRl) GFTFSGFAMS (SEQ ID NO: 4);包含以下序列的重链 CDR2 (HCDR2)SISSGGTTYYLDSVKG (SEQ ID NO: 5);包含以下序列的重链 CDR3 (HCDR3) GNYYSGTSYDY(SEQ ID NO:6);包含以下序列的轻链CDRl (LCDRl) RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:7);包含以下序列的轻链⑶R2 (IXDR2) RASNLES (SEQ ID NO:8);和包含以下序列的轻链⑶R3(LCDR3) QQSNEDPRT (SEQ ID NO:9)。在另一个实例中，本文所述的抗⑶200抗体可含有来自dlA5 Fab抗体的配对的CDR组⑴包含以下序列的HCDRl :GFNIKDYYMH (SEQ ID NO: 10);包含以下序列的HCDR2 :WIDPENGDTKYAPKFQG (SEQ ID NO: 11);包含以下序列的 HCDR3 :KNYYVSNYNFFDV (SEQ IDNO: 12);包含以下序列的LCDRl :SASSSVRYMY (SEQ ID NO: 13);包含以下序列的LCDR2 :DTSKLAS (SEQ ID NO: 14);和包含以下序列的 LCDR3 :FQGSGYPLT (SEQ ID NO: 15)。
在另一个实例中，本文所述的抗⑶200抗体可包含来自dlB5 Fab抗体的配对的⑶R组包含以下氨基酸序列的HCDRl :GFNIKDYYIH (SEQ ID NO: 16);包含以下氨基酸序列的HCDR2 :WIDPEIGATKYVPKFQG (SEQ ID NO: 17);包含以下氨基酸序列的HCDR3 :LYGNYDRYYAMDY (SEQ ID NO: 18);包含以下氨基酸序列的 LCDRl :KASQNVRTAVA (SEQ IDNO: 19);包含以下氨基酸序列的IXDR2 :LASNRHT (SEQ ID NO:20);和包含以下氨基酸序列的 LCDR3 :LQHWNYPLT (SEQ ID NO:21)。在另一个实例中，本文所述的抗⑶200抗体可含有来自c2aB7 Fab抗体的配对的CDR组包含氨基酸序列GYSFTOTIIL (SEQ ID NO:22)的HCDRl ;包含氨基酸序列 HIDPYYGSSNYNLKFKG (SEQ ID NO:23)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列 SKRDYFDY (SEQ IDNO:24)的HCDR3 ;包含氨基酸序列KASQDINSYLS (SEQ ID NO:25)的LCDRl ;包含氨基酸序列 RANRLVD (SEQ ID NO:26)的 LCDR2 ;和包含氨基酸序列 LQYDEFPYT (SEQ ID NO:27)的LCDR3。Ssrmlizurmb (ALXN6000)含有美国专利号 7，408, 041 图 23 中最初所示的 c2aB7Fab抗体的前述配对⑶R。在再一个实例中，本文所述的抗⑶200抗体可含有来自clAlO Fab抗体的配对的⑶R组包含氨基酸序列GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 28)的HCDRl ;包含氨基酸序列GVNPNNGGALYNQKFKG (SEQ ID NO:29)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列 RSNYRYDDAMDY (SEQ IDNO:30)的 HCDR3 ;包含氨基酸序列 KSSQSLLDIDEKTYLN (SEQ ID N0:31)的 LCDRl ;包含氨基酸序列 LVSKLDS (SEQ ID NO: 32)的 LCDR2 ;和包含氨基酸序列 WQGTHFPQT (SEQ ID NO:33)的 LCDR3。并且在再一个实例中，本文所述的抗⑶200抗体可含有来自c2aA10 Fab抗体的配对的CDR组包含氨基酸序列AFNIKDHYMH (SEQ ID NO: 34)的HCDRl ;包含氨基酸序列 WIDPES⑶TEYAPKFQG (SEQ ID NO:35)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列 FNGYQALDQ (SEQ IDNO:36)的HCDR3 ;包含氨基酸序列TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 37)的LCDRl ;包含氨基酸序列STSNLAS (SEQ ID N0:38)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列RQYHRSPPIFT (SEQ ID NO:39) ^LCDR3。抗⑶200抗体的额外的示例性⑶R组描述于例如美国专利号7，427，665。在某些实施方案中，抗⑶200抗体是saimIizumsb (ALXN6000)。测定抗体与蛋白抗原是否结合和/或测定抗体与蛋白抗原的亲和力的方法是本领域已知的。例如，可采用各种技术检测和/或定量测定抗体与蛋白抗原的结合，所述技术例如但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、表面等离振子共振方法(例如BIAcore系统;Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 和 Piscataway, N.J.)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。参见例如 Harlow 和 Lane (1988) “Antibodies: A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ；Benny K. C.Lo (2004) “Antibody Engineering: Methods and Protocols, ” Humana Press (ISBN:1588290921) ；Borrebaek (1992) “Antibody Engineering, A Practical Guide, ” ff. H.Freeman 和 Co. , NY ；Borrebaek (1995) “Antibody Engineering, ” 第 2 版，OxfordUniversity Press, NY, Oxford;Johne等(1993) J Immunol Meth 160:191-198 :Jonsson等(1993) Ann Biol Clin 51 19-26 ;和 Jonsson 等(1991) Biotechniques 11:620-627。在某些实施方案中，所述抗⑶200抗体可交叉封闭(crossblock)与在人⑶200蛋白内或与之重叠的表位结合的另一抗体的结合。在某些实施方案中，所述抗CD200抗体可交叉封闭与在人CD200蛋白肽片段内或与之重叠的表位结合的抗体的结合。所述肽片段可以是具有例如SEQ ID NO: 1-3中任一个所示的氨基酸序列的人CD200蛋白的片段。本文所用的术语“交叉封闭抗体”是指相对于该抗体不存在时抗CD200抗体与CD200蛋白上的表位的结合量而言，减少抗CD200抗体与所述表位的结合量的抗体。确定第一抗体是否交叉封闭第二抗体与表位结合的合适方法是本领域已知的。鉴定特定抗体(例如抗CD200抗体)与之结合的表位的方法也是本领域已知的。例如，可通过测定抗体与CD200蛋白的若干(例如3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30个或更多个)重叠肽片段(例如具有例如SEQ ID NO: 1-3中任一个所示氨基酸序列的蛋白的若干重叠片段)的结合，来鉴定抗⑶200抗体的结合表位。然后将每个不同的重叠肽结合到固相支持体的独特地址，例如多孔测定板的不同孔。然后，通过在测定板中将抗CD200抗体与每种肽在以下条件下接触达以下时间量来探询(interrogate)所述抗体所述时间量和条件允许所述抗体与其表位结合。通过洗涤各孔而除去未结合的抗CD200抗体。然后，将与所述抗CD200抗体(如果板孔中存在的话)结合的可检测标记的第二抗体与各孔接触，并通过洗涤步骤除去未结合的第二抗体。在孔中由可检测标记的第二抗体所产生的可检测信号的存在情况或量，表明所述抗CD200抗体与缔合在孔上的特定肽片段的结合情况。参见例如Harlow和Lane (出处同上)，Benny K. C. Lo (出处同上)和美国专利申请公布号20060153836，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。也可用BIAcore色谱技术(参见例如 Pharmacia BIAtechnology Handbook, “Epitope Mapping, ” 6· 3· 2 节，(1994 年5月);和Johne等(1993) J Immunol Methods 160:20191-8)来鉴定抗体所结合的特定表位。在某些实施方案中，本文所述的抗CD200抗体或其CD200结合片段与细胞表面上表达的人CD200多肽结合。测定抗体是否与细胞表面上表达的蛋白结合的方法是本领域已知的并描述于例如 Petermann 等(2007) J Clin Invest 117 (12) : 3922-9 ；Rijkers 等(2008) Mol Immunol 45(4):1126-35 ；和 Kretz-Rommel (2007) J Immunol178(9):5595-605。在一些实施方案中，本文所述抗⑶200抗体或其⑶200结合片段抑制⑶200蛋白和⑶200受体之间的相互作用。用于确定作用剂(例如抗体)是否抑制⑶200和⑶200R之间的相互作用的方法是本领域已知的，描述于例如Hatherly和Barclay (2004) Eur JIimunol 34 (6) : 1688-94。在一些实施方案中，抗⑶200抗体或其⑶200结合片段在体外和/或体内抑制破骨细胞的形成。用于确定抗体是否抑制破骨细胞的形成的合适方法是本领域已知的，描述于例如 PCT 公布号 WO 2008/089022 和 Cui 等(2007) Proc Natl AcacI Sci USA104(36) :14436-14441 ο例如，可在抗CD200抗体存在或不存在时，在例如RANKL和M-CSF存在下培养鼠骨髓细胞。与缺乏所述抗体时所形成的破骨细胞的百分比相比，在抗体存在时自骨髓细胞形成的破骨细胞的百分比降低表明，抗体在体外抑制破骨细胞形成。由于⑶200在正常细胞例如内皮细胞上表达，尽管低于癌细胞上的水平，但是在一些实施方案中，可为有利的是，给予具有这样的恒定区的变体抗CD200抗体(或其CD200结合片段)所述恒定区经修饰使得其不能介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)或依赖补体
18的细胞毒性(CDC)或者具有降低的介导ADCC或CDC的能力，抗体通过ADCC结合天然杀伤(NK)细胞或巨曬细胞上的Fe受体导致细胞死亡，CDC是通过激活补体级联诱导的细胞死亡(有关综述见 Daeron (1997) Annu Rev Immunol 15:203-234 ffard 和 Ghetie
(1995)Therapeutic Immunol 之:77—94 ;和 Ravetch 和 Kinet (1991) Annu Rev Tmmuno I.2:457-492)。这类修饰可用于限制对正常细胞的损伤。⑶200表达还在一些活化正常细胞(例如活化T细胞)上上调，使这类细胞易被具有效应子功能的抗CD200抗体杀伤。使用缺乏效应子功能的抗CD200抗体以避免这些细胞被ADCC或CDC杀伤也可能是有利的。可用不具有效应子功能的恒定区(例如IgG2/IgG4融合恒定区)置换具有效应子功能的免疫球蛋白恒定区(例如IgGl恒定域)来消除抗CD200抗体的效应子功能。参见例如Burton等
(1992)Adv Immun 51:1-18 ;Canfield等(1991) J Exp Med 173:1483-1491 以及Mueller等(1997) Mol Immunol 34 (6) : 441-452)。例如(按照 Kabat 编号)，IgGl 和 IgG4 恒定区含有G249G25tl残基，而IgG2恒定区不含残基249，但的确含有G25(l。在其中249-250区来自G2序列的G2/G4杂合恒定区中，可对恒定区做进一步修饰将甘氨酸残基引入249位上以产生具有G249ZG250的G2/G4融合物。下面描述了用于消除效应子功能的其它方法。要理解的是，可将任何上述抗⑶200抗体引入本文所述的双特异性抗⑶200/抗⑶20抗体中。杭CD20治疗剂
本公开内容的特征还在于通过与细胞表面上的CD20特异性结合而特异性靶向表达CD20蛋白的细胞(例如癌细胞)的治疗剂。抗CD20治疗剂可以是例如与CD20、蛋白质(例如⑶20的天然或合成配体)或其片段、RNA适体、L-RNA适体或spiegelmer结合的小分子化合物。在一些实施方案中，抗CD20治疗剂是与CD20多肽结合的抗体(有时该抗体在本文称为“抗CD20抗体”)。其特征还在于抗体的抗原结合(CD20结合)片段。在一些实施方案中，本文所述抗CD20抗体与人CD20蛋白中的表位结合。例如，抗CD20抗体可与包含下列氨基酸序列或由下列氨基酸序列组成的人CD20蛋白中的表位结合
MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP (SEQID N0:40 ;Genbank 检索号 ΝΡ_068769· 2)。SEQ ID NO:40 描述全长前体人 CD20 同种型 A蛋白的氨基酸序列。全长人⑶20多肽的氨基酸序列还描述于例如Tedder等(1988) ProcNatl AcacI Sci USA 85(1) :208_212。本文所述抗CD20抗体与CD20蛋白的胞外部分内的表位结合。例如，在一些实施方案中，抗CD20抗体可与CD20蛋白在以下片段内的表位或与以下片段重叠的表位处结合(i) SEQ ID N0:40中所述氨基酸序列的氨基酸72-80 ;或(ii) SEQ ID NO:40中所述氨基酸序列的氨基酸140-186。参见例如Teeling等(2006) J Immunol 177:362-367。也就是说，本文所述抗CD20抗体可与氨基酸序列IPAGIYAPI (SEQ ID N0:41)或NIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI (SEQ ID NO:42)内的人 CD20 的表位或同与所述氨基酸序列重叠的人CD20的表位结合。
