移除免疫球蛋白聚集物的制作方法

文档序号:3586616
专利名称:移除免疫球蛋白聚集物的制作方法
移除免疫球蛋白聚集物本文报道了通过选择性吸附至未衍生化的孔度受控的玻璃,从单体免疫球蛋白中分离二聚体和寡聚体免疫球蛋白的方法。
背景技术
蛋白质,尤其是免疫球蛋白在目前的医学产业中发挥重要的作用。在制药应用中使用的多肽主要是在哺 乳动物细胞中生产的,例如CHO细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER. C6 细胞等。由于其化学和物理的特性,例如分子量和包括二级修饰的结构域构造,免疫球蛋白的下游加工是非常复杂的。例如,不仅对于配制的药物,而且也对于下游加工(DSP)中的中间产物,浓缩的溶液是实现经济化处理和应用储藏的小体积所必需的。生物技术生产的免疫球蛋白的下游加工一般包括三个层析步骤使用例如蛋白A的第一亲和层析步骤,以移除非免疫球蛋白分子,随后通常为2个离子交换层析步骤,最后一个步骤是移除DNA和HCP污染物的所谓的抛光步骤。纯化的免疫球蛋白是在低浓度溶液中获得的,在将抗体配制为药物制剂之前需要浓缩步骤。由于在下游加工过程中所需要的非天然的条件,通常单体的免疫球蛋白倾向于形成二聚体、寡聚体和更高阶的聚合物。这些聚合物不具有预期的单体免疫球蛋白的抗原结合活性并且需要被移除。Ghose, S.等人(Biotechnol. Bioeng. 87 (2004) 413-423)报道了在未衍生化的娃石上制备蛋白质纯化。Reifsnyder, D. H.等人(J. Chrom. A 753 (1996) 73-80)报道了使用乙醇和NaCl的组合,从粗制的发酵肉汤和特定洗脱液中捕获IGF-I。Lifsics,M. R.和Williams, R. C. Jr (Biochem. 23(1984)2866-2875)报道了在8M尿素中在孔度受控的玻璃上进行分子筛层析,用于从牛神经纤维中分离蛋白质的单体和聚集的形式。Ghose,S.等人(Abstracts of Papers,224th ACS National Meeting,Boston,MA,United States,August18-22, 2002(2002), BI0T-317Publisher American Chemical Society,Washington,D. C.)报道了未衍生化的裸露硅胶作为制备的静态相用于蛋白质的加工纯化的用途。在US 4,606,825中,报道了使用具有非交联的共价结合的聚乙烯亚胺功能的孔度受控的玻璃来分离和回收免疫球蛋白G的方法。US2002/0010319中报道了使用离子交换层析树脂和梯度洗脱,从包含二聚体和/或多聚体的混合物中分离多肽单体的方法。Mizutani,T.和 Mizutani,A.,J. Chrom. 168(1979) 143-150 报道了在孔度受控的玻璃和羧甲基纤维素上层析的蛋白质的洗脱模式的比较。DE 39 07 162 Al中报道了使用具有羧甲基化的孔度受控的玻璃层析对髓过氧化物酶的分离和纯化。发明概述已发现在未衍生化的孔度受控的玻璃(uCPG)表面选择性结合存在于pH值为从pH5至pH 7. 5的溶液中的二聚体和寡聚体(即,聚集的)G类免疫球蛋白(IgG)。通过应用每克总IgG从50m2至150m2uCPG表面,多至95%的可溶性聚集物结合于颗粒(由SE-HPLC确定)。同时,仅约10%至20%的单体吸附到表面上。这可以通过向包含单体和聚集物的溶液中分批添加uCPG并其后通过离心或过滤移除具有结合的聚集物的uCPG,来容易地实现。蛋白质与uCPG经过6天孵育不导致形成聚集物。此外,在与uCPG孵育后,没有观察到蛋白质二级或三级结构的可检测的改变。因此,本文报道的一个方面是用于获得单体形式或聚集形式的多肽的方法,其中所述方法包括下列步骤a)提供包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液,b)在从pH4至pH6的pH值下,孵育溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,和c)从孵育的溶液中回收多肽并从而获得单体形式的多肽,或下列步骤a)提供包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液, b)在从pH4至pH6的pH值下,孵育所述溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,c)从溶液中移除孔度受控的玻璃,d)用pH值为从pH 2至pH 3,或从pH 7至pH 8的溶液孵育移除的孔度受控的玻璃,从而获得聚集形式的多肽。