呈pH依赖性抗原结合的抗体的制作方法

专利名称：呈pH依赖性抗原结合的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体，例如全长抗体或其抗原结合部分，所述抗体呈PH依赖性结合，致使所述抗体在内涵体pH/生理性pH(例如pH 5. 5/pH7. 4或pH 6. 0/pH 7. 4)的Kd及/或koff比是2或2以上。
现有技术
单克隆抗体(mAb)已经成为多种疾病的重要治疗选择(Brekke and Sandlie, NatRev Drug Discov 2 :52-62, 2003;Maggon, Curr Med Chem 14 :1978-1987，2007)。目前市面上大部分mAb是IgG抗体。它们相对较长的半衰期是由FcRn结合所介导。经由液相胞饮作用发生细胞对IgG的摄取，接着，该IgG与内涵体区室内的酸性环境(pH 6. O)下的FcRn结合(Lobo et al. , J Pharm Sci 93 :2645-2668, 2004)。与 FcRn 结合的 IgG 被认为通过再循环至细胞表面而免于降解，该处的中性PH有助于I gG解离及释放至循环中。相反地，一般认为未经结合的IgG被转运至溶酶体,接着被降解(Lencer and Blumberg, Trends CellBiol 1515 5-9,2005)。最近，通过导入特定取代以优化IgG抗体的功能活性的各种技术已被使用以减少剂量及/或给药频率并改善疗效及安全性(Presta, Curr. Opinion Immunol 20:460-470，2008)。通常，I gG抗体的优化可被分成影响抗体与FcRruFc y R及补体系统的结合的Fe恒定区的工程化及影响结合亲和性的可变区的工程化。数个研究描述恒定区的工程化以增加与Fe Y -受体的结合，因此增进IgGl抗体的效应物功能(Stavenhagen et al. , Cancer Res 67 :8882-8890, 2007; Zalevsky etal.，Blood 113 :3735-3743, 2009)。IgGl 中的取代诸如 S239D/I332E/A330L 或 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L已显示出可改善与Fe Y -受体IIIa的结合并显示相较于野生型IgGl更为优异的体外抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)活性及更为优异的体内疗效。因此，相较于野生型抗体，预期具有这种取代的抗体可在人体中在相同剂量下取得较好疗效或在较低剂量及/或较低给药频率下显示相同疗效。另一种减少剂量及/或给药频率的方法是减少IgG抗体的清除。报告指出，IgG抗体的长半衰期取决于其与FcRn的结合。因此，已广泛研究了通过工程化恒定区以增加IgG与FcRn于pH 6. O的结合亲和性但仍维持所述相互作用的pH依赖性的取代(Ghetie et al. , Nature Biotech. 15 :637-640, 1997;Hinton et al. , JBC 279 6213-6216，2004;Dali’Acqua et al. , J Immunol 117 :1129-1138, 2006)。变异体中的取代诸如M428L/N434S导致延长的半衰期及提高的药物药效学效应(Zalevsky et al.，NatureBiotech. 28 :157-159, 2010)。数个研究报告指出，通过导入诸如T250Q/M428L或M252Y/S254T/T256E的取代以增加在酸性pH下与FcRn的结合，进而成功地延长半衰期。在一项非人灵长动物的药物动力学试验中，IgGl的T250Q/M428L取代显示出35天的半衰期，显著延长了相较于野生型IgGl的14天的半衰期(Hinton et al. , J Immunol 176 346-356，2006)ο
虽然恒定区的取代可显著改善治疗性IgG抗体的功能，但在严格保守性的恒定区的取代可能具有在人体产生免疫原性的风险(Presta, supra, 2008;De Groot andMartin, Clin Immunol 131 :189-201，2009),而在高度多变性的可变区序列的取代可能较不具免疫原性。关于可变区的报告包括工程化CDR残基以改善抗体与抗原的结合亲和性(Rothe et al. , Expert Opin Biol Ther 6 :177-187, 2006;Bostrom et al. , MethodsMol Biol 525 :353-376,2009;Thie et al. ,Methods Mol Biol 525:309-322,2009)、工程化CDR及骨架残基以改善抗体的稳定性(Worn and Pl uckthun, J Mol Biol 305 989-1010, 2001;Ewert et al. ,Methods 34 :184-199, 2004)及减少抗体免疫原性的风险(De Groot and Martin, supra, 2009;Jones et al. , Methods Mol Bio 525 405-423，xiv, 2009)。这些报告指出，利用噬菌体或核糖体展示的随机文库通过亲和性成熟可实现针对抗原的亲和性的改善。基于序列及基于结构的合理设计可合理地获得改善的稳定性。可通过各种人源化方法及去除T细胞表位完成免疫原性风险降低(去免疫化)，其可利 用计算机技术预测或使用在体(insilico)技术或者通过体外分析测定。此外，可变区可经工程化以降低P〗。在这些抗体观察到相较于野生型抗体较长的半衰期，虽然具有可相比的FcRn结合力(Igawa et al. , PEDS, Advance Access, doi 10. 1093/protein/gzq009, 2010)o本发明涉及工程化或选择呈pH依赖性抗原结合的抗体以改良饰抗体及/或抗原半衰期。如果抗原介导的清除机制正常地降解抗体(当其与抗原结合时)，IgG2抗体的半衰期可能会被缩短。同样地，该抗原一抗体复合物可能影响抗原的半衰期，不是通过防止抗原受到典型的降解过程以延长半衰期，就是经由抗体介导的降解以缩短半衰期。本发明涉及在pH 7. 4相较于内涵体pH下(即pH 5. 5至6. O)对抗原具有较高的亲和性的抗体，致使在诸如pH 5. 5/pH 7. 4或在pH 6. 0/pH7. 4下的Kd比为2或2以上。本发明涉及对其抗原呈所述pH依赖性结合的抗体、及设计、制造及使用所述抗体的方法。有用的抗体实例以抗原诸如前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)亦称为NARC-I、IgE、dickkopf-相关蛋白I (DKK1)、补体5 (C5)、硬化蛋白(SOST)及GMCSF受体为靶点。PCSK9是一种在某些形式的家族性高胆固醇血症中被发现的基因突变蛋白质。PCSK9以酶原形式被合成，该酶原在内质网的特定模块(motif)经自催化加工。族群试验(population studies)显示，某些PCSK9突变是“获得功能”的突变且见于体染色体显性高胆固醇血症的个体，然而其他“失去功能(L0F)”的突变是与血浆胆固醇减少有关。此族群的发病率及死亡率试验清楚地显示，降低PCSK9的功能显著地减少心血管疾病的风险。

发明内容