在一些实施方案中，抗⑶20抗体与人⑶20蛋白(例如具有SEQ ID N0:40所述氨基酸序列的人CD20蛋白或人CD20蛋白的一个或多个胞外环)特异性结合。与人CD20蛋白特异性结合的抗体的实例描述于例如Teeling等(2006),第363页，同上；Levene等(2005)JR Soc Med 98:146-152 ;以及美国专利号 7，435, 803,5, 595，721 和 7，422，739，其各自的公开内容均通过引用以其整体结合到本文中。可用于本文所描述的方法的获准用于临床应用或正在临床开发中的示例性的治疗性抗⑶20抗体包括而不限于利妥昔单抗(Biogen Idee)、9°Y_替伊莫单抗(BiogenIdec)、1311_ 托西莫单抗(GlaxoSmithKline)、奥法木单抗(Genmab)、TRU-015 (Trubion)、veltuzumab (IMMU-106 ;Immunomedics)、奥瑞珠单抗(Roche)和 AME_133v (AppliedMolecular Evolution)。参见例如 Levene 等(2005),同上；Burge 等(2008) ClinTher 30(10) :1806-1816 Kausar 等(2009) Expert Opin Biol Ther 9(7) :889-895 ；Morschhauser 等(2009) J Clin OncolTJ (20) :3346-3353 ；以及 Milani 和 Castillo(2009) Curr Opin Mol Ther 11 (2) : 200-207。用于确定抗体是否与CD20结合和/或抗体对于CD20的亲和力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，抗CD20抗体可交叉封闭与人CD20蛋白内的表位或与人CD20蛋白重叠的表位结合的另一抗体的结合。在一些实施方案中，抗CD20抗体可交叉封闭与人CD20蛋白的肽片段内的表位或与人CD20蛋白的肽片段重叠的表位结合的抗体的结合。肽片段可以是具有例如SEQ ID N0:41或SEQ ID N0:42任一个中描述的氨基酸序列的人CD200蛋白的片段。要理解的是，可将任何上述抗⑶200抗体掺入本文所述的双特异性抗⑶200/抗CD20抗体中。药物组合物和制剂
可将含有抗CD200抗体、抗CD20治疗剂(例如抗CD20抗体)或两者的组合物配制成药物组合物，以例如给予人来治疗癌症或自身免疫性疾病。所述药物组合物通常包含药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”是指并包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。所述组合物可包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐。参见例如Berge等(1977) J Pharm5b·: 1-19。可按照标准方法配制组合物。药物配制是建立良好的领域，并进一步描述于例如 Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, ” 第20 版，Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472) ；Ansel 等(1999)“Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,” 第 7 版，LippincottWilliams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727) JPKibbe (2000) “Handbook ofPharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, ” 第 3 版(ISBN:091733096X)。在某些实施方案中，可将组合物配制为例如处于合适浓度并适合贮存于2_8°C的缓冲溶液剂。在某些实施方案中，可将组合物配制，用于贮存在(TC以下的温度(例如 _20°C或 _80°C )。药物组合物可呈各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型,例如液体溶液剂(例如注射用和输注用溶液剂)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式部分地取决于预期给药方式和治疗应用。例如，预定用于全身或局部递送的含有抗CD200抗体或抗CD20抗体的组合物可呈注射用和输注用溶液剂的形式。因此，可配制组合物，用于经胃肠外模式(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)给药。本文所用的“胃肠外给药”、“经胃肠外给予”和其它语法上等同的短语，是指并非肠道和局部给予的给药模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肺部、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、心内、皮内、肺内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输注(参见以下)。可将组合物配制为溶液剂、微乳剂、分散剂、脂质体或适于以高浓度稳定贮存的其它有序结构。无菌注射用溶液剂可如下制备通过将所需量的本文所述的抗体与以上列举的成分之一或组合(根据需要)掺入到合适溶剂中，接着过滤除菌。通常，如下制备分散剂通过将本文所述的抗⑶200抗体(和/或抗⑶20治疗剂例如抗⑶20抗体)掺入到含有基础分散介质和所需的以上列举的其它成分的无菌溶媒中。在用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其得到本文所述的抗体加上来自其先前过滤除菌的溶液的任何额外所需成分的粉末。例如，可通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过保持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，来维持溶液剂的适当流动性。可通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，使注射用组合物的吸收延长。在某些实施方案中，可将抗⑶200抗体(和/或抗⑶20治疗剂例如抗⑶20抗体)与保护化合物以免快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是本领域已知的。(参见例如J. R. Robinson(1978) “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, ” Marcel Dekker,Inc. , New York.)。在某些实施方案中，可将本文所述的抗体配制在适用于肺内给药(例如通过喷雾器给药)至哺乳动物例如人的的组合物中。制备这类组合物的方法是本领域众所周知的并描述于例如美国专利申请公布号20080202513 ;美国专利号7，112，341和6，019，968 ;和PCT公布号WO 00/061178和WO 06/122257，其公开内容各自通过引用以其整体结合到本文中。干粉吸入器制剂和用于给予所述制剂的合适系统描述于例如美国专利申请公布号20070235029、PCT 公布号 WO 00/69887 ;和美国专利号 5，997，848。在某些实施方案中，可对本文所述的抗CD200抗体(和/或抗CD20治疗剂例如抗CD20抗体)进行修饰，例如用改善其在循环(例如血液、血清或其它组织)中的稳定性和/或滞留性的部分来修饰。稳定性部分可改善抗体的稳定性或滞留性达至少I. 5 (例如至少
2、5、10、15、20、25、30、40 或 50 或更高)倍。在某些实施方案中，可将本文所述的抗CD200抗体与可用于治疗癌症或改善其症状的一种或多种额外的活性剂配制在一起。例如，可将抗CD200抗体与抗CD20治疗剂(例如抗⑶20抗体例如任何本文所述的抗⑶20抗体)、遗传毒性剂(genotoxic agent)或化疗药或一种或多种激酶抑制剂配制在一起。遗传毒性剂或化疗药可以是但不限于卡钼、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、
21丝裂霉素、依托泊苷、鬼白毒素、泰素、沙钼(satraplatinum)、5_氟尿卩密卩定、长春新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)、甲氨蝶呤、ara_C、泰索帝、吉西他滨、顺钼(CDDP)JSJ霉素(ADR)或任何上述物质的类似物。激酶抑制剂包括例如以下中的一种或多种曲妥珠单抗、吉非替尼、厄洛替尼、甲磺酸伊马替尼或马来酸舒尼替尼。额外药剂是本领域已知的并描述于本文。当抗CD200抗体待与第二活性剂联用时，或者当待使用两种或更多种不同抗CD200抗体时，可将所述活性剂单独或一起配制。例如，可将相应的药物组合物在例如临给予之前混合在一起，然后一起给予，或者可以将相应的药物组合物在例如同时或不同时间分别给予(参见以下)。如上所述，可配制组合物，使得其包含治疗有效量的抗⑶200抗体，或者可配制组合物，使其包含亚治疗量的所述抗体和亚治疗量的一种或多种额外的活性剂，使得总组分对于治疗癌症或自身免疫性疾病在治疗上有效。在某些实施方案中，可配制组合物，使其包含各自处于亚治疗剂量的两种或更多种抗CD200抗体，使得组合抗体处于对于治疗人的癌症或自身免疫性疾病在治疗上有效的浓度。抗CD200抗体的治疗有效剂量的测定方法是本领域已知的并描述于本文中。
_3] 用于产生抗CD200或抗CD20抗体的方法
用于产生本公开内容的抗体(例如抗CD200抗体或抗CD20抗体)或其抗原结合片段的合适方法是本领域已知的(参见例如美国专利号7，427，665、7，435，412和7，408，041，其各自的公开内容均通过引用以其整体结合到本文中)并描述于本文。例如，可如下产生单克隆抗⑶200抗体使用人⑶200表达细胞、人⑶200多肽或人⑶200多肽的抗原性片段作为免疫原，因此在动物中产生免疫应答，从所述动物中可分离出产生抗体的细胞，进而可分离出单克隆抗体。同样，可使用人CD20表达细胞、人CD20多肽或人CD20多肽的抗原性片段作为免疫原在动物中产生单克隆抗CD20抗体。可测定这类抗体的序列，并通过重组技术产生所述抗体或其变体。可根据能够与目标抗原(例如CD200或CD20)结合的单克隆抗体以及多肽的序列，采用重组技术产生嵌合抗体、⑶R移植抗体、人源化抗体和完全人抗体。此外，可根据靶标特异性，使用CD200表达细胞或由其得到的多肽作为分离抗体或多肽的诱饵，来选择来源于重组文库(“噬菌体抗体”)的抗CD200抗体。非人和嵌合抗CD200抗体的产生和分离尽在技术人员的见识以内。要了解的是，仅采用上述方法的常规改动就可选出抗⑶20抗体。重组DNA技术可用于修饰非人类细胞所产生的抗体的一种或多种特性。因此，可构建嵌合抗体以降低其在诊断应用或治疗应用中的免疫原性。此外，可通过经由CDR移植和任选构架修饰使抗体人源化，使免疫原性最小化。参见美国专利号5，225，539和7，393，648，其内容各自通过弓I用结合到本文中。抗体可得自动物血清，或者在单克隆抗体或其片段的情况下可在细胞培养中产生。按照确立方法(包括在细菌或优选哺乳动物细胞培养中的方法)，可使用重组DNA技术产生抗体。所选的细胞培养系统优选分泌抗体产物。在另一个实施方案中，产生本文所公开抗体的方法包括培养已用杂合载体转化的宿主例如大肠杆菌0 cWi)或哺乳动物细胞。所述载体包含一个或多个表达盒，其含有与编码信号肽的第一 DNA序列可操作地连接的启动子，所述第一 DNA序列以恰当读框与编码抗体蛋白的第二 DNA序列连接。然后收集和分离抗体蛋白。任选地，所述表达盒可包含与编码抗体蛋白的多顺反子(例如双顺反子)DNA序列可操作地连接的启动子，所述抗体蛋白各自分别以恰当读框与信号肽可操作地连接。杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外繁殖在合适的培养基中进行，所述培养基包括常规标准培养基(例如Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基)，任选补充有哺乳动物血清(例如胎牛血清)或微量元素和维持生长的补充剂(例如饲养细胞例如正常小鼠腹腔渗出液细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等)。作为细菌细胞或酵母细胞的宿主细胞的繁殖同样也在本领域已知的合适培养基中进行。例如，对于细菌，合适的培养基包括培养基LE、NZCYM、ΝΖΥΜ、NZM、Terrific Broth、SOB、S0C、2 χΥΤ或M9基础培养基。对于酵母，合适培养基包括培养基YPD、YEF1D、基础培养基或完全基础 Dropout 培养基(Complete Minimal Dropout Medium)。体外制备提供了相对纯的抗体制剂并允许放大生产，以提供大量的所需抗体。细菌细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的并包括均一悬浮培养(例如在气升式反应器或在连续搅拌反应器中)、以及固定化或捕获化(entrapped)细胞培养(例如在中空纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷管壳(ceramic cartridge)上)。也可通过在体内繁殖哺乳动物细胞而获取大量的所需抗体。为了这个目的，将产生所需抗体的杂交瘤细胞注射到组织相容的哺乳动物中，使产生抗体的肿瘤生长。任选地,在注射之前，所述动物先用烃、尤其是矿物油如姥鲛烷(四甲基-十五烷)引发。1-3周之后，从这些哺乳动物体液中分离抗体。例如，通过将合适骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的产生抗体的脾细胞融合而获取的杂交瘤细胞，或来自杂交瘤细胞系Sp2/0的产生所需抗体的转染细胞，经腹膜内注射到Balb/c小鼠(任选事先用姥鲛烷处理)。1-2周之后，从所述动物中采集腹水。前述和其它技术论述于例如Kohler 和 Milstein，(1975) #atorg256:495-497 ；美国专利号 4，376， 110 ;Harlow 和 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,(1988) Cold Spring Harbor,所述公开内容均通过引用结合到本文中。用于制备重组抗体分子的技术描述于上述参考文献中，还描述于例如W097/08320 ;美国专利号
5,427, 908 ；美国专利号 5, 508, 717 ；Smith (1985) 5bie/ ce225:1315-1317 Parmley和 Smith (1988) Gene73:305-318 ；De La Cruz 等(1988) Journal of BiologicalChemistry!^: 4318-4322 ;美国专利号 5, 403, 484 ;美国专利号 5，223,409 ；W088/06630 ；W092/15679 ;美国专利号5，780，279 ;美国专利号5，571,698 ;美国专利号6，040，136 ；Davis 等(1999) Cancer Metastasis Rev. 18 (4) : 421-5 ；和 Taylor 等(1992)核酸Research 20 :6287-6295 ；Tomizuka 等(2000) Proc. Natl. Acad. ScL USA97(2)722-727，所述文献各自的内容均通过引用以其整体结合到本文中。针对所需抗体筛选细胞培养上清液，这优先通过表达CD200的细胞的免疫荧光染色、通过免疫印迹、通过酶免疫测定例如夹心测定或斑点测定或放射免疫测定来进行。对于抗体的分离，可例如通过硫酸铵沉淀，针对吸湿性材料例如聚乙二醇进行的透析，经由选择性膜的过滤等，来浓缩培养上清液或腹水中的免疫球蛋白。必要和/或所需时，通过常规色谱方法来纯化抗体，所述色谱方法例如凝胶过滤、离子交换色谱、经由DEAE-纤维素的色谱和/或(免疫)亲和色谱例如用一种或多种来自表达CD200的细胞系