本文报道的另一个方面是生产多肽的方法,包括a)提供包含编码多肽的核酸的真核细胞,b)培养细胞,以表达多肽,c)从细胞或培养基中回收多肽,d)在从pH 4至pH 6的pH值下,孵育包含回收的多肽的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,和e)从孵育的溶液中回收多肽并从而生产多肽。在一个实施方案中,未衍生化的孔度受控的玻璃是未衍生化的孔度受控的玻璃珠。在进一步的实施方案中,使用具有每克多肽IOOm2至150m2的表面的未衍生化的孔度受控的玻璃。在另一个实施方案中,多肽是免疫球蛋白,或免疫球蛋白片段,或免疫球蛋白缀合物。还在一个实施方案中,通过各自PH值的缓冲溶液调节pH值。在进一步的实施方案中,方法是分批方法。还在一个实施方案中,溶液包含不连续的量的多肽,且溶液与不连续的量的、未衍生化的孔度受控的玻璃的孵育。还在一个实施方案中,溶液是缓冲溶液。在一个实施方案中,通过离心或过滤进行回收。在进一步的实施方案中,孵育I分钟至6小时。在一个实施方案中,全部方法可以包括下述步骤作为最终步骤-通过一个或多个层析分离步骤纯化多肽。本文还报道了的方面是未衍生化的孔度受控的玻璃用于在从pH 4至pH 6的pH值下吸附高分子量的多肽的用途。本文报道的其他方面是试剂盒的部分,包含a)未衍生化的孔度受控的玻璃珠,b) pH值为从pH 4至pH 6的缓冲溶液,c)pH值为从pH 2至pH 3的缓冲溶液,d) pH值为从pH 7至pH 8的缓冲溶液。发明详述一般而言,通常使用层析方法从聚集的免疫球蛋白以及其他高分子量化合物分离单体免疫球蛋白。现已发现,例如相比未衍生化的S印harose ,未衍生化的孔度受控的玻璃(uCPG)选择性结合溶液中存在的二聚体和寡聚体免疫球蛋白和高分子量化合物。例如可以从含有uCPG作为层析材料的层析柱的流通液中,或者从溶液与uCPG的孵育上清液中,回收单体免疫球蛋白。该效应在PH值约5.0的缓冲溶液中是显著的。使用每克免疫球蛋白约50m2至150m2uCPG表面,可以移除多至95%的聚集形式,并具有80%至90%的单体免疫球蛋白产率。uCPG的应用可用于在储藏前或者甚至在储藏后,从活性药物成分主体或最终的配制的物质中移除二聚体和寡聚体。“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物,不论其是天然或合成生产的。少于约20个氨基酸残基的多肽被称为“肽”。“蛋白质”是包含一条或多条多肽链或至少一条多于100个氨基酸残基的多肽链的大分子。多肽还可以包含非肽组分,例如碳水化合物基团。碳水化合物基团和其他的非肽取代基可以被其中生产多肽的细胞添加到多肽上,并随细胞的类型而变化。多肽在本文中是按照其氨基酸骨架结构定义的;取代基(如碳水化合物基团)一般不作说明,但仍然可以存在。 术语“免疫球蛋白”指包含基本由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽的蛋白质。已识别的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因和免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在,包括例如Fv、Fab和F(ab)2,以及单链(scFv)或双抗体。术语“完全的免疫球蛋白”表示包含两条轻免疫球蛋白链多肽(轻链)和两条重免疫球蛋白链多肽(重链)的免疫球蛋白。每条重和轻免疫球蛋白链多肽含有可变结构域(可变区,一般是氨基端部分),该结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。每条重和轻免疫球蛋白链多肽包含恒定区(一般是羧基端部分)。免疫球蛋白轻链或重链的可变结构域转而包含不同区段,即,4个框架区(FR)和3个高变区(CDR)。术语“免疫球蛋白片段”表示这样的多肽,所述多肽包含至少一个选自重链的可变结构域(Vh)、ChI结构域、铰链区、Ch2结构域、Ch3结构域或Ch4结构域,或者轻链的可变结构域(')或Q结构域的结构域。还涵盖了其衍生物和变体。