本发明涉及抗体，所述抗体与其抗原呈pH依赖性结合，致使在生理性pH (即pH7. 4)的抗原结合亲和性高于在内涵体pH (即pH 6. O或5. 5)的抗原结合亲和性。换句话说，在 pH 5. 5/pH 7.4 或 pH 6· 0/ρΗ7· 4 的 Kd 或 Iitjff 比是大于或介于 2、3、4、8、10、16、20、30、40或100或100以上。这种pH依赖性抗体优先地在内涵体内与抗原解离。当抗原是经抗原介导清除的抗原的(例如PCSK9)时侯，相较于在pH 7. 4具有相等Kd值但无pH依赖性结合力的抗体，所述与抗原呈PH依赖性结合的抗体可具有增加的抗体半衰期。当与抗体(例如IL6)结合的抗原的清除减少时，呈pH依赖性结合的抗体可降低总抗原半衰期。呈pH依赖性结合的抗体亦可延长非与抗体结合的抗原的抗体介导性减少。此呈PH依赖性结合的抗体对于拮抗通常呈高量存在的标的抗原(例如IgE、DKKl、C5及SOST)而言可能是重要的。此外，当抗原是受体(例如GMCSF受体)且该受体与抗体结合时的清除增加时，所述抗体可增加抗原半衰期。本发明以下描述的任何实施方式中，Kd及kf可于25°C或37°C下测量。在优选的实施方式中，该呈pH依赖性结合的抗体在pH 7. 4相较于pH 6. O下以较高的亲和性与抗原特异性结合，其中在pH 6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中当暴露于该抗原时，相较于在pH 7. 4对该抗原具有类似亲和性但在pH 6.0/pH 7. 4的相当Kd及/或匕 比是小于2且不呈pH依赖性结合的抗体，该抗体具有减少的体内血浆清除率。优选地该抗原不是介白素-6受体(I L6R)，或优选地该抗体不是如WO 2010/106812或WO 2009/041621所揭示的抗-IL6R抗体Fv3_m73、Fv4-m73 或 H3pl/L73。在另一优选的实施方式中，该呈pH依赖性结合的抗体在pH 7. 4相较于pH 6. O下以较高的亲和性与抗原特异性结合，其中在pH 6. 0/pH7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，其中该抗原于体内具膜结合性及可溶性，且其中相 较于在pH7. 4对该抗原具有类似亲和性但在pH 6. 0/pH 7. 4的相当Kd及/或kf比是小于2的抗体，该抗体介导对细胞膜受体增加的定位。优选地该抗原不是IL6R，或优选地该抗体不是如 WO 2010/106812 或 W02009/041621 所揭示的抗-IL6R 抗体 Fv3_m73、Fv4_m73 或H3pl/L73。在另一优选的实施方式中，该抗原是非信号诱导的可溶性受体。在其他优选的实施方式中，该呈PH依赖性结合的抗体是介导抗体依赖性细胞介导性细胞毒性(ADCC)及/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体药物缀合物。本发明包括一种呈pH依赖性结合的抗体，该抗体在pH 7. 4相较于pH 6. O下以较高的亲和性与抗原特异性结合，其中在pH 6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中当非抗体结合的抗原暴露于该抗体时，相较于暴露在PH7. 4对该抗原具有类似亲和性但在pH 6. 0/pH 7. 4的相当Kd及/或kf比是小于2且不呈pH依赖性结合的抗体，该抗原于体内的量的减少被延长。本发明提供一种呈pH依赖性结合的抗体，该抗体在pH 7. 4相较于pH 6. O下以较高的亲和性与抗原特异性结合，其中在pH 6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中相较于在pH 7. 4对与抗体结合的抗原具有类似亲和性但在pH 6. 0/pH 7. 4的相当Kd及/或kf比是小于2且不呈pH依赖性结合的抗体，该抗原于体内的量减少。在优选的实施方式中，该抗原是骨桥素(osteopontin)。本发明还提供一种呈pH依赖性结合的激动剂抗体,该抗体在pH7. 4相较于pH 6.0下以较高的亲和性与抗原特异性结合，其中在PH6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或Uf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中该抗原是受体，且该受体当暴露于该抗体时，相较于暴露于在PH 7. 4对该受体具有类似亲和性但在pH 6. 0/pH7. 4的相当Kd及/或koff比是小于2的抗体，具有减少的体内清除率。在优选的实施方式中，该受体是GMCSF受体。在任何前述抗体的其他优选的实施方式中，于pH 6. 0/pH 7. 4的Kd比或Iitjff比是大于或介于20、30、40或100或100以上。在其他优选的实施方式中，优选的于pH 6.0/pH7. 4的Kd比或Iitjff比是介于2至3、2至4、2至8、2至10、2至16或2至20或2至20以上，或3至4、3至8、3至10、3至16或3至20，或4至8、4至10、4至16或4至20或4至20以上，或8至10、8至16、8至20或8至20以上，或10至16、10至20或10至20以上，或16至20或16至20以上。在其他先前所述抗体的优选的实施方式中，该于pH 7. 4及25°C下与抗原结合的抗体的Kd是介于约O. OlnM至约IOOnM,或更优选地介于约O. InM至约ΙΟηΜ。在其他先前描述抗体的较佳实施方式中，该抗体与抗原于pH 7. 4的结合的Iitjff是介于约Ix 10E_4s_l至约lxlOE-ls-l,更优选地介于约lxlOE-3 s_l至约IxlOE-I s_l。在前述抗体的另一优选的实施方式中，该抗原是PCSK9。在一优选的实施方式中，该抗-PCSK9抗体不是PCSK9抗体H1M300N (见US2010/0166768)。在其他优选的实施方式中，该抗原是IgE、C5或DKKl，且在优选的实施方式中，该Kd是介于I. OnM至约IOnM或介于I. OnM 至约 IOOnM0本发明还提供一种延长给药间隔及/或减少治疗剂量以利用治疗性抗体治疗病 患的方法，该方法包含对该病患施用治疗有效量的先前所述的本发明的抗体中的任一抗体，其中相较于在PH 7. 4具有类似亲和性但pH 6. 0/7. 4及25°C下的Kd比及/或koff比是小于2的抗体，该抗体具有延长的药物药效学效应及/或半衰期。本发明还包括通过pH依赖性调节抗体结合亲和性以制备具有延长的半衰期及/或药物药效学效应的抗体的方法，该方法包含选择可使影响PKa的微环境优化的抗体CDR组氨酸残基或其他残基，致使在PH6. 0/pH7. 4下抗体抗原结合的Kd比及/或I^ff比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上。本发明还考虑藉此方法制备的抗体，包括具有1、2、3、4、5个或更多个组氨酸取代CDR残基以使影响pKa的微环境优化的抗体。在上述方法的较优选的实施方式中，该方法另包含使抗体突变以达到在25°C及PH 7. 4测量时Kd为至少IOOnM的抗体亲和性。在另一实施方式中，本发明提供一种抗体库，其在CDR残基或其他残基富含组氨酸以使影响pKa的微环境优化。在其他优选的实施方式中，本发明提供一种分离的抗体，该抗体与PCSK9特异性结合且包含源自如SEQ ID NO :4或5所示的重链可变区(VH)氨基酸序列的VH互补决定区I (⑶R1)、VH⑶R2及VH⑶R3或在所述的⑶R1、⑶R2及/或⑶R3具有一、二、三或更多个保守性氨基酸取代的变异体。在优选的实施方式中，该抗体另包含如SEQ ID NO 3所示的轻链可变区(VL)氨基酸序列的VL⑶R1、⑶R2及⑶R 3或在所述的⑶R1、⑶R2及/或⑶R 3具有一、二、三或更多个保守性氨基酸取代的变异体。本发明还提供下述分离的抗体，其与PCSK9特异性结合且包含具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区I (⑶R1)、具有如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的VH⑶R2、及/或具有如SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或在所述的CDR1、CDR2及/或CDR3具有一或多个保守性氨基酸取代的变异体；以及下述分离的抗体，其与PCSK9特异性结合且包含具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的VH⑶R1、具有如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的VH CDR2、及/或具有如SEQ ID NO :9所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或在所述的⑶R1XDR2及/或⑶R3具有一、二、三个或更多个保守性氨基酸取代的变异体。在另一实施方式中，本发明考虑分离的抗体，该抗体包含具有如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)⑶R1、具有如SEQ ID NO :11所示的氨基酸序列的VL⑶R2及/或具有如SEQ ID NO : 12所示的氨基酸序列的VL⑶R3，或在所述的⑶R1XDR2及/或CDR3具有一、二、三个或更多个保守性氨基酸取代的变异体。