23的表面多肽或合成CD200片段肽或者用蛋白A或蛋白G进行的亲和色谱。另一实施方案提供在合适哺乳动物中制备分泌针对人⑶200蛋白或人⑶20 (根据所产生的抗体)的抗体的细菌细胞系的方法。例如用来自表达CD200的组织或细胞或CD200多肽或其片段的合并样品免疫兔。依据本领域众所周知的方法(例如在通过引用结合到本文中的各种参考文献中公开的方法)，构建自该免疫兔所产生的噬菌体展示文库并淘选所需抗体。也公开了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。优选的杂交瘤细胞是遗传稳定的，分泌具有所需特异性的本文所述的单克隆抗体，并且可通过融化和在体外或作为腹水在体内繁殖而自深冻培养物扩繁。在另一个实施方案中，提供制备分泌针对人CD200蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法。在该方法中，合适的哺乳动物，例如Balb/c小鼠，用一种或多种CD200多肽或抗原性片段或者用来自表达CD200的细胞的一种或多种多肽或抗原性片段、表达CD200的细胞本身、或含有如所述纯化的多肽的抗原性载体来免疫。短时将免疫哺乳动物的产生抗体的细胞在培养基中培养或与合适的骨髓瘤细胞系的细胞融合。将融合所得杂种细胞克隆，并选择分泌所需抗体的细胞克隆。例如，将经人CD200的蛋白片段免疫的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag 14的细胞融合。然后针对所需抗体的分泌来筛选所得杂种细胞，并将阳性杂交瘤细胞克隆。制备杂交瘤细胞系的方法包括在数个月内例如在2-4个月内通过皮下和/或腹膜内注射人CD200肽片段若干次例如4-6次而免疫Balb/c小鼠。在末次注射之后2_4天从经免疫小鼠中获取脾细胞并在融合促进剂优选聚乙二醇存在下与骨髓瘤细胞系PAI细胞融合。优选地，在含有约30%至约50%分子量约为4000的聚乙二醇的溶液中，将骨髓瘤细胞与3-20倍过量的来自免疫小鼠的脾细胞融合。融合之后，将所得细胞在如上所述的合适培养基中扩繁，所述培养基中定期补充选择培养基，例如HAT培养基，以防止正常骨髓瘤细胞生长超过所需杂交瘤细胞。抗体及其片段可以是“嵌合”的。嵌合抗体及其抗原结合片段包含来自两种或更多种不同物种(例如小鼠和人)的部分。可将具有所需特异性的小鼠可变区拼接到人恒定域基因区段而产生嵌合抗体(例如，美国专利号4，816，567)。以此方式，可修饰非人类抗体，使其更适合人类临床应用(例如用于治疗或预防人类受试者的癌症的方法)。本公开内容的单克隆抗体包括非人类(例如小鼠)抗体的“人源化”形式。人源化或CDR移植mAb尤其可用作用于人的治疗药，因为它们不像小鼠抗体那样自循环中被快速清除掉而且通常不会引发不良免疫反应。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。人源化抗体的制备方法通常是本领域众所周知的。例如，人源化可基本按照Winter 和合作者的方法(参见例如 Jones 等(1986) Nature >2 \ : 522-525 ；Riechmann 等(1988) #atorg332:323-327 :和 Verhoeyen 等(1988) 5bie/ ce239:1534-1536),通过用喷齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。还参见例如Staelens等(2006) MolImmun0 在某些实施方案中，非人类(例如小鼠)抗体的人源化形式是人抗体(受体抗体)，其中受体抗体的超变(CDR)区残基被来自非人类物种(供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和结合能力的超变区残基取代，所述非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的构架区残基也被相应非人类残基取代(所谓“回复突变”)。另外，噬菌体展示文库可用于改变在抗体序列内的所选位置的氨基酸。通过选择人构架亦影响人源化抗体的特性。此外，可修饰人源化抗体和嵌合抗体，使其包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基，以便进一步改善抗体特性，例如亲和力或效应子功能。本公开内容中也提供完全人抗体。术语“人抗体”包括具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果有的话)的抗体。人抗体可包括不为人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如通过随机或位点特异性体外诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体其中得自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已经移植到人构架序列上(即人源化抗体)。完全人抗体或人抗体可得自携带人抗体基因(携带可变区(V)、多变区(D)、结合区(J)和恒定区(C)外显子)的转基因小鼠或者得自人细胞。例如，目前有可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在内源免疫球蛋白的产生不存在时产生人抗体的完全库(full repertoire)。参见例如 Jakobovits 等(1993) Proc Natl AcacI Sci USA90:2551 ; Jakobovits 等(1993)Nature )&2:255-258 ;Bruggemann 等(1993) Year in Iimuno 1 _·. 33 ;和 Duchosal 等(1992)
迪:258。转基因小鼠品系可经改造而含有来自非重排人免疫球蛋白基因的基因序列。人序列可编码人抗体的重链和轻链两者并且在小鼠中可正确地起作用，经历重排而提供类似于在人中那样宽的抗体库。转基因小鼠可用靶蛋白(例如人CD200蛋白、其片段或表达⑶200蛋白的细胞；或人⑶20蛋白、其片段或表达⑶20蛋白的细胞)来免疫，以产生一系列特异性抗体及其编码RNA。然后可将编码这类抗体的抗体链组分的核酸从动物中克隆到展示载体上。通常，将编码重链序列和轻链序列的核酸的单独群体克隆，再将单独群体在插入时重组到载体中，使得载体的任何给定拷贝接受重链和轻链的随机组合。载体经设计以表达抗体链，使得它们可被装配和展示在含有所述载体的展示包装体(display package)的外表面。例如，可将抗体链与来自噬菌体外表面的噬菌体外壳蛋白一起表达为融合蛋白。然后，可针对与靶标结合的抗体的展示来筛选展示包装体。另外，人抗体可得自卩遼菌体展示文库(Hoogenboom等(1991) J Mol Β ο122 : 381 Marks 等(1991) J Mol ^iW222:581-597 :和 Vaughan 等(1996) Nature Biotech]A\ ,Q9
(1996))。可构建合成噬菌体文库，其使用合成人抗体V区的随机组合。通过基于抗原的选择，可制备完全人抗体，其中V区在特性上非常类似于人。参见例如美国专利号6，794，132、6，680，209、4，634，666 和 Ostberg 等(1983) Hybridoma 之:361-367，所述文献的内容各自通过引用以其整体结合到本文中。对于人抗体的产生，另参见Mendez 等(1998) Nature GeneticsltQ-. 146-156,Green和Jakobovits (1998) T Exd Med 188:483-495,其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。人抗体进一步论述和描述于美国专利号5, 939，598,6, 673，986,6, 114，598、6，075，181,6, 162，963,6, 150，584,6, 713，610 和 6，657，103 以及美国专利公布号20030229905 AU20040010810 AUUS 20040093622 AU20060040363 AU20050054055 Al、20050076395 AU20050287630 Al。另参见国际公布号 WO 94/02602、WO 96/34096 和 WO98/24893及欧洲专利号EP O 463 151 BI。上述专利、申请和参考文献各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。在一个替代方法中，包括GenPharm International, Inc.的其它人已利用“微基因
25座(minilocus)”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独基因)而模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个Vh基因、一个或多个Dh基因、一个或多个Jh基因、μ恒定区和第二恒定区(优选Y恒定区)构建到用于插入动物中的构建体中。该方法描述于例如美国专利号5, 545，807,5, 545，806,5, 625，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016、5，770，429,5, 789，650 和 5，814，318,5, 591，669,5, 612，205,5, 721，367,5, 789，215、5，643，763,5, 569，825,5, 877，397,6, 300，129,5, 874，299,6, 255，458 和 7，041，871，其公开内容通过引用结合于本文中。另参见欧洲专利号O 546 073 BI、国际专利公布号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852 和 WO 98/24884，其各自的公开内容通过引用以其整体结合于本文中。另参见Taylor等(1992) Nucleic Acids Res 20 :6287 ;Chen等
(1993)Int J遞《wo巧647 ;Tuaillon 等(1993) Proc Natl AcacI Sci USA90 :3720-4 ；Choi 等(1993) Nature Genetics^ 117 ;Lonberg 等(1994) Nature )^ :856-859 Taylor等(1994) International Immunology^；Tuaillon^ (1995) J. Immunol. 154
6453-65 ;Fishwild 等(1996) Nature Biotechnolosv14 :845 以及 Tuaillon 等(2000) EurJ /遞:2998-3005,其各自的公开内容通过引用以其整体结合于本文中。在某些实施方案中，提供去免疫化的抗CD200抗体或其抗原结合片段。去免疫化抗体或其抗原结合片段是经修饰以便使所述抗体或其抗原结合片段对给定物种无免疫原性或较少的免疫原性的那些。可通过利用本领域技术人员已知的多种技术的任一种修饰抗体或其抗原结合片段，来达到去免疫化(参见例如PCT公布号WO 04/108158和WO00/34317)。例如，抗体或其抗原结合片段可通过以下方式而去免疫化通过鉴别抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内的潜在T细胞表位和/或B细胞表位并使用例如重组技术从抗体或其抗原结合片段中去除一个或多个潜在T细胞表位和/或B细胞表位。然后任选可制备和检测经修饰的抗体或其抗原结合片段，以鉴别保留一种或多种所需生物活性(例如结合亲和力)、但具有降低的免疫原性的抗体或其抗原结合片段。可使用本领域已知技术进行鉴别潜在T细胞表位和/或B细胞表位的方法，所述技术例如计算方法(参见例如PCT公布号WO 02/069232)、体外或芯片{in siHco)技术、以及生物测定或物理方法(例如，测定肽与MHC分子的结合，测定肽MHC复合物与来自接受抗体或其抗原结合片段的物种的T细胞受体的结合，用具有接受抗体或其抗原结合片段的物种的MHC分子的转基因动物来测试蛋白质或其肽部分，或用经来自接受抗体或其抗原结合片段的物种的免疫系统细胞重构的转基因动物进行测试，等等)。在不同实施方案中，本文所述去免疫化抗体(例如去免疫化抗⑶200抗体或去免疫化抗⑶20抗体)包括去免疫化抗原结合片段、Fab、Fv, scFv、Fab’和F(ab’)2、单克隆抗体、鼠抗体、工程抗体(例如，嵌合抗体、单链抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、完全人抗体和人工选择抗体)、合成抗体和半合成抗体。在某些实施方案中，制备包含编码抗⑶200抗体或表达⑶200蛋白的细胞系的重链可变域和/或轻链可变域的插入片段的重组DNA。术语DNA包括编码单链DNA、由所述编码DNA及其互补DNA组成的双链DNA、或这些互补(单链)DNA本身。此外，编码抗⑶200抗体或表达⑶200的细胞系的重链可变域和/或轻链可变域的DNA，可经酶促合成或化学合成，以含有编码重链可变区和/或轻链可变区的真实DNA序列，或其突变体。真实DNA的突变体是编码这样的上述抗体的重链可变域和/或轻链可变
26域的DNA :其中一个或多个氨基酸被缺失、插入或与一个或多个其它氨基酸交换。优选地在人源化和表达优化应用中，所述修饰在抗体的重链可变域和/或轻链可变域的CDR之外。术语突变DNA也包括沉默突变体，其中一个或多个核苷酸被具有编码相同氨基酸的新密码子的其它核苷酸取代。术语突变序列也包括简并序列。简并序列是在遗传密码含义内的简并，因为无限制数量的核苷酸被其它核苷酸取代，而不导致原来所编码的氨基酸序列的变化。由其不同限制位点和/或特定宿主、特别是大肠杆菌优选的特定密码子的频率所致，可使用这类简并序列以获得重链鼠可变域和/或轻链鼠可变域的最佳表达。术语突变体意指包括按照本领域已知方法通过真实DNA的体外诱变而获得的DNA突变体。对于完整的四聚体免疫球蛋白分子的装配和嵌合抗体的表达，将编码重链可变域和轻链可变域的重组DNA插入片段与编码重链恒定域和轻链恒定域的相应DNA融合，然后转移至合适的宿主细胞中(例如在掺入杂合载体之后)。可使用包含编码抗⑶200抗体或表达⑶200的细胞系的重链鼠可变域的插入片段的重组DNA，所述重链鼠可变域与人恒定域IgG (例如Y I、Y 2, γ3或Υ4，在具体实施方案中为Yl或Υ4)融合。也提供包含插入片段的重组DNA，所述插入片段编码与人恒定域K或λ、优选K融合的抗体的轻链鼠可变域。另一实施方案涉及编码重组多肽的重组DNA，其中重链可变域和轻链可变域通过间隔基的方式连接，所述重组DNA任选包含促进抗体在宿主细胞中加工的信号序列和/或编码促进抗体纯化的肽和/或切割位点和/或肽间隔基和/或某种物质的DNA序列。编码某种物质的DNA意指编码可用于诊断性或治疗性应用的物质的DNA。因此，特别是指作为毒素或酶、尤其是能够催化前药活化的酶的物质分子。编码这类物质的DNA具有编码天然存在的酶或毒素的DNA的序列，或其突变体，并且可通过本领域众所周知的方法制备。因此，本公开内容的单克隆抗体或抗原结合片段可以是未与其它物质(例如治疗药或可检测标记)缀合的裸露抗体或抗原结合片段。或者，所述单克隆抗体或抗原结合片段可与例如以下物质缀合细胞毒性剂、小分子、激素、酶、生长因子、细胞因子、核酶、肽模拟物、化学物、前药、包括编码序列的核酸分子(例如反义物、RNAi、基因打靶构建体等)、或可检测标记(例如NMR或X射线造影剂、荧光分子等)。在某些实施方案中，抗⑶200抗体或抗原结合片段(例如Fab、Fv、单链scFv、Fab’和F(ab’ )2)与延长抗体或抗原结合片段半衰期的分子连接(参见以上)。可获得用于在哺乳动物细胞表达克隆重链和轻链基因的若干可能的载体系统。一类载体依赖于所需基因序列整合至宿主细胞基因组。可通过同时引入药物抗性基因例如大肠杆菌 gpt (Mulligan 和 Berg (1981) Proc Natl AcacI Sci USA, 78_: 2072)或 Tn5 neo(Southern和Berg (1982) Mol Appl feweijj327)来选择具有稳定整合的DNA的细胞。选择标记基因可与待表达的DNA基因序列连接或可通过共转染导入同一细胞中(Wigler等(1979) Ceim-11)。