例如,可以存在这样的可变结构域,其中一个或多个氨基酸或氨基酸区域缺失。术语“免疫球蛋白缀合物”表示这样的多肽,所述多肽包含通过肽键与其他多肽缀合的免疫球蛋白重链或轻链的至少一个结构域。其他多肽可以是非免疫球蛋白肽,如激素、或毒素、或生长受体、或抗融合(antifusogenic)肽或补体因子等。为了纯化重组生产的免疫球蛋白,可以使用不同柱层析步骤的组合。一般是蛋白A亲和层析后接一个或两个额外的分离步骤。最终的纯化步骤被称为“抛光步骤”,用于移除痕量杂质和污染物,如聚集的免疫球蛋白、残余的HCP (宿主细胞蛋白质)、DNA (宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。对于该抛光步骤可以使用流通模式中的阴离子交换材料。蛋白质回收和纯化可以使用不同的方法,如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如,蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如,阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合型交换)、亲硫吸附(例如,用β -巯基乙醇和其他SH配体)、疏水性相互作用或芳烃吸附层析(例如,用苯基琼脂糖凝胶、aza-arenophilic树脂或间氨基苯硼酸)、金属螯合亲和层析(例如,用Ni (II)-和Cu (II)-亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(如,凝胶电泳、毛细管电泳)。可以互换使用的术语“单体形式的免疫球蛋白”和“单体免疫球蛋白”,及其语法等价形式,表示不与第二种免疫球蛋白分子缔合的免疫球蛋白分子,即,其与另一种免疫球蛋白分子既不共价也不非共价结合。可以互换使用的术语“聚集形式的免疫球蛋白”和“聚集的免疫球蛋白”,和“ 二聚体免疫球蛋白”和“多聚体免疫球蛋白”,及其语法等价形式,都表示与至少一种额外的免疫球蛋白分子共价或非共价缔合,并且是以单峰从大小排阻层析柱中洗脱的免疫球蛋白分子。术语“单体形式”及其语法等价形式在本申请中不必须表示100%的免疫球蛋白分子以单体形式存在。它表示免疫球蛋白基本上是单体形式的,即,由大小排阻层析图的峰面积所确定的,至少90%的免疫球蛋白是单体形式的,在一个实施方案中,至少95%的免疫球蛋白是单体形式的,在另一个实施方案中,至少98%的免疫球蛋白是单体形式的,在其他实施方案中,至少99 %的免疫球蛋白是单体形式的,以及在最后的实施方案中,多于99%的免疫球蛋白是单体形式的。术语“单体和聚集形式”表示不与其他免疫球蛋白分子缔合的免疫球蛋白分子和与其他免疫球蛋白分子缔合的免疫球蛋白 分子的混合物。在该混合物中,单体形式和聚集形式均非唯一地存在。术语“高分子量(HMW)形式”表示多聚化的,即聚集的,免疫球蛋白,其中所述聚集物在水性缓冲溶液中仍然是可溶的。术语“100%”在本申请中表示除指定的组分外的组分的量低于提及的分析方法在指定的条件下的检测下限。术语“ 90 % ”、“ 95 % ”、“ 98%", “ 99 % ”在本申请中不表示确切的值,而是落入提及
的分析方法在指定的条件下的精确度内的值。层析材料包含核心材料和附着其上的层析官能团。核心材料可以是无机材料(如硅石、zeolithe、羟磷灰石或玻璃)、有机材料(如纤维素或琼脂糖)、或合成的聚合材料,如聚(甲基丙烯酸酯)。在一个实施方案中,本文报道的方法中使用的溶液是缓冲溶液。术语“缓冲溶液”表示这样的溶液,在所述溶液中,由于添加或释放酸性或碱性物质导致的pH改变被溶解的缓冲物质拉平。可以使用具有此类特性的任意缓冲物质。通常使用可药用的缓冲物质。在一个实施方案中,缓冲溶液选自由磷酸和/或其盐组成的磷酸盐缓冲溶液,或由乙酸和/或其盐组成的乙酸盐缓冲溶液,或由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸盐缓冲溶液,或吗啉缓冲溶液,或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液,或组氨酸缓冲溶液,或甘氨酸缓冲溶液,或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液。在另一个实施方案中,缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液,或乙酸盐缓冲溶液,或柠檬酸盐缓冲溶液,或组氨酸缓冲溶液。