在上述的较佳实施方式中，该抗体另包含具有如SEQ ID NO :10所示的氨基酸序列的VL CDRl、具有如SEQ ID NO : 11所示的氨基酸序列的VL CDR2及/或具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VIXDR3，或在所述的⑶R1、⑶R2及/或⑶R3具有一、二、三个或更多个保守性氨基酸取代的变异体，更佳地，该VH区包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5且该VL 区包含 SEQ ID NO 3 或在所述的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 及 / 或 SEQ ID NO 3 具有一、二、三个或更多个保守性氨基酸取代的变异体。在本发明的PCSK9抗体的另一较优选的实施方式中，该抗体具有一或多个Fe突变，优选地 N434S、N434H、M428L-N434H 双突变、M428L-N434A 双突变、T250Q-M428L 双突变或M428L-N434S双突变。 在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分是由保藏于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)且具有ATCC登记号PTA-10547或PTA-10548及/或PTA-10549的质粒所编码。本发明还包括医药组合物,所述组合物包含治疗有效量的任何前述的抗体、重组生产任何前述抗体的宿主细胞、编码任何前述抗体的分离的核酸及编码任何前述抗体的分离的核酸。本发明还包括一种减少有此需要的个体的血液LDL胆固醇的量的方法，该方法包含对该个体施用治疗有效量的以PCSK9抗原为靶点的本发明的任何抗体。


图I显示不同时间的抗体浓度增加为Kd比的函数。图2显示不同时间的游离配体(抗原)减少为Kd比的函数。图3A显示Iitjff改变对不同时间的抗体浓度的影响，且图3B显示km改变对不同时间的抗体浓度的影响。图4的热图显示呈pH依赖性结合的抗体降低血清抗原浓度的天数多出多少天，抗原血清浓度的降低以Kd (R)、抗原的血清半衰期及抗原的血清浓度为函数。R相当于在内涵体pH比生理性pH下的Kd比。图5证实该pH依赖性抗体模型的预测性。该模型成功地预测5A10的总抗体浓度(图5A)。图5B显示5A10对LDL的时间效应。图6亦证实该pH依赖性抗体模型的预测性。该模型成功地预测5L1721H23_6L3H3(6L3H3)的总抗体浓度(图6A)。图6B显示6L3H3对LDL的时间变化效应。相较于5A10，该pH依赖性结合抗体6L3H3延长其中LDL被降低的期间。图7显示施用各种PCSK9抗体对总胆固醇效应的时间量程。图7A显示5A10对总胆固醇的剂量依赖性效应。图7B显示pH依赖性抗体5L1721H23_6H3的剂量依赖效应。此pH依赖性抗体的效应相较于5A10的效应持久。图8显示呈pH依赖性结合的抗体5L1721H23_6H3及5L1721H23_6L3H3相较于不呈PH依赖性结合的抗体具有减少的抗体降解及延长的半衰期。图SB的图显示，图8A显示的效应是因标的介导性降解所致。在PCSK9基因敲除鼠体内的抗体降解在注射PCSK9后显著增加。图9的图显示pH敏感性PCSK9拮抗抗体及非pH敏感性PCSK9拮抗抗体对猴胆固醇量的效应。虽然未检测到HDL量的显著变化(图9A)，该pH敏感性抗体相较于非pH依赖性抗体L1L3介导较长时间的LDL量的减少(图9B)。图10显示呈pH依赖性结合的PCSK9抗体相较于非pH依赖性抗体具有延长的体内半衰期。图11的热图显示pH依赖性结合的常规模型。相较于不呈pH依赖性结合的抗体，所述以抗原DKK1、IgE或C5为标的的呈pH依赖性结合的抗体可显著增加该抗原经历减少
量的天数。图12显示在施用以抗原IgE为标的的呈pH依赖性结合的抗体后，IgE抗原浓度 的时间量程模型。图13显示在施用以抗原DKKl为标的的呈pH依赖性结合的抗体后，DKKl抗原浓度的时间量程模型。图14显示在施用以抗原C5为标的的呈pH依赖性结合的抗体后，C5抗原浓度的时间量程模型。图15详细说明用于建构模型的呈pH依赖性结合的抗体的穿越模型。本发明的详细说明本发明涉及抗体，所述抗体与其抗原呈pH依赖性结合，致使在生理性pH (即pH7. 4)的抗原结合亲和性高于在内涵体pH (即pH 6. O或5. 5)的抗原结合亲和性。换句话说，在 pH 5. 5/pH 7.4 或 pH 6· 0/ρΗ7· 4 的 Kd 或 Iitjff 比是大于或介于 2、3、4、8、10、16、20、30、40或100或100以上。所述pH依赖性抗体优先地在内涵体内与抗原解离。当抗原是经抗原介导性清除者(例如PCSK9)时，相较于在pH 7. 4具有相等Kd值但无pH依赖性结合力的抗体，所述与抗原呈PH依赖性结合的抗体可具有增加的抗体半衰期。当与抗体(例如IL6)结合的抗原的清除减少时，呈PH依赖性结合的抗体可降低平均总抗原半衰期。呈pH依赖性结合的抗体亦可延长非与抗体结合的抗原的减少。此呈pH依赖性结合的抗体对于拮抗通常呈高量存在的标的抗原(例如IgE、DKKl、C5及S0ST)而言可能是重要的。此外，当抗原是受体(例如GMCSF受体)且该受体与抗体结合时的清除增加时，所述抗体可增加抗原半衰期。若抗原介导祀点介导性(target-mediated)降解,那么当以该抗原举例来说进行靶点介导性清除时(例如PCSK9)，利用所述呈pH依赖性结合的抗体实现在内涵体内的解离可增加该抗体的药物药效学效应。该呈PH依赖性结合的抗体自该抗原解离后不再受抗原介导性降解，其可经FcRn结合后再循环至细胞外，且相较于在pH 7. 4具有类似Kd但无pH依赖性结合力的抗体，该呈pH依赖性结合的抗体将具有更长的半衰期。当可溶性抗原(例如IgE、C5、DKKl或SOST )以高浓度存在时，使用所述呈pH依赖性结合的抗体亦具有治疗效用。当抗体与内涵体内的抗原解离且抗原在溶小体内降解时，该抗体可再循环至血浆以与其他游离抗原结合，相较于在PH 7. 4具有类似Kd但无pH依赖性结合力的抗体，此抗体可延长非抗体结合的抗原的减少且可减少该所需的治疗剂量。此外，当抗原是以膜结合和可溶性两种形式存在时，例如受体，使用呈pH依赖性结合的抗体可有效地增进抗体与该膜结合形式抗原的结合。通过与该可溶性形式抗原解离，抗体有更多与膜形式抗原再结合的机会，使更多抗体接近细胞膜。若抗体与膜形式抗原经双价结合，经由亲和力(avidity)的作用，可能使该抗体的有效亲和性变高,或使该有效解离速率变慢。此可被应用于使用抗体药物缀合物(ADC)标的以膜结合及可溶性二种形式存在的抗原。在包含FcRn的内皮细胞中，可溶性抗原将被再循环至血浆区室内的ADC清除，使抗体得以与膜结合抗原结合。使用呈PH依赖性结合的抗体时，增加与膜结合形式的抗原的双价或单价性结合，将造成增加的抗体与膜结合抗原的内化及细胞死亡。若与该受体以双价结合，亲合力可能增加有效亲和性或减缓有效解离速率。ADCC及补体依赖性细胞毒性(⑶C)的机转亦可利用呈pH依赖性结合的抗体加以探讨。在包含FcRn的内皮细胞中，可溶性抗原将被再循环至血浆区室内的ADC清除，使抗体得以与膜结合抗原结合。自可溶性受体释放抗体将增加接着可与膜结合抗原结合的可用游离抗体，并增加细胞死亡。一般技术 除非另外说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的习用技术，这些技术是本领域的公知技艺。