第二类的载体利用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。这些载体可来源于动物病毒，例如牛乳头瘤病毒(Sarver等(1982) Proc Natl Acad Scitt5H:7147)、多瘤病毒(Deans 等(1984) Proc Natl AcacI Sci:1292)或 SV40 病毒(Lusky 和 Botchan (1981) Nature293:79)。因为免疫球蛋白cDNA仅由代表编码抗体蛋白的成熟mRNA的序列组成，因此对于免疫球蛋白mRNA合成需要调节基因转录和RNA加工的其它基因表达元件。这些元件可包括剪接信号，转录启动子(包括诱导型启动子)、增强子和终止信号。掺入这类元件的cDNA表达载体包括描述于以下文献的载体0kayama和Berg (1983) Mol Cell Biol 3:280 ；Cepko等(1984) Cell 37:1053 ;以及 Kaufman (1985) Proc Natl Acad Sci "5 迎:689。从本公开内容显而易见，抗CD200抗体和/或抗CD20抗体可用于疗法(例如治疗癌症的疗法)，包括组合疗法，以及用于疾病进程的监测。在本公开内容的治疗性实施方案中，预期双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体，其对至少两种不同抗原具有结合特异性。就本发明而言，结合特异性之一是针对细胞(例如免疫细胞)上的CD200抗原，另一则是针对任何其它抗原，和优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚基。在一些实施方案中，双特异性抗体是与人⑶200和人⑶20结合的抗体。双特异性抗体的制备方法在本领域技术人员的见识之内。传统上，双特异性抗体的重组制备基于两条免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein和Cuello (1983)淑卿305:537-539)。可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选与免疫球蛋白重链恒定域(包括铰链的至少一部分、Ch2区和Ch3区)进行。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如需要的话)免疫球蛋白轻链的DNA，插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。对于制备双特异性抗体的说明性的目前已知方法的进一步详述，参见例如 Suresh 等(1986) Methods in Enzvmolosv 121:210 PCT 公布号 WO 96/27011 ；Brennan等(1985) Science22°>\^\ Shalabv 等，J Exp Med (1992) 175:217-225 Kostelnv 等(1992) J ImmunoIΙΑ (5) : 1547-1553 :Hollinger 等(1993) Proc. Natl. Acad. ScLUSA90:6444-6448 ;Gruber 等(1994) J Tmmuno :5368 ;以及 Tutt 等(1991) J Immunol147:60o双特异性抗体也包括交联抗体或异型缀合抗体(heteroconjugate antibody)。可使用任何适宜交联方法制备异型缀合抗体。合适的交联剂以及多种交联技术是本领域众所周知的，并公开于美国专利号4，676，980。也已描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，使用亮氨酸拉链已制备出双特异性抗体。参见例如Kostelny等(1992) JImmunollAS, (5) : 1547-1553。来自Fos蛋白和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽可通过基因融合而与两种不同抗体的Fab’部分连接。在铰链区可还原抗体同型二聚体，以形成单体，然后重新氧化而形成抗体异型二聚体。该方法也可用于产生抗体同型二聚体。以下文献所描述的“双抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的替代机制=Hollinger等(1993) ProcNatl Acad Sci 盟:6444-6448。所述片段包括通过接头与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个域之间配对。因此，一个片段的VH域和VL域被迫与另一片段的互补VL域和VH域配对，从而形成两个抗原结合位点。也已报道了通过使用单链Fv (scFv) 二聚体而制备双特异性抗体片段的另一策略。参见例如Gruber等(1994) J Inrnuno11^2:5368。或者,抗体可以是例如以下文献所述的“线性抗体”:Zapata等(1995) Protein份说8 (10) : 1057-1062。简而言之，这些抗体包括一对串联Fd区段(Vh-ChI-Vh-ChI),其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。本公开内容也包括双特异性抗体的变体形式例如在Wu等(2007) NatBiotechnol2^ (U) -.12^-1291中描沭的四价双重可夺域免疮球蛋白(DVD-Ig)分子。DVD-Ig分子经设计，使得来自两种不同亲代抗体的两种不同轻链可变域(VL)以串联形式直接连接或通过重组DNA技术经由短接头连接，然后连接轻链恒定域。制备来自两种亲代抗体的DVD-Ig分子的方法进一步描述于例如PCT公布号WO 08/024188和WO 07/024715，其公开内容各自都通过弓I用以其整体结合到本文中。在一些实施方案中，抗⑶200抗体和/或抗⑶20抗体可经修饰，例如用改进抗体自身在循环(例如在血液、血清或其它组织)中的稳定性和/或滞留性的部分来修饰。例如，可将本文所述的抗⑶200抗体如以下文献所述PEG化例如Lee等(1999) BioconjugChemlQ (6) : 973-8 ;Kinstler 等(2002) Advanced Drug Deliveries Revi54:477-485 ；和 Roberts 等(2002) Advanced Drug Deli very ReviewstOA: 459-476。稳定部分可改进抗体在受试者体内(例如血液或组织)的稳定性或滞留性达至少I. 5 (例如至少2、5、10、15、
20、25、30、40或50或更多)倍。抗体或其抗原结合片段的修饰
可在其表达和纯化后，对抗CD200抗体或抗CD20抗体或其抗原结合片段进行修饰。修饰可以是共价或非共价修饰。可通过例如使多肽的靶定氨基酸残基与能够与所选择的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，将这类修饰引入抗体或片段。可使用各种标准的任一种，包括例如抗体或片段的结构分析或氨基酸序列分析，来选择修饰的合适位点。在一些实施方案中，可将抗体或其抗原结合片段与异源部分缀合。异源部分可以是例如异源多肽、治疗剂(例如毒素或药物)或可检测标记例如但不限于放射性标记、酶标记、荧光标记或发光标记。合适的异源多肽包括例如用于纯化抗体或片段的抗原标签(例如FLAG、聚组氨酸、血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源多肽还包括可用作诊断或检测标志物的多肽，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。合适的放射性标记包括例如32P、33P、14C、125I、131I、35S和3H。合适的荧光标记包括而不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白(GFP)、DyLight488、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶(PI) ,PerCP,PE-Alexa Fluor 700、Cy5、别藻蓝蛋白和 Cy7。发光标记包括例如各种发光的镧系元素(例如铕或铽)螯合物中的任一种。例如，合适的铕螯合物包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)的铕螯合物。酶标记包括例如碱性磷酸酶、CAT、萤光素酶和辣根过氧化物酶。可将异源多肽掺入抗CD200抗体作为融合蛋白。用于产生编码抗体-异源多肽融合蛋白的核酸的方法是抗体工程领域中众所周知的，描述于例如Dakappagari等(2006) J Immunol 176:426-440。在一些实施方案中，异源多肽是对细胞有毒性的多肽。例如毒性多肽可选自假单胞菌iPseudotnoims)外毒素(PE)、异株湾根毒蛋白、多花白树毒蛋白、曲霉菌素、局限曲菌素、血管生成素、肥皂草蛋白、相思豆毒蛋白、原核核糖核酸酶、真核核糖核酸酶、蓖麻毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)、促凋亡多肽、核糖体抑制蛋白或上述任一种的生物活性片段。促凋亡多肽包括例如 Bax、Bad、Bak、Bim、Bik、Bok、Hrk、FasUTRAIL 和 TNF-α 和其促凋亡的生物活性片段。在一些实施方案中，抗CD200抗体、抗CD20抗体或其抗原结合片段可与对细胞有毒性的小分子或放射性试剂缀合。例如，抗CD200抗体或抗CD20抗体可与选自以下的毒性小分子缀合顺钼、卡钼、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、卡奇霉素(calicheamicin)、喜树
29碱、阿霉素、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、钼、普卡霉素、单甲基auristatin、auristatin E、丝裂霉素、依托泊苷、verampil、鬼臼毒素、他莫昔芬、泰素、反钼(transplatinum)、5_氟尿卩密唳、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤或前述任一种的类似物。抗体或片段可与对细胞有毒性的放射性试剂缀合。这类放射性试剂包括例如 90Y、186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Pb、212Bi、213Bi、123I、125I、131I、mIn、211At、32P,177Lu,47Sc,105Rh,109Pd^153Sm 和 199Au。可采用多种已知的化学交联剂的任一种，使2种蛋白质(例如抗CD200抗体或抗CD20抗体和异源部分)交联。这类交联剂的实例是通过包括“受阻的”二硫键在内的键连接两个氨基酸残基的交联剂。在这些键中，(通过二硫键任一侧上的阻碍基团)保护交联单元内的二硫键免于被例如还原型谷胱甘肽或酶二硫化物还原酶的作用所还原。一种合适的试剂4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α -甲基-α (2-吡啶基联硫基)甲苯(SMPT)，利用一种蛋白质上的末端赖氨酸和另一种蛋白质上的末端半胱氨酸在两个蛋白质之间形成这类键。还可使用通过各种蛋白质上的不同偶联部分交联的异双官能试剂。其它有用的交联剂包括而不限于连接以下基团的试剂两个氨基(例如Ν-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)、两个巯基(例如1，4-双-马来酰亚胺丁烷)、氨基与巯基(例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、氨基与羧基(例如4-[对叠氮基水杨基酰氨基]丁胺)和氨基与存在于精氨酸侧链的胍基(例如对叠氮基苯基乙二醛一水合物)。在一些实施方案中，放射性标记可与抗体的氨基酸骨架直接缀合。或者，还可包括放射性标记作为较大分子(例如间-[125I]碘苯基-N-羟基琥珀酰亚胺([125I]mIPNHS)中的1251，其与游离氨基结合而形成相关蛋白质的间碘苯基(mIP)衍生物(参见例如Rogers等(1997) J. Nucl. Med. 38:1221-1229)或螯合物(例如与DOTA或DTPA的螯合物)的一部分，所述较大分子或螯合物继而与蛋白质骨架结合。使放射性标记或含有放射性标记的较大分子/螯合物与本文所述的抗CD200抗体或抗CD20抗体缀合的方法是本领域已知的。这类方法包括在有利于放射性标记或螯合物与蛋白质结合的条件(例如pH、盐浓度和/或温度)下，将蛋白质与放射性标记一起温育(参见例如美国专利号6，001, 329)。使荧光标记(有时称为“荧光团”)与蛋白(例如抗CD200抗体、抗CD20抗体或上述任一种的抗原结合片段)缀合的方法是蛋白质化学领域已知的。例如，可使用与荧光团连接的琥珀酰亚胺基(NHS)酯或四氟苯基(TFP)酯部分，使荧光团与蛋白质的游离氨基(例如赖氨酸的游离氨基)或巯基(例如半胱氨酸的巯基)缀合。在一些实施方案中，可使荧光团与异双官能交联剂部分(例如磺基-SMCC)缀合。合适的缀合方法包括在有利于荧光团与蛋白质结合的条件下，使抗体蛋白质或其片段与荧光团一起温育。参见例如 Welch 和 Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistryand Applications (放射性药品手册放射化学与应用)，” John Wiley and Sons (ISBN0471495603)。在一些实施方案中，可用例如改进抗体在循环中(例如在血液、血清或其它组织中)的稳定性和/或滞留性的部分对抗CD200抗体或抗CD20抗体进行修饰。例如，可按以下文献所述使抗体或片段PEG化例如Lee等(1999) Bioconjug ChemM^L :973-8 ；Kinstler 等(2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485 ；以及 Roberts 等(2002) Advanced Drug Deli very Reviews M: 459-476。稳定性部分可改进抗体(或片段)的稳定性或滞留性达至少I. 5倍(例如至少2、5、10、15、20、25、30、40或50或更多倍)。在一些实施方案中，可使本文所述的抗CD200抗体或其抗原结合片段糖基化。在一些实施方案中，本文所述抗体或其抗原结合片段可进行酶处理或化学处理或者自细胞产生，使得该抗体或片段的糖基化减少或缺乏。用于产生具有减少的糖基化的抗体的方法是本领域已知的，描述于例如美国专利号6，933，368 ;Wright等(1991) EMBOAO(IO) :2717-2723 ;以及 Co 等(1993) Mol Immunom-A^l0生物样品和样品收集