任选地缓冲溶液可包含额外的盐,如,例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。未衍生化的层析核心材料,尤其是未衍生化的孔度受控的玻璃,可用于选择性吸附多肽,尤其是聚集形式的免疫球蛋白,即二聚体和寡聚体的免疫球蛋白分子。一般而言,CPG珠具有约125 μ m的平均颗粒直径。本文中使用的CPG珠的比表面积确定为36m2/g。图IA中显示了未衍生化的孔度受控的玻璃、交联琼脂糖(S印harose )和聚(甲基丙烯酸酯)的吸附特性。一方面可见多肽可以结合未衍生化的孔度受控的玻璃,另一方面可见结合能力的强pH依赖性。如图IB中可见,ProSep vA ultra基质在pH 7. 5时表现出最高的IgG吸附。ProSep vA ultra是官能化的CPG材料,其中蛋白A亲和配体与玻璃表面偶联。在PH 5. O时,观察到CPG对IgG的吸附高于官能化的蛋白A凝胶对IgG的吸附。在pH 3. 0、5. O和7. 5的不同pH值下孵育IgG和uCPG之后,通过SE-HPLC分析上清液。观察到在pH 5. O和7. 5下与未衍生化的CPG珠孵育后,溶液几乎不含可溶性聚集物(图 2)。图6显示了相比上清液中的蛋白质浓度,在pH值为pH 5. O时孵育12小时后,吸附到uCPG上的IgG的量。可以在相对低的蛋白质浓度下达到饱和,并且在每平方米CPG 2. Omg IgG时可以达到最大吸附。当在pH值为pH 3. O的缓冲溶液中孵育负载了蛋白质的CPG时,可以实现定量的解吸附。在限定的条件下,通常报道硅石表面对蛋白质的吸附是可逆的。可以使用苛性化学溶剂,如氯仿、甲醇或2-丙醇(参见例如,Manning,J. N.等人,Journal of Chromatography B 487 (1989) 41-50 ;Stankovic, C. J.等人,Anal.Biochem. 184(1990) 100-103)。此外,除改变 pH 值外(参见例如,Edy,V. G.等人,J. Gen.Virol. 33(1976)517-521),可以使用离液序列高的盐(参见例如,Mecs, I.等人,Arch.Virol. 81(1984)303-311)。可以在pH 5. O时观察到最大吸附(图7)。当pH升高到IgG的等电点(IP)以上时,可以观察到IgG吸附减少(例如通过使用图8所示的ζ电势测量,确定IgG的IP为·8.0)。可以根据pH值滴定,确定IgG的ζ电势。纳米大小的CPG的表面电荷也依赖于pH值。可以确定CPG的IP约为4。在高于PH 4的pH值下,CPG的表面电荷从正电变为负电。例如,在约5的pH值下,将含有6. 8% HMW的溶液与0. Im2至IOm2的不同uCPG表面积孵育。使用SE-HPLC,在上清液中确定溶液中的HMW(高分子量化合物)残余百分比。图4显示了在孵育前初始存在的每克蛋白质中吸附到CPG表面积上的单体和HMW的百分比量。当使用每克IgG 50m2CPG表面时,可以吸附初始存在于溶液中的HMW的63%。初始存在于溶液中的单体的9%与颗粒结合。通过使用每克蛋白质约HOm2CPG表面,可以结合几乎95 %的HMW,而仅吸附22%的单体。在每克蛋白质约250m2CPG表面时,在CPG表面上可以吸附几乎100%的HMW(参见图5)。在每克蛋白质50m2和150m2CPG表面之间时,可以几乎完全移除寡聚体。在孵育过程中存在的CPG表面积对溶液中剩余的LMW(低分子量化合物)的量没有影响。因此,可溶性的免疫球蛋白聚集物可以吸附到未衍生化的CPG上。每克蛋白质可利用的CPG表面积可用于控制孵育后溶液中剩余的聚集和单体种类的量。在约5的pH值时,可以使用在每克蛋白质IOOm2至150m2之间的表面积从IgG溶液中移除60%至95%的可溶性聚集物,同时80%至90%的单体IgG仍然剩余在溶液中。在吸附到表面上之前、过程中和之后研究蛋白质构象。可以观察到,在6天的孵育过程中,没有蛋白质由于形成不溶性聚集物而损失。通过SE-HPLC确定的HMW的水平随着增加的CPG表面积而减少。在孵育I天后,如果将孵育延长5天,无法检测到可溶性聚集物水平的进一步降低。在上清液中未能测定到HMW增加。在一个实施方案中,孵育是Imin至24小时。在其他实施方案中,孵育是Imin至6小时。由FT-IR光谱学确定的,IgG暴露于uCPG不导致二级结构的构象改变。