所述技术是于文献中充分解释，诸如 Molecular Cloning A Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al. , 1989) Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed. , 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology ALaboratory Notebook (J. E. Cellis, ed. , 1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R.I. Freshney,ed. , 1987)；Introduction to Cell and Tissue CultureCJ. P. Mather andP. E. Roberts, 1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture-Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. , 1993-1998) J. Wiley and Sons ；Methodsin Enzymology (Academic Press,Inc. ) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. )；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos, eds. , 1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel et al. , eds. , 1987) ；PCR The Polymerase Chain Reaction, (Mullis etal.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. , eds. , 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway and P.Travers, 1997) ；Antibodies (P. Finch,1997) ；Antibodies apractical approach (D. Catty. , ed. , IRL Press, 1988-1989) ；Monoclonal antibodies apractical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds. , Oxford University Press,2000)；Using antibodies alaboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999) ；The Antibodies (M. Zanetti and J.D.Capra, eds. , HarwoodAcademic Publishers, 1995)。定义“抗体”是免疫球蛋白分子，其可透过位于该免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原辨认区特异性地与标的结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此处所使用的该用语不仅包含完整的多株或单克隆抗体，但亦包含其的任何抗原结合片段(即「抗原结合部分」)或其的单链、包含抗体的融合蛋白、及任何其他含有抗原辨认区的经修饰构型的免疫球蛋白分子，包括例如但不限于单链(scFv)及结构域抗体(例如人、骆驼或鲨鱼结构域抗体)、大型抗体(maxibodies)、迷你抗体(minibodies )、细胞内抗体(intrabodies)、双价抗体、三价抗体、四价抗体、vNAR及bis_scFv(见例如Hollinger and Hudson, Nature Biotech23 :1126-1136, 2005)。抗体包括任何类型的抗体，诸如IgG, IgA或IgM (或其亚型)，且该抗体不需要是任何特定类型。根据其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些类型可进一步分成亚型(同型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、Y和μ。不同类型的免疫球蛋白的次单位结构及三维构型是众所周知。术语抗体的“抗原结合部位”在此处是指完整抗体是一个或多个片段，该片段保留与给定抗原(例如标的X)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段实现。术语抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括Fab、Fab’、F (ab’)2、由VH及CHl结构域组成的Fd片段、由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段、单一结构域抗体(dAb)片段(Ward et al. , Nature 341 :544-546, 1989)及分离的互补决定区(CDR)。
此处所使用的“Q)R”可能根据任何卡巴(Kabat )、柯西亚(Chothia)、扩展、AbM、完整及/或构形定义加以定义。在特定抗体中组成CDR的氨基酸残基的特性可利用本领域众所周知的方法加以测定。此处所使用的抗体CDR可能被识别为原本由卡巴等人所定义的超变异区。见例如 Kabat et al. , 1992, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed. , Public Health Service, NIH, Washington D. C.。CDR 的位置亦可能被识别为最早由柯西亚等人所描述的结构性环圈结构。见例如Chothia et al. , Nature 342 877-883，1989。其他识别⑶R的方法包括“AbM定义”，该法为卡巴法及柯西亚法的折衷，是源自利用牛津分子(Oxford Molecular)的AbM抗体模型软件(现为Acce I ryS ),或如MacCallum et al.，J. Mol. Biol. 262 =732-745, 1996 所述根据观察到的抗原接触的 CDR 的“接触定义”。在此处称为CDR的“构形定义”的另一方法中，CDR的位置可能被鉴别为对抗原结合造成焰■贡献的残基。见例如Makabe et al. , Journal of Biological Chemistry, 283 1156-1166,2008。虽然其他⑶R边界定义可能不严格遵守上述的方法，但将与至少部分的卡巴CDR重迭，不过它们可能根据特定残基或残基群或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验结果被缩短或延长。此处所使用的CDR可能指由任何本领域已知的方法(包括多种方法的组合)所定义的CDR。此处所使用的“单克隆抗体”是指自实质上同源的抗体族群获得的抗体，意即除了可能少量存在的可能天然发生的突变以外，组成该族群的个别抗体是相同的。单克隆抗体具高度专一性，其是以单一抗原部位为标的。另外，和通常包含拮抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同的是，各单克隆抗体是以抗原上的单一决定簇为标的。修饰语「单株」表示抗体是自实质上同源的抗体族群获得的特征，不应被视为需要通过任何特定的方法生产该抗体。举例来说，本发明所使用的单克隆抗体可通过最早由Kohlerand Milstein, 1975, Nature 256 :495所描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法诸如美国专利第4，816，567号所述者制备。该单克隆抗体亦可自例如利用McCafferty etal. , 1990, Nature 348 :552-554描述的技术所生产的卩遼菌体库分尚。此处所使用的“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其为包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其的片段(诸如Fv、Fab、Fab，、FCabO2或抗体的其他抗原结合子序列)。优选地，人源化抗体是其中源自接受者的互补决定区(CDR)的残基被源自诸如具有该所欲特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔等非人物种(捐赠者抗体)的CDR的残基所取代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被对应的非人残基取代。