本文所述方法所用的合适的生物样品包括任何生物流体、细胞群体或组织或其部分，其包括一种或多种白细胞和/或一种或多种红细胞。生物样品可以是例如得自受试者(例如哺乳动物例如人)的标本或者可源自所述受试者。例如，样品可以是经活检而得到的组织切片，或放入或适合组织培养的细胞。生物样品也可以是生物流体例如尿、全血或其部分(例如血浆)、唾液、精液、痰、脑脊液、泪液或粘液。如需要的话，可将生物样品进一步分级为含有特定细胞类型的部分。例如，全血样品可分级为血清或含有特定类型血细胞(例如红细胞或白细胞(白血球))的部分。如需要的话，生物样品可以是来自受试者的不同生物样品的组合，例如组织和流体样品的组合。生物样品可获自受试者，例如患有、疑似患有癌症(例如表达⑶200和⑶20的一种或两种的癌症，例如B-CLL)或有发展所述癌症的风险的受试者。可使用获取生物样品的任何合适方法，尽管示例性的方法包括例如放血、拭子(例如口腔拭子)、灌洗或细针抽吸活检方法。易于细针抽吸的组织的非限制性实例包括淋巴结、肺、甲状腺、乳房和肝。生物样品也可得自骨髓。也可通过例如显微解剖(例如激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(PAP涂片)或导管灌洗(ductal lavage)而采集样品。保留生物样品中细胞的活性或完整性的获取和/或贮存样品的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，可进一步将生物样品与一种或多种额外的物质例如合适缓冲剂和/或抑制剂(包括蛋白酶抑制剂)接触，所述物质意在保存细胞或尽量减少细胞的变化(例如渗透性或pH上的变化)或细胞表面上的细胞表面蛋白(例如GPI连接的蛋白)或GPI部分的变性。这样的抑制剂包括例如螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、蛋白酶抑制剂例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、抑酶肽和亮抑酶肽。用于贮存或以其它方式操纵完整细胞的合适缓冲剂和条件描述于例如Pollard和Walker (1997)，“BasicCell Culture Protocols (基本细胞培养方案)，”Methods in molecular的第75卷，Humana Press ；Masters (2000) “Animal cell culture: a practical approach (动物细胞培养实用方法)，approach 的第 232 卷，Oxford UniversityPress;和 Jones (1996) “Human cell culture protocols (人细胞培养方案)，” ifeiAotfein molecular medicine 的第 2 卷，Humana Press。也可将样品加工，以消除干扰物质或尽量减少干扰物质的存在。例如，可将生物样品分级或纯化，以除去一种或多种非目标材料(例如细胞)。生物样品的分级或纯化方法包括但不限于流式细胞术、荧光激活细胞分选术和沉降。应用
本文所述组合物可用于多种治疗和诊断性应用，例如，本文所述抗CD200抗体可用于治疗或诊断癌症或自身免疫性疾病的方法中。例如，在确定是患有对用抗CD20治疗剂(例如抗CD20抗体例如利妥昔单抗)的治疗有抗性的癌症的患者后，开业医生可选择以足以治疗患者癌症的量和频率将抗⑶200抗体给予人。在一些实施方案中，在已确定患者的癌症(例如液体肿瘤)包含表达⑶5的癌细胞后，开业医生可将抗⑶200抗体和抗⑶20治疗剂给予患有所述癌症的患者以治疗所述癌症。用于将抗CD200抗体治疗性给予人的方法是本领域众所周知的，描述于例如U. S. 7，408，041。用于治疗自身免疫性疾病的方法 本公开内容还通过例如降低患病受试者中自身免疫性疾病相关的自身抗体的浓度，提供用于治疗自身免疫性疾病的治疗和诊断性应用。例如，开业医生可选择以足以降低所述病症相关的自身抗体的表达(或产生)或降低患者血液中自身抗体的浓度的量和频率，将抗CD200抗体给予患有自身免疫性疾病(例如自身免疫性溶血性疾病)的人，从而治疗患者的自身免疫性疾病。用于将抗CD200抗体治疗性给予人的方法是本领域众所周知的，描述于例如 U.S. 7，408，041。本上所用的“自身免疫性疾病”是指这样疾病状态，其中通过白细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞)的作用，在宿主生物中产生针对正常存在于宿主生物内的物质或组织的病理性免疫应答(例如在持续时间和/或幅度上的病理性)。自身免疫性疾病的类型包括但不限于慢性阻塞性肺病、I型糖尿病、古德帕斯彻综合征、格雷夫斯病、格-巴综合征、IgA肾病、硬皮病、斯耶格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、寻常型天疱疮、类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn’ s disease)、桥本病、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力(MG)、肺胆汁性肝硬化和米勒-费希尔综合征。自身免疫性疾病还包括某些自身免疫溶血性病症，例如抗磷脂综合征(APS)、灾难性抗磷脂综合征(catastrophicanti-phospholipid syndrome, CAPS)、典型或非典型溶血性尿毒症综合征(HUS)和自身免疫性溶血性贫血(AIHA)。AIHA是指特征在于宿主红细胞的自身抗体产生的相关疾病家族。AIHA包括例如温型AIHA (WAIHA)、冷型AIHA (CAD)、阵发性冷性血红蛋白尿(PCH)和药物诱导的溶血性贫血(DIHA)。“有发展自身免疫性疾病风险的”人是指有自身免疫性疾病家族史(例如一种或多种炎性病症的遗传倾向性)的人或暴露于一种或多种诱导自身免疫性疾病/自身抗体的条件下的人。例如，暴露于志贺菌毒素的人有发展典型HUS的风险。患有某些癌症(例如液体肿瘤，例如多发性骨髓瘤或慢性淋巴细胞性白血病)的人可使患者易发展某些自身免疫性溶血性疾病。例如，PCH可继发各种感染(例如梅毒)或肿瘤例如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)。在另一个实例中，CAD可能与HIV感染、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)感染、非霍奇金淋巴瘤或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’ s macroglobulinemia)有关。在又一个实例中，自身免疫性溶血性贫血是众所周知的人慢性淋巴细胞性白血病的并发症，约11%的患有晚期疾病的CLL患者将发展AIHA。多达30%的CLL可能有发展AIHA的风险。参见例如Diehl等(1998) SeminOnco12b (Y) :80-97 和 Gupta 等(2002) Leukemial^(IQ) : 2092-2095。根据以上所述，显然“有发展自身免疫性疾病的风险”的人并非全是在目标种类之内的人。“疑似患有自身免疫性疾病的”人是具有自身免疫性疾病的一个或多个症状的人。自身免疫性疾病的症状可因具体自身免疫性疾病的严重程度和种类的不同而异并且包括但不限于发红、肿胀(例如关节肿胀)、对触碰发热的关节、关节疼痛、强直、关节功能丧失、发热、发冷、疲劳、精力丧失、疼痛、发热、苍白、黄疸、荨麻疹样皮疹、血红蛋白尿、血红蛋白血和贫血(例如严重贫血)、头痛、食欲丧失、肌肉强直、失眠、瘙痒、鼻塞、喷嚏、咳嗽、一种或多种神经症状例如晕眩、惊厥或疼痛。根据以上所述，显然并非所有人是“疑似患有自身免疫性疾病的”。在一些实施方案中，开业医生可以足以降低人的自身免疫性疾病相关的自身抗体的表达或产生的量将抗⑶200抗体给予人。例如，PCH大部分通常因受试者产生在冷的温度下与红细胞的P抗原结合的自身抗体(称为“多纳-兰兹泰纳(Donath-Landsteiner)抗体”)所致。一旦与红细胞结合，所述抗体在较热的温度下促进细胞的补体介导的溶血。儿童中多达40%的免疫溶血性贫血与多纳-兰兹泰纳抗体有关。参见例如Sokol等(1982)Acta Haematol^(A) :268-77。因此，例如可以足以降低人的多纳-兰兹泰纳抗体的产生或表达的量将抗⑶200抗体给予PCH患者，从而治疗人的PCH。同样，CAD (或冷血凝素病或CHD/CHAD)是特征在于在较冷的温度下与红细胞上的I抗原结合的自身抗体的自身免疫性疾病。一旦结合，所述抗体促进细胞的血凝反应和补体介导的溶血。因此，开业医生可以足以降低人的抗I抗原抗体的产生或表达的量给予抗⑶200抗体，从而治疗人的CAD。在另一个实例中，很多患有MG的患者表达与烟酸乙酰胆碱受体(AChR)结合并抑制烟酸乙酰胆碱受体的活性的抗体。该抗体引起乙酰胆碱受体丧失，降低在成熟神经肌肉接头的肌肉终板上的受体功能。缺乏可检测的抗AChR抗体的一些患者改为表达涉及肌肉特异性受体酪氨酸激酶(MuSK)的自身抗体。参见例如Hoch等(2001) Nature Med.7(3) : 365-368)。因此，开业医生可以足以降低人的抗AChR或抗MuSK抗体的产生或表达的量给予抗⑶200抗体，从而治疗人的MG。用于在人中检测自身免疫性疾病相关的自身抗体的存在情况或量的方法是本领域众所周知的，描述于例如Burbelo等(2009) J Transl MedT_\S > ；Hanke等(2009) Arthritis Res Therll(I) :R22 Hoch 等(2OOl)，同上；Vernino 等(2OO8) JNeuroimmunol 197(1) : 63-69 ；SokoI 等(1982),同上；以及 Littleton 等(2009) Mol CellProteomics 8 (7):1688-1696。在一些实施方案中，以保持自身免疫性疾病相关的自身抗体的降低的浓度(或降低的表达或产生)的量和频率将抗CD200抗体给予受试者。用于检测自身抗体的表达或自身抗体浓度的改变的方法是本领域众所周知的(例如蛋白质印迹、免疫组织化学和流式细胞术技术)并描述于本文。通过重复过程，开业医生可确定保持患者中自身免疫性疾病相关的自身抗体的降低的浓度所需要的合适剂量和各剂量的给予频率。例如，开业医生可以降低(或至少预期降低)人的自身抗体的浓度的量将抗CD200抗体给予患有自身免疫性疾病(例如AIHA)的患者一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次，或者例如至少2次、至少3、4、5、6、7或8次或更多次)。所述至少2个剂量在时间上应间隔至少I天(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天或甚至14天)。含有自身抗体的生物样品(例如血液样品)在不同时间获自患者，例如，在第一次抗CD200抗体给药前、在第一个剂量和至少一个其它的剂量之间和在第二个剂量后的至少一次生物样品收集。在一些实施方案中，生物样品可在剂量之间收集至少两次和/或在最后的剂量给予患者后收集至少一·次。然后，针对自身免疫性疾病相关的自身抗体的相对效价探询所获得的各生物样品中的自身抗体，以确定抗CD200抗体的给药的量和/或频率是否足以保持患者中自身抗体的降低的浓度。开业医生(和/或计算机)可确定用于患者的抗CD200抗体给药方案，其足以在治疗过程中在患者中保持自身免疫性疾病相关的自身抗体的降低的浓度。在一些实施方案中，将抗⑶200抗体给予人降低自身抗体浓度达至少5% (例如至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85%或更多)。 在一些实施方案中，可将抗⑶200抗体长期给予人。本上所用的“长期给予”、“长期治疗”、“长期地治疗”或其类似的语法变化是指这样的治疗方案，其用于保持患者血液中治疗剂的某种阈值浓度以在一段长的时间内在患者中保持特定状态。例如，可将抗CD200抗体长期给予MG患者以在一段长的时间内保持患者血液中抗AChR抗体的浓度降低。因此，可治疗用抗⑶200抗体长期治疗的患者达大于或等于2周的时间(例如3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51 或 52 周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,11 或 12 个月；或 1,1.5、2、2·5、3、3·5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、9、9· 5、10、
10.5或12年或达患者余生)。本发明人已鉴定并在本文中提供与通过将抗CD200抗体给予人而在人中产生免疫调节效应一致的若干生物标志。也就是说，将该抗体给予患自身免疫性疾病(自身免疫性溶血性疾病)的小鼠时，小鼠中多种脾细胞和骨髓细胞亚群的浓度改变。本上所用的“免疫调节效应”和语法类似术语是指归因于给予动物(例如人)的抗CD200抗体的生物活性的动物(例如人)中的可测量的免疫效应。例如，本发明人已观察到，在将抗CD200抗体给予小鼠后，以下⑶200+白细胞群的浓度降低⑶3+/⑶200+细胞、⑶45R+/⑶200+细胞、⑶5+/CD200+ 细胞、CD19+/CD200+ 细胞、CD138+/CD200+ 细胞、CD45R7CD138+/CD200+ 和 CD200R+/⑶200+细胞。在一些实施方案中，⑶200+白细胞局限于脾。在外周血液中还可观察到前述⑶200+细胞亚群的减少。另观察到在将抗⑶200抗体给予小鼠时，下列⑶200+骨髓细胞亚群的浓度降低⑶200+骨髓细胞、Igk+/⑶200+骨髓细胞、⑶45R+/⑶138+/⑶200+骨髓细胞、CD138+/CD200+骨髓细胞、c-kit+/CD200+骨髓细胞和c-kit7CD2007LirT骨髓细胞。虽然不受任何特定理论或作用机制的束缚，但本发明人认为针对这些生物标志中的一种或多种的出现来监测用抗CD200抗体治疗的患者，实际上可用来确定在给予抗体的人中抗CD200抗体是否能够产生生物效应。此外，一种或多种生物标志也可用来鉴定抗⑶200抗体(例如samalizumab (ALXN6000))的剂量——阈剂量，其通过其在人中的免疫调节效应足以实现对疾病在临床上有意义的作用(即足以治疗疾病，例如自身免疫性疾病或癌症)。即，用抗CD200抗体治疗的患自身免疫性溶血性疾病的小鼠显示小鼠中疾病相关的自身抗体的浓度降低。因此，按照本公开内容，开业医生可以足以通过在人中保持一种或多种以下生理状况(免疫效应)而治疗自身免疫性疾病的量和频率，将抗CD200抗体给予有需要的人(i)至少一种⑶200+白细胞亚群(例如至少一种⑶200+脾细胞亚群)的降低的浓度；( )脾或外周F4/80+细胞的升高的浓度；和(iii)至少一种骨髓干细胞亚群的降低的浓度。⑶200+白细胞亚群可为例如⑶3+/⑶200+细胞、⑶45R+/⑶200+细胞、⑶5+/⑶200+细胞、CD19+/CD200+ 细胞、CD138+/CD200+ 细胞、CD45R7CD138+/CD200+ 和 CD200R+/CD200+ 细胞。⑶200+骨髓细胞亚群可为例如⑶200+骨髓细胞、Igk+/⑶200+骨髓细胞、⑶45R+/⑶138+/CD200+ 骨髓细胞、CD138+/CD200+ 骨髓细胞、c-kit+/CD200+ 骨髓细胞和 c-kit+/CD200+/Lin_骨髓细胞。脾或外周F4/80+细胞可以是巨噬细胞。在一些情况下，保持至少两种生理状况。在一些实施方案中，在整个治疗期在人中保持所有状况。用于测量CD200+细胞(例如CD200+白细胞或骨髓细胞亚群的任一种)的浓度的方法是本领域众所周知的，与其它方法一起还包括流式细胞术。参见例如Chen等(2009)Mol 7^/ ο746(10) :1951-19630还在工作实施例中给出了用于检测和/或测量⑶200+骨髓细胞、脾细胞或外周血液白细胞亚群的浓度的合适方法。在一些实施方案中，从业人员可针对CD200+细胞的特定亚群的细胞浓度探询获自治疗后患者(已给予抗CD200抗体的患者)的生物样品。例如，从业人员可测定存在于治疗后患者的生物样品中的⑶45R+/⑶200+白细胞的浓度和/或c-kit+/CD2007Lin_骨髓细胞的浓度。在一些实施方案中，在给予人抗⑶200抗体后，⑶200+白细胞(例如脾中的⑶200+ 白细胞群)或骨髓细胞亚群的浓度小于人治疗前相应亚群浓度至少5%。在一些实施方案中，治疗后CD200+脾细胞或骨髓细胞亚群浓度小于用抗体治疗前相应亚群的浓度的至少10% (例如 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50、55、60、65、70、75、80% 或超过 80%)。本文所述的抗CD200抗体可与用于治疗或预防炎性病况的一种或多种额外的治疗药共同给予。所述一种或多种药物包括例如非留体抗炎药(NSAID)、疾病缓解抗风湿药(DMARD)、生物反应调节剂或皮质类固醇。生物反应调节剂包括例如抗TNF剂(例如可溶性TNF受体或TNF特异性抗体例如阿达木单抗(adulimumab)、英利昔单抗或依那西普)。在一些实施方案中，一种或多种额外的治疗药可以是例如留体、抗疟药、阿司匹林、非留体抗炎药、免疫抑制剂、细胞毒性药、皮质类固醇(例如泼尼松、地塞米松和泼尼松龙)、甲氨蝶呤、甲泼尼龙、大环内酯免疫抑制剂(例如西罗莫司和他克莫司)、有丝分裂抑制剂(例如硫唑嘌呤、环磷酰胺和甲氨蝶呤)、抑制T淋巴细胞活性的真菌代谢物(例如环孢菌素)、麦考酚酸酯、醋酸格拉默和细胞毒性剂和DNA破坏剂(例如苯丁酸氮芥或本文所述的或本领域已知的任何其它DNA破坏剂)。治疗癌症的方法