本文报道的一个方面是用于获得多肽的方法,包括步骤-在从pH4至pH6的pH值下,孵育多肽与未衍生化的孔度受控的玻璃。在一个实施方案中,在从pH4. 5至pH5. 5的pH值下使用未衍生化的孔度受控的玻璃。在另一个实施方案中,在约PH 5的pH值下使用uCPG。在另一个实施方案中,在缓冲溶液中进行孵育。术语“约”表示其后面的值不是确切值而是某个范围的中心点,在一个实施方案中是值的+/-10%,或在另一个实施方案中是值的+/-5%,或在其他实施方案中是值的+/-2%,或在一个实施方案中是值的+/-I %。如果值是以百分比给出的相对值,则术语“约”还表示其后面的值不是确切值而是某个范围的中心点,在一个实施方案中是值的+/-10%,或在另一个实施方案中是值的+/-5%,或在其他实施方案中是值的+/-2 %,或在一个实施方案中是值的+/_1%,其中范围的上限不能超过值的100%。在一个实施方案中,用于获得单体形式的多肽,尤其是免疫球蛋白的方法包括下列步骤a)在从pH4至pH6的pH值下,孵育包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃, b)回收上清液并从而从步骤a)的上清液中获得单体形式的多肽。在另一个实施方案中,用于获得聚集形式的多肽,尤其是免疫球蛋白的方法包括下列步骤a)在从pH4至pH6的pH值下,孵育包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,b)回收经孵育的未衍生化的孔度受控的玻璃,c)通过与具有与步骤a)的溶液的pH值相差至少2个pH单位的pH值的溶液孵育,从未衍生化的孔度受控的玻璃中回收聚集形式的多肽。在一个实施方案中,通过向包含多肽的溶液中添加限定的量的未衍生化的孔度受控的玻璃来进行孵育。还在一个实施方案中,通过将溶液应用于包含未衍生化的孔度受控的玻璃的层析柱来进行孵育。在第一个实施方案中,从孵育的上清液中回收多肽。在第二种实施方案中,从柱的流通液中回收多肽。在两种实施方案中,高分子量化合物的回收都是通过向孔度受控的玻璃应用具有与孵育溶液的PH值相差至少2个pH单位的pH值的溶液来进行的。在一个实施方案中,第一种方法是分批方法。在一个实施方案中,方法包括下列步骤-用蛋白A亲和层析纯化包含免疫球蛋白的溶液,-任选地用离子交换层析纯化免疫球蛋白,-在从pH4至pH 6的pH值下,孵育包含所获得的免疫球蛋白的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,-回收先前步骤的上清液并从而获得单体形式的免疫球蛋白。本文报道的另一个方面是用于生产单体形式的多肽,尤其是免疫球蛋白的方法,包括a)培养包含编码多肽的核酸的细胞,b)从细胞或培养基中回收多肽,c)在从pH 4至pH 6的pH值下,孵育多肽与未衍生化的孔度受控的玻璃,d)回收步骤c)的上清液并从而生产单体形式的多肽。在一个实施方案中,与未衍生化的孔度受控的玻璃孵育Imin至120min。图3显示了依赖于pH值和缓冲化合物的高分子量(HMW)化合物在未衍生化的孔度受控的玻璃上的积累。可见在约pH 5的pH值下,未衍生化的孔度受控的玻璃从免疫球蛋白溶液中吸附高分子量化合物,不依赖于缓冲物质。在一个实施方案中,缓冲物质选自乙酸或其盐,例如乙酸钠或乙酸钾,和柠檬酸或其盐,例如柠檬酸钠或柠檬酸钾。图4中将高分子量(HMW)化合物在未衍生化的孔度受控的玻璃上的吸附与单体免疫球蛋白的吸附相比较。可见HMW化合物的吸附量表现出对孔度受控的玻璃的表面积/使用的多肽的质量的指数依赖性。单体免疫球蛋白的吸附量表现出对孔度受控的玻璃的表面积/使用的多肽的质量的线性依赖性。图5中显示了不同处理的溶液的大小排阻层析图。可见例如使用每克多肽HOm2CPG表面积导致高分子量化合物的减少。图6中显示了未衍生化的孔度受控的玻璃的表面覆盖率。可见未衍生化的孔度受控的玻璃的表面覆盖率达到了 2mg/m2表面。通过改变pH值,吸附是可逆的。在一个实施方案中,通过将pH值从pH 5变为相差至少2个pH单位的pH值,在一个实施方案中,将p H值变为PH 3. O或变为pH7.0,从未衍生化的孔度受控的玻璃回收吸附的高分子量化合物。通过二阶导数UV-或IR-光谱学,可以显示吸附不影响二级或三级结构。由于从免疫球蛋白制剂中选择性吸附高分子量化合物,未衍生化的孔度受控的玻璃的用途可以适合于在下游加工结束时纯化活性药物成分,以移除剩余的聚集形式的免疫球蛋白。从PH 5至pH 6的操作pH值对应于主体活性药物成分的pH值。使用未衍生化的孔度受控的玻璃,可以移除寡聚体甚至二聚体的免疫球蛋白形式,这在下游加工的后期阶段是困难的。此外,可以通过简单地孵育未衍生化的孔度受控的玻璃珠与大量蛋白质溶液,并通过例如离心或过滤移除CPG而移除聚集物,来以分批模式进行处理。提供下列实施例和附图