另外，该人源化抗体可能包含不在接受者抗体或经导入的CDR或骨架序列中的残基，但这些残基被包括以进一步改善及优化抗体的表达。整体而言，该人源化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有的CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR区且所有或实质上所有的FR区是人免疫球蛋白共同序列的FR区。该人源化抗体亦将理想地包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fe)，通常为人免疫球蛋白的该部分。优选地是具有如WO 99/58572所述的修饰的Fe区的抗体。其他形式的人源化抗体具有一或多个相对于原始抗体经改变的 CDR (CDRLl、CDR L2、CDR L3、CDR HI、CDR H2 及 / 或 CDR H3)，所述 CDR 亦被称为“源自”原始抗体之一或多个⑶R之一或多个⑶R。此处所使用的“人抗体”是指具有对应可由人生产及/或利用任何本领域的技术 人员所知或此处所揭示的制造人抗体的技术所制备的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。此定义的人抗体包括含有至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个所述实例是包含鼠轻链及人重链多肽的抗体。人抗体可利用本领域已知的多种技术制备。在一实施方式中，该人抗体是选自曬菌体库，其中该曬菌体库表达人抗体(Vaughan etal.，1996，Nature Biotechnology, 14 :309-314;Sheets et al.，1998，Proc. Natl. Acad.Sci. (USA) 95 :6157-6162;Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. , 227 381 ;Markset al., 1991, J. Mol. Biol. , 222 :581 )。人抗体亦可通过免疫接种动物加以制备，该动物体内的内源性基因座(loci)已被转基因导入的人免疫球蛋白基因座所取代，例如内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全不活化的鼠。此方法是于美国专利第5，545，807,5, 545，806、5，569，825,5, 625，126,5, 633，425及5，661，016号中描述。或者，该人抗体可通过永生化生产以标的抗原为标靶的抗体的人B淋巴细胞加以制备(该B淋巴细胞可自个体收集或可能在体外被免疫)。见例如 Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, p. 77, 1985 ；Boerner et al. , 1991, J. Immunol. , 147 (I) :86-95 及美国专利第5，750，373 号。抗体的“可变区”是指单独或经组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域所知，重链及轻链的可变区各由四个骨架区(FR)及连接该四个骨架区的含有超变异区的三个互补决定区(⑶R)组成。各链中的⑶R被FR拉近在一起，并与来自其他链中的CDR导致形成抗体的抗原结合部位。至少有两种技术用于决定CDR : (I)根据跨种序列变异性的方法(即 Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5thed.，1991，National Institutes of Health, Bethes da MD));及(2)根据抗原-抗体复合物的结晶学试验的方法(Al-lazikani et al, 1997，J. Molec. Biol. 273 :927_948)。此处所使用的CDR是指以任一方法或两种方法的组合所定义的CDR。该技艺中所谓的抗体的“恒定区”是指单独或经组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。此处所使用的用语“PCSK9”是指保留至少部分的PCSK9活性的任何形式的PCSK9及其变异体。除非不同地指明诸如特别指涉人PCSK9，否则PCSK9包括所有哺乳动物物种的天然序列PCSK9，例如人、犬、猫、马及牛。一个示范性的人PCSK9是见于Uniprot登记号Q8NBP7 (SEQ ID NO :16)。此处所使用的“PCSK9拮抗抗体”是指能抑制PCSK9生物活性及/或抑制由PCSK9信号所介导的下游途径的抗体，包括PCSK9介导的LDLR下调及PCSK9介导的LDL血液清除减少。PH依赖性PCSK9拮抗抗体包含阻断、拮抗、抑制或减少(至任何程度包括显著地)PCSK9生物活性的抗体，包括由PCSK9信号介导的下游途径，诸如LDLR相互作用及/或诱发对PCSK9的细胞反应。就本发明的目的而言，应清楚了解的是，用语「PCSK9拮抗抗体」包含所有前述用以实质上废止、降低或中和PCSK9本身、PCSK9生物活性(包括但不限于彼所介导的与LDLR的相互作用、下调LDLR及血液LDL清除减少的任何态样的能力)或该生物活性的后果至任何有意义的程度的确定用语、标题及功能状态及特征。在一些实施方式中，PH依赖性PCSK9拮抗抗体与PCSK9结合且防止与LDLR的相互作用。本发明提供PCSK9拮抗抗体的实例。
用语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”在此处可交换使用以指称任何长度的氨基酸链，优选地是相对短链(例如10至100个氨基酸)。该链可为线性或分支，其可能包含经修饰的氨基酸及/或可能被非氨基酸中断。所述用语亦包含经天然或人为干预修饰的氨基酸链；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记成份缀合。该定义亦包括例如包含一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域公知的其他修饰的多肽。应了解的是该多肽可以单链或相连的链存在。如本领域所知的“多核苷酸”或“核酸”在此处可交换使用，是指任何长度的核苷酸的链，包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基及/或其的类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶被纳入链中的底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其的类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可在该链组合的前或的后进行。核苷酸的序列可被非核苷酸成份中断。多核苷酸在聚合的后可进一步被修饰，诸如与标记成份缀合。其它类型的修饰包括例如“加帽(caps)”、以类似物取代一或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰诸如举例来说这些具有不带电键结(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、胺基甲酸酯等)及带电键结(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、这些含有侧基团者，诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚赖氨酸等)、这些具有嵌入剂(intercalator)者(例如吖啶、补骨脂素等)、这些含有螯合剂者(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、这些含有烷化剂者、这些具有经修饰的键结者(例如α异位性核酸等)以及未经修饰的多核苷酸形式。另外，任何通常存在于糖类中的羟基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被标准保护基保护或被活化以制备与其他核苷酸的额外键结，或可能与固体支持物缀合。该5’及3’端OH可被磷酸化或被胺类或自I至20个碳原子的有机加盖基团取代。