本公开内容还提供用于治疗癌症的治疗和诊断性应用。例如，在确定人患有包含表达⑶200的肿瘤细胞的肿瘤后，开业医生可选择以足以治疗患者癌症的量和频率将抗⑶200抗体给予人。用于将抗CD200抗体治疗性给予人的方法是本领域众所周知的，描述于例如U.S. 7,408,041。癌症是一类这样的疾病或病症，其特征在于不受控制的细胞分裂以及这些细胞通过经由侵入而直接生长到邻近组织中或通过经由转移(其中通过血流或淋巴系统转运癌细胞)而植入到远端部位而扩散的能力。癌症可影响所有年龄的人，但是风险趋于随年龄而加大。癌症类型可包括例如肺癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症(hematological cancer)、神经组织癌(例如成神经细胞瘤)、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、液体肿瘤、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。液体肿瘤包括例如白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病例如B细胞或T细胞型慢性淋巴细胞性白血病)和多发性骨髓瘤。骨癌包括而不限于骨肉瘤和骨癌。
本上所用的“有发展癌症风险的”人是具有发展癌症的倾向(predisposition)、即具有发展癌症的遗传倾向例如肿瘤抑制基因突变(例如BRCAl、p53、RB或APC突变或其它遗传重排)的人或已暴露于可导致癌症的条件的人。因此，当人已经暴露给致突变或致癌水平的某些化合物(例如香烟烟雾中的致癌化合物，例如丙烯醛、砷、苯、苯并[a]蒽、苯并[a]芘、针-210 (氡)、尿烷或氯乙烯)时，所述人也可以是“有发展癌症风险的”人。此夕卜，当人已暴露于例如大剂量的紫外光或X辐射或者受引起肿瘤的病毒/肿瘤相关性病毒(例如乳头瘤病毒，埃巴病毒，乙型肝炎病毒或人T细胞白血病-淋巴瘤病毒)感染时，所述人可为“有发展癌症风险的”。根据以上所述，显然不是所有人都是“有发展癌症风险的”。“疑似患有癌症”的人是具有癌症的一个或多个症状的人。癌症症状是本领域技术人员众所周知的并且包括但不限于乳房肿块、疼痛、体重减轻、虚弱、过度疲劳、进食困难、食欲丧失、慢性咳嗽、气喘恶化、咳血、尿血、便血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、肚胀、胃气胀、腹膜腔液体、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、呕血、大汗、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、晕眩、发冷、肌肉痉挛和吞咽困难。原发性癌症(例如大的原发性癌症)的症状可包括例如以下任一种结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移和胰转移。本发明人已发现将抗CD200抗体给予动物导致CD5+细胞动物脾中的浓度明显降低。虽然本公开内容不受任何特定理论或作用机制的束缚，但是很可能至少部分地因CD20的细胞表达降低所致，CD5+ CLL细胞可对利妥昔单抗治疗不应。本发明人已表明，含有抗CD200抗体的治疗组合物可用于降低动物中的CD5+细胞群体，因此认为所述组合物特别可用于治疗对用抗CD20治疗不应(例如利妥昔单抗抗性)的CLL患者亚群。因此，本公开内容的特征在于用于治疗癌症、特别是用于选择或鉴定哪种癌症最可获益于用抗CD200抗体进行的治疗的多种方法。例如，本公开内容的特征在于用于治疗患有对用抗CD20治疗剂(例如利妥昔单抗)的治疗有抗性、疑似有抗性或可能有抗性的癌症的人的方法。本上所用的对治疗的“抗性”、对治疗“不应”等语法表述是指患者的临床状态，其中在治疗或医治给定病症(例如癌症)方面给定治疗(例如用抗CD20治疗剂进行的治疗)的有效性降低或在改善与所述病症有关的一种或多种症状方面治疗的有效性降低。例如，抗CD20治疗对患有液体肿瘤例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病的患者的治疗益处可随时间减小，使得甚至在存在治疗时癌症复发、保持或发展。癌症对治疗剂(例如抗CD20治疗剂)的抗性在医学领域中有大量文件记载，并描述于例如，Reddy等·
(2006)J Clin Oncol 24(18S) : 17509 ；Bello 和 Sotomayor (2007) Hematology 1:233 ；Hernandez-Ilizaliturri 等(2009) J Clin Oncol 27 (15s) :8543 ;和Friedberg等(2005)HematologyX : 329 0在一些实施方案中，患者可能患有疑似对抗⑶20疗法有抗性或可能变得对抗CD20疗法有抗性的癌症。用于评价癌症是否可能变得对抗CD20治疗剂(例如利妥昔单抗)有抗性的一种生物标志是群体中CD5+癌细胞的存在情况或浓度。如上所述，因为CD5+细胞表达降低的CD20水平，所以细胞不太受抗CD20疗法的影响，因此可根据相对于表达较高的CD20水平的癌细胞的生长优势而对其进行选择。用于检测CD5的表达的方法是分子生物学领域众所周知的，包括而不限于可用于定量测定CD5蛋白质表达的蛋白质印迹法、点印迹法和流式细胞术或者用于定量测定CD5 mRNA的表达的反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和RNA印迹分析。参见例如Ennishi等(2008)，同上；Holodick等(2009)，同上；Garaud 等(2009) I IrniunoI 似(9、:5623-5632 以及 McNab 等(2009) Ann ClinLab Sci39 (2) : 108-113。通常参见 Sambrook 等(1989) “Molecular Cloning !LaboratoryManual,第 2 版，” Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y.和Ausubel 等(1992) “Current Protocols in Molecular Biology, ” Greene PublishingAssociates。用于检测和/或定量测定细胞的⑶5表达或用于测定群体中⑶5表达细胞的百分比的合适方法是流式细胞术，并在工作实施例中举例说明。在一些实施方案中，可能对抗⑶20治疗剂有抗性的癌症包含至少大量或一部分(例如两种或更多种；至少 0. 5%、0· 6%、0· 7%、0· 8%、0· 9%、1· 0%、1· 5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40% 或 45% 或更多)表达 CD5 的癌细胞(例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病细胞)。在一些实施方案中，大于45% (例如大于50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%或更多)的患者的癌细胞可表达⑶5。在一些实施方案中，癌症包含表达或过量表达⑶5 (例如⑶5蛋白质和/或⑶5 mRNA)的细胞(例如大量或甚至大部分的细胞)。在一些实施方案中，至少(或大于)10% (例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%)的人癌症的癌细胞过量表达 CD5。在 一些实施方案中，所有所测定的癌细胞相对于正常细胞过量表达CD5。在一些实施方案中，癌细胞(例如大量癌细胞，至少10%癌细胞或所有所测定的癌细胞)可表达以下水平的CD5蛋白质，所述水平是存在于相同组织学类型的正常细胞的表达水平或得自一位或多位未患癌症的患者的正常细胞平均表达的至少约I. 4倍(例如至少约I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9,2. O、2. 2,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5 或 5 倍或更多倍)。在一些实施方案中，本文所描述的方法可包括确定人是否患有癌症。在一些实施方案中，本文所描述的方法可包括确定人的癌症的一种或多种癌细胞是否表达CD200的步骤。在一些实施方案中，所述方法可包括确定人的癌症的一种或多种癌细胞相对于对照样品是否过量表达CD200。在一些实施方案中，对照样品获自同一人并包含与人的癌症相同的组织类型的正常细胞。例如，技术人员可测量与来自患者的正常结肠细胞相比、存在于患者结肠癌细胞上的CD200蛋白水平。在一些实施方案中，对照样品可为获自一位或多位未患有癌症的人的细胞的表达水平(或平均表达水平)。在一些实施方案中，癌症包含表达或过量表达⑶200 (例如⑶200蛋白和/或⑶200 mRNA)的细胞(例如大量或甚至大部分的细胞)。在一些实施方案中，至少(或大于)10% (例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)的人的癌症的癌细胞过量表达CD200。在一些实施方案中，所有所测定的癌细胞相对于正常细胞过量表达CD200。在一些实施方案中，癌细胞(例如大量癌细胞，至少10%的癌细胞或所有所测定的癌细胞)可表达CD200蛋白，其水平是存在于相同组织学类型的正常细胞的表达水平或得自未患癌症的一位或多位患者的正常细胞的平均表达的至少约I. 4倍(例如至少约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2. 0、2. 2.、
2.5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5 或 5 或更多倍)。在一些实施方案中，如果人的癌症表达或过量表达⑶200，则仅将抗⑶200抗体给予人。用于检测CD200的表达的方法是本领域众所周知的，包括例如蛋白质印迹，免疫组织化学和流式细胞术技术。用于检测⑶200表达的合适方法详细描述于例如Kretz-Rommel等
(2007)J Immunol 178:5595-5605 和 Kretz-Rommel 等(2008) J Immunol 180:699-705。在一些实施方案中，如果人的癌症表达或过量表达⑶200和⑶5，则仅将抗⑶200抗体给予人。在一些实施方案中，抗⑶200抗体通过靶向表达⑶200的癌细胞而阻断癌症中的免疫抑制。这些癌细胞的根除或抑制可刺激免疫系统，并允许进一步根除癌细胞。在一些实施方案中，直接杀伤癌细胞和驱动针对Thl概况的免疫应答的组合在癌症治疗方面提供提高的供效。因此，在一个实施方案中，提供癌症治疗，其中将与CD200结合及a)阻断CD200与其受体间的相互作用和b)直接杀伤表达CD200的癌细胞两者的抗体或抗体片段给予癌症患者。杀伤癌细胞的机制可包括但不限于ADCC或CDC ;与毒素融合；与有毒的放射性试剂融合；与毒性多肽例如粒酶B或穿孔蛋白融合；与细胞毒性病毒(例如细胞毒性呼肠孤病毒例如Reolysin )融合；或与细胞因子(例如TNF-α或IFN-α )融合。在一个备选的实施方案中，癌症治疗包括给予这样的抗体所述抗体既a)阻断CD200与其受体间的相互作用又b)增强细胞毒性T细胞或NK细胞针对肿瘤的活性。细胞毒性T 细胞或NK细胞活性的这类增强可例如通过将抗体与细胞因子(例如IL-2、IL-12、IL-18、IL-13和IL-5)融合而结合起来。另外，可通过给予抗⑶200抗体与抑制剂例如IMiD、沙利度胺或沙利度胺类似物的组合而达到这类增强。在再一个实施方案中，癌症治疗包括给予这样的抗体所述抗体既a)阻断⑶200与其受体间的相互作用又b)吸引T细胞到肿瘤细胞。可通过将Ab与趋化因子(例如MIG、IP-10、I-TAC, CCL21、CCL5或LIGHT)融合而达到对T细胞的吸引。另外，用化疗药治疗可导致对LIGHT的所需上调。阻断肿瘤细胞的免疫抑制和通过抗体打靶而直接杀伤肿瘤细胞的联合作用是提供增加功效的一种独特方法。本公开内容还提供使用抗CD200抗体和抗CD20治疗剂的联合疗法治疗癌症的方法。虽然不受任何特定理论和作用机制的束缚，但本发明人认为给予抗CD200抗体可通过降低可能难治的的癌细胞(也就是CD5+癌细胞)的比例，来提高抗CD20治疗剂的功效。抗CD20治疗剂可以是本文描述的或本领域已知的抗CD20治疗剂的任一种，例如利妥昔单抗(Biogen Idee)、9ciY-替伊莫单抗(Biogen Idec)、1311_ 托西莫单抗(GlaxoSmithKline)、奥法木单抗(Genmab)、TRU-015 (Trubion)、veltuzumab (IMMU-106 ；Immunomedics)、奥瑞珠单抗(Roche)和 AME_133v (Applied Molecular Evolution)。在一些实施方案中，抗⑶200抗体和抗⑶20治疗剂是单独的治疗剂。因此，抗CD200抗体和抗CD20治疗剂可以同时给予。在其它实施方案中，在第一时间给予抗CD200抗体，在第二时间给予抗CD20治疗剂。在一些实施方案中，在第一时间给予抗CD20治疗，在第二时间给予抗⑶200抗体。抗CD200抗体可代替或增加之前或目前给予的疗法(例如抗CD20治疗剂)。例如，在用抗CD200抗体或其抗原结合片段治疗时，给予抗CD20治疗剂可终止或减少，例如以较低水平给予。在一些实施方案中，可保持给予抗CD20治疗剂。在一些实施方案中，可保持给予抗CD20治疗剂直到抗CD200抗体的水平达到足以提供治疗作用的水平。可作为单独的药剂例如与CD200和CD20两者结合的双特异性抗体(见上文)，组合给予两种疗法。还可将本文所述抗CD200抗体与一种或多种其它的治疗性抗癌药一起共同给予患癌症的人。同样地，可将本文所述抗CD200抗体与抗CD20治疗剂和一种或多种其它的治疗性抗癌药一起共同给予患癌症的人。抗癌药包括例如化疗药、电离辐射、免疫治疗药或高热治疗药(hyperthermotherapy agent)。化疗药包括但不限于氨鲁米特、安吖唳、阿那曲唑、天冬酰胺酶、beg、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡钼、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺钼、克拉曲滨、氯膦酸盐、秋水仙素、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、己二烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木素、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、亮丙立德、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利钼、紫杉醇、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、P卜菲尔钠(porfimer)、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、苏拉明、他莫昔芬、泰素、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、二氯环戊二烯钛、托泊替康、曲妥珠单抗、维A酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。