以帮助理解本发明,所附权利要求中提出了本发明的实际范围。应理解,可以在不脱离本发明精神的条件下,对所述方法进行修改。附图描述图IA 比较未衍生化的孔度受控的玻璃(a)、交联琼脂糖(S^harose) (b)和聚(甲基丙烯酸酯)(c)在3. 0,5. O和7. 2的pH值时的吸附特性。B :在pH 3、pH 5、pH 7. 5时,IgG吸附到CPG基质上。关于孵育前初始存在的蛋白质质量的每平方米珠表面吸附的百分比蛋白质;在PH3. O (浅灰色)、pH 5.0(深灰色)和PH 7.5 (黑色)时的吸附;结果表示为3次测量的平均值土SD。图2每平方米CPG表面的残余HMW ;关于与表面孵育前初始存在的HMW的量的用SE-HPLC确定的上清液中的百分比HMW ;孵育前(浅灰色),在没有层析表面的条件下孵育(深灰色),和具有层析表面的条件下孵育(黑色);结果表示为3次测量的平均值土SD。图3依赖于pH值和缓冲化合物的高分子量(HMW)化合物在未衍生化的孔度受控的玻璃上的特异性积累的比较。图4IgG单体(空心)和HMW(黑色)在CPG上的吸附;在与O. I-IOm2CPG孵育前,初始存在20mg含有6. 8% HMW的IgG ;实验数据表示为3次测量的平均值土SD。图5在与多至每克蛋白质350m2CPG表面积孵育后,IgG溶液的SE-层析图;在与CPG孵育前,初始存在含有6. 8% HMW的20mg IgG (黑色谱线);通过颜色从黑色变为浅灰色,表不随增加的CPG表面而降低的UV-信号。图6CPG颗粒上IgG的吸附和解吸附等温线;吸附(黑色菱形)研究是在pH 5. O进行的,解吸附(空心菱形)是在PH 3. O进行的;结果表示为3次测量的平均值土SD。图7不同pH下CPG颗粒上IgG的吸附;实验是在2mg/ml或更高的可溶性蛋白质浓度下,以饱和方案进行的;结果表示为3次测量的平均值土SD。图8IgG (黑色)和纳米大小的CPG颗粒(灰色)的ζ电势滴定曲线;实验数据表示为3次测量的平均值土SD。实施例I材料和方法抗体取在组氨酸缓冲液pH 6. O中的完全纯化的大量嵌合人Fe (IgGl)/大鼠Fab抗体 (IgG A)进行实验。将等分样品透析进入IOOmM乙酸盐缓冲液pH 3. O、IOOmM乙酸盐缓冲液pH 5.0和200禮三(羟甲基)_氨基甲烷缓冲液pH 7. 5中。之后通过使用Sterivex-GV
O.22 μ m 过滤器(MiIlipore, Billerica, USA),过滤溶液。CPG使用来自Millipore (Billerica,USA)的孔度受控的玻璃(CPG 700)珠。化学品使用的所有其他化学品和试剂至少是分析级。使用购自Fluka(Steinheim,Germany)的酸性酸、购自Merck KG(Darmstadt, Germany)的朽1檬酸、盐酸、氢氧化钠和氯化钠、购自Angus (Ibbenbueren, Germany)的三(轻甲基)_氨基甲烧。L-组氨酸购自Ajinomoto(Raleigh, USA)。吸附到表面通过孵育限定的表面和限定的蛋白质质量,在不同的pH下研究CPG表面对单克隆抗体(mAb)的吸附。因此,悬浮珠的衆液,并与纯化的水(Milli-Q,Millipore,Billerica,USA)混合。通过真空过滤(O. 22 μ m纤维素滤片,Sartorius, Goettingen, Germany)收集珠,之后用纯化的水(Milli-Q, Millipore, Billerica, USA)漂洗。随后,在40°C干燥珠,并称重限定的质量,表示通过气体吸附(BET)确定的限定的表面。之后,在限定的pH将珠与蛋白质溶液混合,并在没有液面上空间的条件下,在回转式混合器RM5 (Froebel7Lindau,Germany)上以35rpm室温孵育12小时。然后,以10,OOOx g离心样品IOmin以分离珠与蛋白质溶液。用经离心的样品的上清液实施蛋白质浓度测定和SE-HPLC分析。制备三份样品,结果表示为平均值土 SD。通过制备含有5m2珠表面和0. 