其他羟基亦可被衍生成为标准保护基。多核苷酸亦可包含本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖糖类包括例如2’ -O-甲基-核糖、2’ -O-烯丙基核糖、2’_氟代-核糖或2’-迭氮基-核糖、碳环糖类似物、α或β异位性糖类、差向异构体糖类诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、批喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天酮庚糖、非环类似物及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一或多个磷酸二酯键结可被替代性连接基团取代。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸盐被P (O)S (「硫代盐」)、P (S)S (「二硫代盐」)、(O) NR2 (「酰胺化物」)、P (O)R, P (O) OR’、CO或CH2 (「甲缩醛」)取代的实施方式，其中各R或R’是独立地H或经取代或未经取代的烷基(I至20个碳)，该烷基可选择地含有醚(-0-)键结、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。在多核苷酸中的所有键结不需要完全相同。前面的叙述适用于此处所指涉的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。若抗体以相较于彼与其他物质结合时更高的亲和性、亲合力(avidity)、更快速及/或更长时间地与标的结合时，该抗体与标的“特异性结合”或“优先地结合”。举例来说，与PCSK9表位特异性或优先地结合的抗体是指相较于彼与其他PCSK9表位或非PCSK9表位结合时以更高的亲和性、亲合力、更快速及/或更长时间地与此表位结合的抗体。由阅读此定义亦可了解，举例来说与第一标的特异性或优先地结合的抗体(或基团或表位)可能与第二标的或不与第二标的特异性或优先地结合。因此，“特异性结合”或“优先地结合”不一定需要(虽然其可包括)排他性结合。一般来说(但不必然)，所谓的结合是指优先地结合。“非信号诱导(non — signalling decoy)”是隔离配体与其同源受体的可溶性受体异构体或结合蛋白质。
此处所使用的“实质上纯的”是指其为至少50%纯的(也就是不含污染物)，更优选地至少90%纯的，更优选地至少95%纯的，甚至更优选地至少98%纯的，且最优选地至少99%纯的物质。“宿主细胞”包括可作为或已作为导入多核苷酸插入物的载体的接受者的个别细胞或细胞培养。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，且该后代可能因为天然、意外或蓄意突变而不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学或基因学DNA互补性上)。宿主细胞包括经本发明的多核苷酸在体内转染的细胞。如本领域所知，用语“Fe区”是用于定义免疫球蛋白重链的C端区域。该“Fe区”可能为天然序列Fe区或变异体Fe区。虽然免疫球蛋白重链的Fe区的边界可能不同，人IgG重链Fe区通常被定义为从Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基端。Fe区中的残基编号是如卡巴(Kabat)所述的EU指数。Kabat et al. , Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesdaj Md.，1991.免疫球蛋白的Fe区通常包含两个恒定结构域CH2及CH3。本领域所使用的“Fe受体”或“FcR”描述与抗体的Fe区结合的受体。优选地FcR是天然序列的人FcR。另外，优选地FcR是与IgG抗体结合的受体(Y受体)且包括FcyRI, FcyRII及Fe Y RIII亚型的受体，包括等位基因变异体及可选择的所述受体的剪切形式。Fe Y RII受体包括Fe Y RIIA (“活化受体”)及Fe Y RIIB (“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列但主要差异在于细胞质结构域。FcR是于Ravetch and Kinet, 1991, Ann.Rev. Tmmunol · , 9 :457-92 ； Cape I et al. , 1994, Immunomethods, 4 :25-34 ；及 de Haas etal.，1995，J. Lab. Clin. Med.，126 :330-41 中回顾。「FcR」亦包括新生儿受体 FcRn，该受体负责转运母体 I gG 至胎儿(Guyer et al. , 1976, J. Immunol. , 117 587;and Kim etal. , 1994, J. Immunol. , 24 :249)。此处关于抗体所使用的用语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部分与表位结合的方式充份类似于第二抗体或其抗原结合部分的结合，使得第一抗体与其同源表位在第二抗体存在时的结合结果相较于第二抗体不存在时第一抗体的结合可侦测地降低。或者，该情况可为但不一定是该第二抗体与其表位的结合亦因第一抗体的存在而可侦测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，但第二抗体不抑制该第一抗体与其个别表位的结合。然而，当各种抗体不论以相同、较高或较低程度可侦测地抑制另一抗体与其同源表位或配体结合时，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”与其个别表位的结合。本发明包含竞争抗体及交叉竞争抗体。不论该竞争或交叉竞争所藉以发生的机转为何(例如空间位阻、构形变化或与共同表位或其部分结合)，技术人员将了解根据此处所提供的揭示，本发明包含竞争及/或交叉竞争抗体且其可被用于此处所揭示的方法。“功能性Fe区”具有天然序列Fe区的至少一种效应功能。示范性「效应功能」包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性、Fe受体结合、抗体依赖性细胞介导性细胞毒性、吞噬作用、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)等。所述效应功能通常需要Fe区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合且可利用本领域已知的各种用于评估所述抗体效应功能的测定检测。“天然序列Fe区”包含与在天然中发现的Fe区的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。“变异体Fe区”包含与天然序列Fe区有至少一个氨基酸修饰的差异的氨基酸序列，但 仍保留该天然序列Fe区的至少一种效应功能。优选地，该变异体Fe区相较于天然序列Fe区或亲代多肽的Fe区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fe区或亲代多肽的Fe区中自约I至约10个氨基酸取代，且优选地自约I至约5个氨基酸取代。此处的变异体Fe区将优选地具有与天然序列Fe区及/或与亲代多肽的Fe区至少约80%的序列一致性，最优选地具有至少约90%的序列一致性，更优选地具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列一致性。“最小预期生物效应量(MABEL)”是指在人导致最小生物效应的最小预期剂量。安全因素通常被应用于自MABEL计算人的首次剂量。MABEL的计算应利用所有相关的体外及体内药物动力学及药物药效学信息。此处所使用的“治疗”及“治疗有效性”是指得到益处或所期望的临床结果的方法。就本发明的关于PH依赖性PCSK9拮抗抗体的目的而言，益处或所期望的临床结果包括但不限于下列一或多项增进LDL清除及减少发生或改善异常胆固醇及/或脂蛋白的量，该异常胆固醇及/或脂蛋白的量是因代谢及/或饮食失调所致或包括家族性高胆固醇血症、致动脉粥样化异常脂血症、动脉粥样硬化及更普遍地心血管疾病(CVD)。