在一些实施方案中，可将包含抗⑶200抗体或其⑶200结合片段的药物组合物与一种或多种任何上述药物或本文所述的任何其它抗癌药共同配制。可按其作用机制将这些化疗用抗肿瘤化合物分类为包括例如以下组别的各组抗 代谢药/抗癌药，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟脲苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉曲滨))；抗增殖药/抗有丝分裂药，包括长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物、微管破坏剂例如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本、表鬼曰毒素类(epidipodophyllotoxins)(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA破坏剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡钼、苯丁酸氮芥、顺钼、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺制剂(cytoxan)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲蜜胺、奥沙利钼、异环磷酰胺、美法仑、氮芥、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、泰素、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16));抗生素，例如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(系统性代谢L-天冬酰胺并耗尽不能合成其自身天冬酰胺的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷化剂，例如氮芥类(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、氮丙啶类和甲基三聚氰胺(六甲蜜胺和塞替派)、烷基磺酸酯-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链佐星)、三氮烯(trazenes)-达卡巴嗪(DTIC);抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；钼配位络合物(顺钼、卡钼)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和凝血酶的其它抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活物、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯批格雷、阿昔单抗；抗转移剂；抗分泌剂(布雷菲尔德菌素(breveldin));免疫抑制药(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、麦考酚酸酯)；免疫调节药(沙利度胺及其类似物例如来那度胺(lenalidomide，ReVlimid、CC-5013)和CC-4047(Actimid))、环磷酰胺；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木素)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维A酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活物；和染色质破坏剂。在一些实施方案中，本文所描述的方法可包括，在给予抗CD200抗体之后，监测所述人的病症和/或其一种或多种症状的改善。监测人的病症(例如癌症、炎性病况或骨丢失相关病症)的改善(如本文所定义)，意指评价所述受试者的疾病参数的变化，例如疾病的一个或多个症状的改善。在一些实施方案中，在给予之后的至少I小时,例如至少2、4、
6、8、12、24或48小时、或至少I天、2天、4天、10天、13天、20天或更长、或至少I周、2周、4周、10周、13周、20周或更长时间进行评价。可在一个或多个以下时期对人进行评价在治疗开始之前；治疗期间；或在一个或多个治疗要素已给予之后。评价可包括评价进一步治疗的需要，例如评价剂量、给予频率或治疗持续时间是否应当改变。也可包括评价增加或减少所选治疗方式的需要，例如增加或减少对本文所述的病症的任何治疗。
在一些实施方案中，监测治疗性治疗的进程和/或有效性包括监测在治疗之前和之后癌细胞的CD200表达水平。在一些实施方案中，监测治疗性治疗的进程和/或有效性包括监测在治疗之前和之后癌细胞的CD5表达水平。在一些实施方案中，监测治疗性治疗的进程和/或有效性包括监测在治疗之前和之后癌细胞的⑶200和⑶5表达水平。例如，可确定治疗前癌细胞的CD200和/或CD5表达的水平，在给予至少一次治疗后，可再次测定CD200和/或CD5的水平。癌细胞的CD200和/或CD5表达的降低可表明有效治疗(见下文)。从业人员可采用癌细胞的CD200和/或CD5表达水平的测量作为增加治疗的剂量或频率的指导。当然应当了解的是，可直接监测⑶200和/或⑶5水平，或者，可监测与⑶200和/或CD5相关的任何标志物。因为将抗⑶200抗体给予动物降低动物中⑶5+细胞的浓度，认为出于上述原因，尤其在CD5+慢性淋巴细胞性白血病的情况下，在人中以足以维持CD5+细胞降低的浓度的量和频率将抗CD200抗体给予人是有益的。用于检测细胞(例如癌细胞例如B细胞CLL细胞)的CD5的表达或表达改变的方法是本领域众所周知的(例如蛋白质印迹、免疫组织化学和流式细胞术技术)并描述于本文。例如，在将抗CD200抗体给予人后，可通过存在于获自患者的生物样品的癌细胞的流式细胞术分析，来测定人中CD5+癌细胞的浓度。可将治疗后CD5+癌细胞的浓度与对照浓度(例如用抗体治疗前人中的CD5+癌细胞浓度)进行比较，其中CD5+癌细胞中浓度的降低表明，已以足以降低人中CD5+细胞的浓度的量和频率将抗⑶200抗体给予人，因此该抗⑶200抗体是治疗有效的。通过重复过程，开业医生可确定维持患者中⑶5+癌细胞降低的浓度所需要的合适剂量和各剂量的给药频率。例如，开业医生可以降低(或至少预期降低)CD5+癌细胞的浓度的量将抗⑶200抗体给予癌症患者一次或多次(例如I、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次或者例如至少3、4、5、6、7或8次或更多次)。所述至少2次剂量在时间上应间隔至少I天(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或甚至14天)。含有癌细胞的生物样品(例如血液样品)在不同时间获自患者，例如在第一次抗CD200抗体给予前、在第一剂量和至少一个另外的剂量之间和在第二剂量后的至少一次生物样品收集。在一些实施方案中，可在剂量之间至少两次和/或在给予患者的最后剂量后至少一次收集生物样品。然后针对⑶5+癌细胞的相对百分比，探询所获得的各生物样品中的癌细胞以确定给予抗CD200的抗体的量和/或频率是否足以维持CD5+癌细胞的降低的浓度。掌握有关患者随时间推移的CD5+癌细胞浓度和通过将抗CD200抗体给予患者随时间推移对CD5+癌细胞浓度的影响的信息，开业医生(和/或计算机)可确定患者的抗⑶200抗体给药方案，其足以维持在治疗过程中患者中的CD5+癌细胞的降低的浓度。如上所述，可与抗CD20治疗(例如利妥昔单抗)联合进行治疗。可作为固定剂量或以毫克/千克(mg/kg)剂量给予本文所述抗体(例如抗CD20抗体或抗CD200抗体)。在一些实施方案中,还可选择剂量以降低或避免针对组合物中的一种或多种活性抗体的抗体或其它宿主免疫应答的产生。虽然绝无意限制，但抗体的示例性剂量包括例如 1-100 μ g/kg,0. 5-50 μ g/kg、0. 1-100 μ g/kg、0. 5-25 μ g/kgU-20 μ g/kg、和 1-10 U g/kg>1-100 mg/kg、0. 5-50 mg/kg、0. 1—100 mg/kg、0. 5-25 mg/kg、1-20 mg/kg和1-10 mg/kg。本文所述抗体的示例性剂量包括而不限于0. I μ g/kg、0. 5 μ g/kg、l. 0μ g/kg>2. 0 μ g/kg、4 yg/kg和8 μ g/kg、0. I mg/kg、0. 5 mg/kg、1.0 mg/kg、2. 0 mg/kg、 4mg/kg和8 mg/kg。示例性剂量还包括例如大于或等于50 mg/m2、75 mg/m2>100 mg/m2、150 mg/m2、200 mg/m2、250 mg/m2、300 mg/m2、350 mg/m2、400 mg/m2、450 mg/m2、500 mg/m2、550 mg/m2 和 / 或 600 mg/m2。药物组合物可包含治疗有效量的本文所述的抗体。部分地根据所给予抗体的效应或者抗体和一种或多种额外的活性剂(如果使用不止一种试剂的话)的组合效应，本领域普通技术人员可以容易地确定这样的有效量。治疗有效量的本文所述的抗体也可因例如以下各因素的不同而异个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体(和一种或多种额外的活性剂)引发个体的所需反应的能力，例如改善至少一个条件参数，例如改善癌症的至少一个症状和/或本文所述的至少一种免疫调节效应的生物标志的存在情况。治疗有效量也是组合物的治疗性有益效应超过任何有毒或有害效应的量。可通过已知药学方法在细胞培养物或实验动物(例如癌症或自身免疫性疾病的动物模型)中测定这类组合物的毒性和治疗功效。可使用这些方法以测定例如LD5tl (对群体的50%致死的剂量)和ED5tl (在群体的50%中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用间的剂量比率为治疗指数，且它表示为比率LD5(i/ED5(i。优选具有高治疗指数的抗CD200抗体和/或抗CD20治疗剂(例如抗CD20抗体)。虽然可使用具有毒副作用的组合物，但应小心以设计递送系统，其将这类化合物靶向受累组织部位，并使对正常细胞的潜在损伤减到最小，从而降低副作用。下面的实施例欲说明而非限制本发明。
实施例实施例I.在自身免疫性溶血·性疾病的小鼠模型中，抗CD200抗体的功效
研究O (预防模型)。使用自身免疫性溶血性疾病的小鼠模型，测试治疗性抗CD200抗体预防、延迟与自身免疫性溶血性疾病相关的自身抗体的产生或减轻其严重程度的能力。参见例如 Playfair 和 Marshall-Clarke (1973) Nat New Biol2A3>: 213-214 Naysmith 等(1981) Iimunol Rev^: 55-87。为了在小鼠中引发与小鼠红细胞(RBC)结合的自身抗体的产生，在研究的第O天将2 X IO8个大鼠RBC经腹膜内(i. p.)给予雌性C57BL/6小鼠I次，并在此后，在研究的剩余时间内每周给予I次。到研究的第2周观察到免疫小鼠产生抗大鼠RBC同种抗体并到第3周观察到所述小鼠产生抗小鼠RBC自身抗体。将经大鼠RBC免疫的小鼠分为6个实验组，称为组别I (6只小鼠)、组别2 (6只小鼠)、组别3 (8只小鼠)、组别4 (7只小鼠)、组别5 (9只小鼠)和组别6 (9只小鼠)。也评价额外I组即组别7 (6只小鼠)作为对照。组别7的小鼠既不用大鼠RBC免疫，也不接受以下所述的任何额外治疗。在第O天(即第一次给予大鼠RBC的当天)开始，按照以下方案，将治疗药或溶媒给予组别2到组别6的各组小鼠对于研究的每一周，按照每天I剂、连续5天给予5个剂量的药物或溶媒。组别I小鼠仅用溶媒即磷酸缓冲盐水(PBS)治疗。组别2小鼠按照上述治疗方案，使用5 mg/kg不与CD200结合、但具有效应子功能的对照抗体(IgG2a)治疗。组别3小鼠按照上述治疗方案，使用抗体I ( 一种具有效应子功能的抗CD200抗体(IgG2a))治疗，每个剂量为5 mg/kg。组别4小鼠用剂量为15 mg/kg的环孢菌素治疗。组别5小鼠用5 mg/kg对照抗体和15 mg/kg环孢菌素治疗。组别6小鼠用5 mg/kg剂量的抗体I和15 mg/kg剂量的环孢菌素治疗。抗体治疗经i. P给予。环孢菌素经皮下(s. c.)给予小鼠。分组设计和各组的治疗方案概述于表I。表I.研究O的分组设计和治疗方案
权利要求
1.一种用于治疗人的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给予患有自身免疫性疾病的人足以降低所述人中与自身免疫性疾病相关的自身抗体的浓度的量的抗CD200抗体，从而治疗所述自身免疫性疾病。
2.权利要求I的方法，其中给予抗CD200抗体降低自身抗体浓度达至少10%。
3.权利要求I或2的方法，其中给予抗CD200抗体降低自身抗体浓度达至少20%。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中给予抗CD200抗体降低自身抗体浓度达至少50%。
5.一种用于治疗人的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括以在人中保持与自身免疫性疾病相关的自身抗体的降低的浓度的量和频率，将抗CD200抗体长期给予患有自身免疫性疾病的人，从而治疗自身免疫性疾病。
6.权利要求5的方法，其中以与给予抗CD200抗体前自身免疫抗体的浓度相比保持自身免疫抗体的浓度降低大于50%的量和频率，将所述抗CD200抗体给予人。
7.一种用于治疗人的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括以足以通过在人中维持一种或多种下列生理状况而治疗自身免疫性疾病的量和频率，将抗CD200抗体给予有需要的人(i)与对照浓度相比，至少一种⑶200+白细胞亚群的降低的浓度；( )与对照浓度相比，F4/80+细胞的升高的浓度；和(iii)与对照浓度相比，至少一种骨髓干细胞亚群的降低的浓度。
8.权利要求7的方法，其中所述至少一种⑶200+白细胞亚群选自⑶3+/⑶200+细胞、CD45R+/CD200+ 细胞、CD5+/CD200+ 细胞、CD19+/CD200+ 细胞、CD138+/CD200+ 细胞和 CD200R+/CD200+细胞。
9.权利要求7的方法，其中所述至少一种骨髓干细胞亚群选自CD200+骨髓细胞、Igk+/CD200+ 骨髓细胞、CD138+/CD200+ 骨髓细胞、c-kit+/CD200+ 骨髓细胞和 c-kit+/CD200+/Lin_骨髓细胞。
10.权利要求7的方法，其中所述F4/80+细胞是F4/80+巨噬细胞。
11.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述至少一种⑶200+白细胞亚群或F4/80+细胞存在于人的外周血液中。