2mg/ml和6. 0mg/ml之间的多种浓度的mAb的样品,确定在不同的珠表面上的mAb的吸附等温线。如前所述,孵育样品12小时,并以10,OOOxg离心lOmin,以将珠与蛋白质溶液分离并确定上清液中的蛋白质浓度。通过从孵育前初始存在的蛋白质的量中减去在上清液中确定的蛋白质的量,确定被吸附的蛋白质的量。制备三份样品,结果表示为平均值土SD。为了观察在CPG表面上HMW的优先吸附,将在含有6. 8% HMW的IOOmM乙酸盐缓冲液PH 5中的IgG与0. I-IOm2CPG表面孵育。如前所述,孵育样品12小时并以10,OOOx g离心lOmin,以将珠与蛋白质溶液分离并确定上清液中的蛋白质浓度。此外,通过SE-HPLC分析上清液。通过从孵育前初始存在的HMW的量中减去在上清液中确定的HMW的量,分别确定吸附的HMW和单体的量。制备三份样品,结果表示为平均值土SD。
蛋白质浓度确定在减去缓冲液空白后,通过使用280nm和320nm处的光度吸收确定蛋白质浓度(UV-Vis 分光光度计 Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)。从 280nm处的吸光值中减去320nm处的吸光值,使用该吸光值根据朗伯-比尔定律来计算蛋白质含量。SE-HPLC在Summit HPLC-系统(Dionex, Idstein, Germany)上,用 TSK 3000SWXL 柱(TosohBioseparation, Stuttgart, Germany)进行大小排阻高压液相层析(SE-HPLC)实验。通过Dionex (Idstein, Germany)的UV 二极管阵列检测仪UVD170U,在280nm处监控洗脱峰。使用由200mM磷酸钾和250mM氯化钾组成的pH 7. O的水性缓冲液以及O. 5ml/min的流速,在室温进行等度层析。每个样品每次注射含有100 μ g mAb负载。通过使用Chromeleon软件·(Dionex, Idstein, Germany),手工对层析图积分。包括二聚体和较大可溶性寡聚体的高分子量种类(HMW)的百分比被测定为关于包括单体峰和低分子量种类(LMW)的峰的总面积的相对面积(mAU * min)。FT-IR 光谱学用锗晶体应用MIRacle 衰减全反射(ATR)池,用 Tensor 27 (Bruker Optics,Ettlingen, Germany)记录FT-IR光谱,来研究珠表面的蛋白质二级结构。在室温下将CPG珠与在pH 5.0的乙酸盐缓冲液中的611^/1111 IgG溶液孵育12小时。在孵育前,通过SE-HPLC确定,溶液表现出HMW水平为1.5%。以饱和模式进行孵育。在孵育后,用缓冲液洗涤珠。使用AquaSpec传输室研究通过使用200mM tris缓冲液pH 9. O而从珠上解吸附后的蛋白质的二级结构。对于每个从850-4000(3!^1记录的质谱,以双侧获取模式收集120-扫描干涉图,解析度为4CHT1。分别减去缓冲液和润湿的珠的参考光谱以获得蛋白质光谱。应用OPUS6. O软件(Bruker Optics,Ettlingen,Germany),通过矢量归一化和之后生成二阶导数和使用13点Savitsky-Golay光滑功能进行光滑,来编辑光谱。此外,关于条带密度和条带位置来校正以ATR模式记录的吸收光谱,以允许与以传输模式记录的光谱进行比较。因此,根据Fringeli (Fringeli,U. P. ,Chimia 46 (1992) 200-214)使用软件OPUS 6. O (Bruker Optics,Ettlingen,Germany)的延伸型ATR-校正,来克服波数依赖性的反常色散(Goldberg,Μ. E.,和 Chaffotte, A.F.,Protein Sci. 14(2005)2781-2792 ;Grdadolnik, J.,Int.J. Vibr.Spec. 6, H 2 版(2002)。测量ζ电势为了确定蛋白质和超声破碎的纳米大小的CPG 700在不同pH值下的电荷,使用Malvern Zetasizer Nano S(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)通过实施激光多普勒测速法,确定蛋白质和CPG 700珠的电泳迁移率。Zeta电势ζ是在假设均匀电荷分布的条件下,使用Malvern DTS软件从亨利方程计算的(5. O版,Malvern Instruments,Worcestershire, UK) 对于样品制备,将5mg/ml mAb溶液透析进入50mM乙酸盐缓冲液pH5. O中,之后通过使用0. 2M盐酸滴定到pH 2. O。将CPG 700珠悬浮在相同的缓冲系统中并调节 pH 至 2. O。通过使用滴定仪 MPT2 (Malvern Instruments, Worcestershire, UK),用