“减少发生”是指任何严重性的减少，其可包括减少通常用于治疗该状况的其他药物及/或治疗的需求及/或量(例如暴露量)。如本领域的技术人员所了解的，就个体对治疗的反应而言可能有所不同，因此举例来说，“减少发生的方法”反映出施用PH依赖性抗体是根据该施用可能造成特定个体的发生减少的合理预期。“改善”是指施用治疗后一或多种症状相较于未施用治疗时减轻或改善。“改善”亦包括缩短或减少症状的持续时间。此处所使用的药物、化合物或医药组合物的“有效剂量”或“有效量”是指足以影响任一或多种益处或所期望的结果的量。就预防性用途而言，益处或所期望的结果包括消除或减少风险、减轻严重性或延迟疾病的开始，包括疾病的生化学、组织学及/或行为学的症状、其并发症及在疾病发展期间所表达的中间病理学表型。就PH依赖性PCSK9拮抗抗体的治疗用途而言，益处或所期望的结果包括诸如减少高胆固醇血症或一或多种异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病的症状、降低治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增进其他药物的效果及/或延缓病患的疾病进展的临床结果。有效剂量可分一或多次施用。就本发明的目的而言，药物、化合物或医药组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景下所了解的，药物、化合物或医药组合物的有效剂量可能与或可能不与另一药物、化合物或医药组合物组合达到。因此，在施用一或多种治疗剂的情况下考虑 “有效剂量”及若单一剂与一或多种其他剂组合时考虑给予有效量，可能或是经达成所欲的结果。“个体”或“对象”是哺乳动物，更佳地人。哺乳动物亦包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长动物、马、犬、猫、小鼠及大鼠。此处所使用的“载体”是指建构物，其能在宿主细胞中递送及优选地表达一或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质体、黏质体或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体内的DNA或RNA表达载体及某些真核细胞诸如生产细胞。此处使用的“表达控制序列”是引导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子，诸如组成性或诱导性启动子或增强子。表达控制序列是可操作地与所期望转录的核酸序列连接。此处所使用的“医药上可接受的载体”或“医药上可接受的赋形剂”包括任何当与活性成分组合时能使该成分保留生物活性且不与个体的免疫系统反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准医药载体诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液及各种类型的润湿剂。优选地用于气雾剂或非经肠施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(O. 9%)盐水。包含所述载体的组合物是由众所周知的公知方法调制(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition, A. Gennaro, ed. , Mack PublishingCo. , Easton, PA, 1990;and Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20thEd. , Mack Publishing, 2000)。此处所使用的用语“k。/是指抗体与抗原结合的速率常数。具体地说，该速率常数(1^和kf)及平衡解离常数是利用Fab抗体片段(即单价)与抗原测量。此处所使用的用语“kf”是指抗体自抗体/抗原复合物解离的速率常数。此处所使用的用语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。分别测定结合及解离速率常数匕及^以决定Kd及kf比值，利用基于表面等离子共振的生物传感器，在与配体结合的分析物是单价的条件下表征分析物/配体的相互作用，该配体是经捕捉试剂以低量固定在传感器表面上。该分析是利用如Karlsson etal.，Anal. Biochem 349，136-147，2006所描述的动力学滴定方法进行。在给定测试中所采用的感应芯片、捕捉试剂及测定缓冲液是按照Myszka，J. Mol. Recognit 12，279-284，1999的建议选择以提供稳定的捕捉配体至传感器表面、最小化分析物与表面的非特异性结合及产生适用于动力学分析的分析物结合反应。该按照分析物/配体相互作用的分析物结合反应被双重参照及带入I :1兰缪尔(Langmuir)的“质量传输限制模型”，其中ka、kd及Rmax为全局参数如 Myszka&Morton et al. , Biophys. Chem 64,127-137 (1997)所述。平衡解离常数Kd是自动力学速率常数的比值推算，即KD=kd/ka。所述测定优选地在25°C或37°C下进行。A.用于预防或治疗疾病的方法在关于pH依赖性PCSK9拮抗抗体的一个方面，本发明提供一种治疗或预防个体的高胆固醇血症及/或异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状的方法，该方法包含对该个体施用有效量的拮抗循环PCSK9的pH依赖性PCSK9拮抗抗体。在另一方面，本发明提供有效量的拮抗循环PCSK9的pH依赖性PCSK9拮抗抗体以用于治疗或预防个体的高胆固醇血症及/或异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状。本发明另提供有效量的拮抗细胞外或循环PCSK9的pH依赖性PCSK9拮抗抗体于制造药物以治疗或预防个体的高胆固醇血症及/或异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病的至少一种症状的用途。有利地，治疗性施用该抗体导致较低的血液胆固醇及/或较低的血液LDL。优选的是，血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用前至少降低约10%或15%。更优选地，血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用该抗体前至少降低约20%。仍更优选地，血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用该抗体前至少降低30%。有利地,血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用 该抗体前至少降低40%。更有利地，血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用该抗体前至少降低50%。仍更优选地,血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用该抗体前至少降低60%。最优选地,血液胆固醇及/或血液LDL相较于施用该抗体前至少降低70%。就此处所描述的所有方法而言，提及针对任何适当抗原的pH依赖性抗体还包括包含一或多种添加剂的组合物。所述组合物可能进一步包含适当的赋形剂，诸如医药上可接受的赋形剂包括本领域众所周知的缓冲剂。本发明可被单独使用或与其他公知的治疗方法组合使用。该pH依赖性抗体可经由任何适当的途径对个体施用。对本领域的技术人员显而易见的是，此处所描述的实例不应意图限制而是可用技术的示例。因此在一些实施方式中，该pH依赖性抗体是根据已知方法对个体施用,诸如静脉内施用例如一次性注射(bolus)或在一段时间内连续输注、肌肉内、腹腔内、脑脊髓腔内、经皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内、经喷入、脊椎鞘内、经口、吸入或局部途径。施用可为是统性例如静脉内施用或局部施用。自商业途径获得的使用液体制剂的喷雾器包括喷射喷雾器及超音波喷雾器可被用于施用。液体制剂可经直接喷雾，冷冻干燥的粉末可在重构后经喷雾施用。或者，pH依赖性抗体可利用氟碳制剂及定量吸入器加以气雾化或以经冷冻干燥及磨细粉末的形式吸入。