12.权利要求7-11中任一项的方法，其中以在人中维持所有3种生理状况的量和频率将所述抗体给予人。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述自身免疫性疾病是溶血性病症。
14.权利要求13的方法，其中所述自身免疫性疾病是自身免疫性溶血性贫血。
15.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述自身免疫性疾病选自慢性阻塞性肺病、I型糖尿病、古德帕斯彻综合征、格雷夫斯病、格-巴综合征、IgA肾病、硬皮病、斯耶格伦综合征、韦格纳肉芽肿病、寻常型天疱疮、类风湿性关节炎、冷凝集素病、抗磷脂综合征、温型自身免疫性溶血性贫血、阵发性冷性血红蛋白尿、桥本病、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、肺胆汁性肝硬化和米勒-费希尔综合征。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述自身免疫性疾病与人类癌症相关。
17.权利要求16的方法，其中所述癌症是液体肿瘤。
18.权利要求17的方法，其中所述液体肿瘤是慢性淋巴细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
19.权利要求18的方法，其中所述慢性淋巴细胞性白血病是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其还包括将用于治疗自身免疫性疾病的至少一种另外的治疗剂给予人。
21.一种用于治疗患有癌症的人的方法，所述方法包括以足以治疗癌症的量将抗CD200抗体给予患有癌症的人，其中所述癌症对用抗CD20治疗剂的治疗有抗性或疑似有抗性。
22.—种用于治疗患有癌症的人的方法，所述方法包括鉴定人为患有对用抗CD20治疗剂的治疗有抗性或疑似有抗性的癌症的人；和以有效治疗所述癌症的量将抗CD200抗体给予所述人。
23.权利要求21或22的方法，其中所述癌症包含表达⑶5的癌细胞。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中将不止一个剂量的抗⑶200抗体给予人。
25.权利要求21-24中任一项的方法，其中将超过10个剂量的抗CD200抗体给予人。
26.权利要求21-25中任一项的方法，其中所述癌症是液体肿瘤。
27.权利要求26的方法，其中所述液体肿瘤是慢性淋巴细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
28.权利要求27的方法，其中所述慢性淋巴细胞性白血病是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
29.一种用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，所述方法包括以足以治疗所述液体肿瘤的量将抗CD200抗体给予患有液体肿瘤的人，其中液体肿瘤细胞的至少一部分表达CD5。
30.权利要求29的方法，其还包括确定液体肿瘤细胞的所述部分是否表达CD5。
31.一种用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，所述方法包括鉴定人为患有包含表达CD5的细胞的液体肿瘤的人；和以足以降低人的CD5表达液体肿瘤细胞的浓度的量，将抗CD200抗体给予人，从而治疗所述液体肿瘤。
32.—种用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，所述方法包括将抗CD200抗体和抗CD20治疗剂给予患有液体肿瘤的人，从而治疗所述液体肿瘤，其中在给予所述抗体和药剂之前，至少一部分的液体肿瘤细胞表达⑶5。
33.一种用于治疗患有液体肿瘤的人的方法，所述方法包括鉴定人为患有包含表达CD5的肿瘤细胞的液体肿瘤的人；和将抗CD200抗体和抗CD20治疗剂给予人，从而治疗所述液体肿瘤。
34.权利要求32或33的方法，其中所述抗CD20治疗剂在给予抗CD200抗体之前给予。
35.权利要求34的方法，其中所述抗CD200抗体在给予抗CD20治疗剂之前给予。
36.权利要求32或33的方法，其中所述抗⑶200抗体和抗⑶20治疗剂通过相同途径给予。
37.权利要求32-36中任一项的方法，其中所述抗⑶200抗体和抗⑶20治疗剂作为与人CD200和与人CD20结合的双特异性抗体同时给予。
38.权利要求29-37中任一项的方法，其中至少1%的液体肿瘤细胞表达⑶5。
39.权利要求29-38中任一项的方法，其中至少5%的液体肿瘤细胞表达⑶5。
40.权利要求29-39中任一项的方法，其中至少10%的液体肿瘤表达⑶5。
41.权利要求29-40中任一项的方法，其中所述液体肿瘤是慢性淋巴细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
42.权利要求41的方法，其中所述慢性淋巴细胞性白血病是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
43.权利要求21-28或32-37中任一项的方法，其中所述抗⑶20治疗剂是抗⑶20抗体。
44.权利要求43的方法，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。
45.权利要求43的方法,其中所述抗⑶20抗体是奥法木单抗、TRU-015>veltuzumab、奥瑞珠单抗或AME-133v。
46.权利要求43的方法，其中所述抗CD20抗体是毒素-抗体缀合物。
47.权利要求46的方法，其中所述毒素是小分子药物或毒性多肽。
48.权利要求46的方法，其中所述毒素是放射性试剂。
49.权利要求48的方法，其中所述放射性试剂是90Y、186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Pb、212Bi、213Bi、123I、125I、131I、mIn、211At、32P、177Lu、47SC、1(l5Rh、1(l9Pd、153Sm 或 199Au。
50.权利要求46、48或49的方法，其中所述毒素-抗体缀合物是9°Y_替伊莫单抗或mI-托西莫单抗。
51.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述抗⑶200抗体抑制⑶200和⑶200R之间的相互作用。
52.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述抗⑶200抗体含有下列配对的⑶R组包含氨基酸序列GFTFSGFAMS (SEQ ID Ν0:4)的重链⑶Rl (HCDRl);包含氨基酸序列SISSGGTTYYLDSVKG (SEQ ID NO:5)的重链 CDR2 (HCDR2);包含氨基酸序列GNYYSGTSYDY(SEQ ID NO:6)的重链 CDR3 (HCDR3);包含氨基酸序列RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:7)的轻链CDRl (LCDRl);包含氨基酸序列RASNLES (SEQ ID NO:8)的轻链⑶R2 (LCDR2);和包含氨基酸序列QQSNEDPRT (SEQ ID NO :9)的轻链 CDR3 (LCDR3)。
53.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体含有下列配对的CDR组包含氨基酸序列GFNIKDYYMH (SEQ ID NO: 10)的HCDRl ;包含氨基酸序列WIDPENGDTKYAPKFQG (SEQ ID NO: 11)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列KNYYVSNYNFFDV (SEQ IDNO: 12)的HCDR3 ;包含氨基酸序列SASSSVRYMY (SEQ ID NO: 13)的LCDRl ;包含氨基酸序列DTSKLAS (SEQ ID NO: 14)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列FQGSGYPLT (SEQ ID NO: 15)的LCDR3。
54.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体含有下列配对的CDR组包含氨基酸序列GFNIKDYYIH (SEQ ID NO: 16)的HCDRl ;包含氨基酸序列WIDPEIGATKYVPKFQG (SEQ ID NO: 17)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列LYGNYDRYYAMDY (SEQ IDNO: 18)的HCDR3 ;包含氨基酸序列KASQNVRTAVA (SEQ ID NO: 19)的LCDRl ;包含氨基酸序列LASNRHT (SEQ ID NO:20)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列LQHWNYPLT (SEQ ID NO:21)的LCDR3。
55.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体含有下列配对的CDR组包含氨基酸序列GYSFTOTI IL (SEQ ID NO: 22)的HCDRl ;包含氨基酸序列HIDPYYGSSNYNLKFKG (SEQ ID NO: 23)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列SKRDYFDY (SEQ IDNO:24)的HCDR3 ;包含氨基酸序列KASQDINSYLS (SEQ ID NO:25)的LCDRl ;包含氨基酸序列RANRLVD (SEQ ID NO:26)的LCDR2 ;和包含氨基酸序列LQYDEFPYT (SEQ ID NO:27)的LCDR3。
56.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体含有下列配对的CDR组包含氨基酸序列GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 28)的HCDRl ;包含氨基酸序列GVNPNNGGALYNQKFKG (SEQ ID NO:29)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列RSNYRYDDAMDY (SEQ IDNO:30)的 HCDR3 ;包含氨基酸序列KSSQSLLDIDEKTYLN (SEQ ID N0:31)的 LCDRl ;包含氨基酸序列LVSKLDS (SEQ ID NO:32)的 LCDR2 ;和包含氨基酸序列WQGTHFPQT (SEQ IDNO :33)的 LCDR3。
57.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体含有下列配对的CDR组包含氨基酸序列AFNIKDHYMH (SEQ ID NO: 34)的HCDRl ;包含氨基酸序列WIDPES⑶TEYAPKFQG (SEQ ID NO: 35)的 HCDR2 ;包含氨基酸序列FNGYQALDQ (SEQ IDNO:36)的HCDR3 ;包含氨基酸序列TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO:37)的LCDRl ;包含氨基酸序列STSNLAS (SEQ ID NO: 38)的 LCDR2 ;和包含氨基酸序列RQYHRSPPIFT (SEQ ID NO:39)的 LCDR3。
58.权利要求1-57中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体是IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgA、IgD 或 IgE 抗体。
59.权利要求1-58中任一项的方法，其中所述抗CD200抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或人抗体。
60.权利要求1-58中任一项的方法，其中所述抗⑶200抗体是选自以下的⑶200结合抗体片段Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv片段、微型抗体、双抗体或三链抗体。
61.一种用于为患有液体肿瘤的患者选择疗法的方法，所述方法包括鉴定患者为患有包含表达CD5的肿瘤细胞的液体肿瘤的患者；和为患者选择抗CD200抗体用于治疗所述液体肿瘤。
62.—种用于处方开给患有液体肿瘤的患者疗法的方法，所述方法包括鉴定患者为患有包含表达CD5的肿瘤细胞的液体肿瘤的患者；和处方开给患者抗CD200抗体用于治疗所述液体肿瘤。
63.权利要求61或62的方法，其中所述抗CD200抗体是双特异性抗体。
64.权利要求61或62的方法，其中所述双特异性抗体包含第一抗原结合部位和第二抗原结合部位，其中第一抗原结合部位与CD200结合，第二抗原结合部位与CD20结合。
65.一种双特异性抗体，其包含与CD200蛋白结合的第一抗原结合部位和与CD20蛋白结合的第二抗原结合部位。
66.权利要求65的双特异性抗体，其中所述抗体是单链双抗体、串联单链Fv片段、串联单链双抗体或包含单链双抗体和免疫球蛋白重链恒定区的至少一部分的融合蛋白。
67.权利要求65的双特异性抗体，其中所述抗体是双重可变域免疫球蛋白。
68.权利要求65-67中任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部位与人⑶200蛋白结合。
69.权利要求68的双特异性抗体，其中所述人⑶200蛋白包含SEQID NO: 1-3中任一个所示氨基酸序列。
70.权利要求65-69中任一项的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部位与人CD20蛋白结合。
71.权利要求70的双特异性抗体，其中所述人⑶20蛋白包含SEQID NO:40-42中任一个所示的氨基酸序列。
72.权利要求70或71的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部位在表位上与人⑶20蛋白结合，所述表位包含SEQ ID NO: 41所示的至少部分氨基酸序列和SEQ ID NO:42所示的至少部分氨基酸序列。
73.权利要求65-72中任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合部位获自Samalizumab0
74.权利要求65-72中任一项的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部位获自利妥昔单抗、奥法木单抗、TRU-015> veltuzumab、奥瑞珠单抗或AME_133v。
75.一种核酸，其编码权利要求65-74中任一项的双特异性抗体。
76.—种表达载体,其包含权利要求75的核酸。
77.一种细胞，其包含权利要求76的载体。
全文摘要
本公开内容涉及抗CD200抗体，并涉及所述抗体在用于治疗自身免疫性疾病和癌症的方法中的应用。本公开内容特征还在于用于为患有自身免疫性疾病和/或癌症的患者选择或处方开给治疗方式的生物标志。另外，本公开内容的特征在于使用与一种或更多种另外的治疗剂(例如抗CD20治疗剂)组合的抗CD200抗体的治疗方法。
文档编号C07K16/28GK102918062SQ201180018388
公开日2013年2月6日 申请日期2011年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者R.P.罗瑟, Y.颜 申请人:阿雷克森制药公司