0.2M氢氧化钠溶液将样品从pH 2滴定至pH 12。在25°C,在控温的折叠毛细室(MalvernInstruments, Worcestershire, UK)中,以15个步骤确定pH 2至pH 12之间的ζ电势。每次测量重复三次,报告平均值土SD 。
权利要求
1.用于获得单体形式或聚集形式的多肽的方法,其特征在于所述方法包括下列步骤 a)在从pH4至pH6的pH值下,孵育包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,和 b)回收上清液并从而获得单体形式的多肽, 或下列步骤 a)在从pH4至pH6的pH值下,孵育包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃, b)从溶液中回收孔度受控的玻璃,和 c)孵育回收的孔度受控的玻璃和PH值为从pH2至pH3,或从pH7至pH8的第二种溶液并从而获得聚集形式的多肽。
2.生产多肽的方法,包括 a)培养包含编码多肽的核酸的真核细胞, b)从细胞或培养基中回收多肽, c)在从pH4至pH 6的pH值下,孵育包含回收的多肽的溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃,和 d)回收上清液并从而生产多肽。
3.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于未衍生化的孔度受控的玻璃是未衍生化的孔度受控的玻璃珠。
4.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于使用具有每克多肽IOOm2至150m2表面的未衍生化的孔度受控的玻璃。
5.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于所述多肽是免疫球蛋白,或免疫球蛋白片段,或免疫球蛋白缀合物。
6.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于所述溶液是各自pH值的缓冲溶液。
7.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于包括下述步骤作为最终步骤 -通过一个或多个层析分离步骤纯化多肽。
8.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于通过离心或过滤进行回收。
9.根据任一项上述权利要求的方法,其特征在于孵育I分钟至6小时。
10.未衍生化的孔度受控的玻璃用于在从pH4至pH 6的pH值下吸附高分子量的多肽的用途。
11.试剂盒,包含 a)未衍生化的孔度受控的玻璃珠, b)pH值为从pH 4至pH 6的缓冲溶液, c)pH值为从pH2至pH 3的缓冲溶液, d)pH值为从pH7至pH 8的缓冲溶液。
全文摘要
一般使用层析方法从重组生产的多肽中移除高分子量的化合物。已发现,未衍生化的孔度受控的玻璃(uCPG)选择性结合溶液中存在的高分子量化合物。可以从例如含有uCPG作为层析材料的层析柱的流通液中回收纯化的多肽。已发现此效应在pH值为约4至6的缓冲溶液中是显著的。使用每克多肽约100m2至150m2 uCPG表面,移除几乎80%至95%的高分子量化合物,多肽产率为80%至90%。
文档编号C07K16/06GK102884080SQ201180018715
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月13日 优先权日2010年4月14日
发明者S·黑普比尔迪克勒, W·库恩, E·罗森伯格, G·温特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
再多了解一些
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