在一实施方式中，pH依赖性抗体是经定点或靶向性局部递送技术施用。定点或靶向性局部递送技术的实例包括各种PH依赖性抗体的植入式贮剂来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管、或针头导管、合成性移植物、外膜层包覆、分流器及支架或其他植入式装置、定点载体、直接注射或直接施用。见例如PCT公开号WO 00/53211及美国专利第5，981，568 号。pH依赖性抗体的各种制剂可被用于施用。在一些实施方式中，可仅施用该pH依赖性抗体。在一些实施方式中，pH依赖性抗体及医药上可接受的赋形剂可呈各种制剂的形式。医药上可接受的赋形剂是为本领域所知，且是有助于施用药理有效物质的相对惰性物质。举例来说，赋形剂可提供外形或稠度，或作为稀释剂。适当的赋形剂包括但不限于稳定齐U、润湿剂、乳化剂、用于改变渗透性的盐类、包封剂、缓冲剂及皮肤穿透增进剂。用于非经肠及经肠药物递送的赋形剂以及制剂是阐述于Remington, The Science and Practice ofPharmacy, 20th Ed. , Mack Publishing (2000)。所述剂可与医药上可接受的载体(诸如盐水、林格(Ringer)氏液、葡萄糖溶液及该类似物)组合。特定给药配方即剂量、时间及重复性将依特定个体及该个体的医学病史而定。如此处所述，呈pH依赖性结合的抗体亦可经吸入施用。通常在施用pH依赖性抗体时，初始候选剂量可为约2毫克/公斤。就本发明的目的而言，典型的每日剂量可根据上述因子介于约3微克/公斤至30微克/公斤至300微克/公斤至3毫克/公斤、至30毫克/公斤、至100毫克/公斤或100毫克/公斤以上的任何范围内。举例来说，可使用约I毫克/公斤、约2. 5毫克/公斤、约5毫克/公斤、约10毫克/公斤及约25毫克/公斤的剂量。视状况而重复施用数天或更久时，该治疗被持续进行直到发生所欲的症状抑制或直到达成足够的治疗量，例如减少血液LDL的量。示范性给药配方包含施用初始剂量约2毫克/公斤的抗体，随后每周约I毫克/公斤的维持剂量，或随后隔周约I毫克/公斤的维持剂量。然而，其他给药配方可根据医师所希望达成的药物动力学衰减模式使用。举例来说，在一些实施方式中，每周给药一至四次是经考虑。在其他实施方式中，每月给药一次或隔月或每三个月给药一次是经考虑。此治疗的进展可通过公知技术及检测加以轻易地监测。该 给药配方(包括所使用的抗体)可随时间而异。就本发明的目的而言，该PH依赖性抗体的适当剂量将依所采用的抗体(或其组合物)、所欲治疗的症状的类型及严重性、该剂是以预防性或治疗性目的施用、先前治疗、该病患的临床病史及对该剂的反应、该病患的血液抗原的量、该病患合成及清除抗原的速率、该病患清除该经施用的剂的速率及主治医师的考虑而定。通常医师将施用PH依赖性抗体直到达到可完成所欲结果的剂量。剂量及/或频率可依治疗疗程而异。经验性考虑诸如半衰期通常将影响该剂量的决定。举例来说，可兼容于人免疫系统的抗体诸如人源化抗体或全人抗体可被用以延长该抗体的半衰期及防止该抗体被宿主的免疫系统攻击。给药频率可根据治疗的疗程加以决定及调整，通常但不一定根据症状例如高胆固醇血症的治疗及/或抑制及/或改善及/或延缓。或者，抗体的持续性连续释放制剂可为适当。各种用于达成持续释放的制剂及装置是本领域所知。在一实施方式中，拮抗抗体的剂量在已经给予一或多次拮抗抗体的个体中可凭经验决定。个体是经给予渐增剂量的抗体。为了评估疗效可追踪疾病的指标。根据本发明的方法施用pH依赖性抗体可为连续性或间歇性，此依例如接受者的生理状况、该给药的目的是治疗性或预防性及技术人员所知的其他因素而定。PH依赖性抗体的施用可为实质上连续一段预先决定的时间，或可为一系列间隔剂量。在一些实施方式中，可能存在超过一种拮抗抗体。可能存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多种拮抗抗体及/或肽。通常，所述抗体或肽可能具有不会互相不良影响的互补活性。pH依赖性抗体亦可与其他治疗剂组合使用。pH依赖性抗体亦可与其他剂一起使用，以用于增进及/或补充所述剂的有效性。。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量及浓度下对接受者不具毒性，可能包括例如缓冲剂诸如磷酸盐、朽1檬酸盐及其他有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合剂诸如EDTA ;糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属复合物(例如锌蛋白质复合物)'及/或非离子性界面活性剂诸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。含有pH依赖性抗体的脂质体是以本领域已知的方法制备，诸如于Epstein, etal.，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3688 ；Hwang, et al.，1980，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77 :4030及美国专利第4，485，045及4，544，545号中所述。循环时间延长的脂质体是揭露于美国专利第5，013，556号。特别有用的脂质体可利用逆相蒸发方法以包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生产。脂质体被挤压通过定义孔径大小的滤网以产生具有所欲直径的脂质体。该活性成分亦可被包封于通过例如凝聚技术或通过界面聚合化所制备的微胶囊中例如分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊中、于胶体药物 递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或于巨乳化液中。所述技术是揭不于 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. , MackPublishing (2000)。可能制备持续释放性制剂。持续释放制剂的适当实例包括含有该抗体的固相疏水性聚合物的半透性基体，该基体是呈形状对象的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基体的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3，773，919号)、L-天门冬酰氨及7乙基-L-天门冬酰氨盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEP0T (由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所组成的注射型微球)、鹿糖乙酸异丁酸酯及聚-D- (-)_3_轻丁酸。希望用于体内施用的制剂必须为无菌。此可轻易地通过例如无菌过滤膜的过滤达成。治疗性PH依赖性抗体组合物通常被置放于具有无菌接口的容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺的塞子的静脉溶液袋或小瓶。适当的乳液可利用自商业途径获得的脂肪乳液制备，诸如Intralipid 、Liposyn 、Infonutrol 、Lipofundin 及Lipiphysan 。该活性成分可被溶解于预先混合的乳液组合物中，或者可被溶解于油中(例如大豆油、红花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。将了解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以调整该乳液的张力。适当的乳液通常将含有最高20%例如介于5至20%的油。该脂肪乳液可包含介于0. I至I. O微米特别是0. I至0. 5微米的脂肪液滴，且具有介于5. 5至8. O的pH。该乳液组合物可为这些通过混合pH依赖性抗体与Intralipid 或其成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备者。用于吸入或喷入的组合物包括在医药上可接受的水性或有机溶剂或其的混合物中的溶液及悬浮液和粉末。该液体或固体组合物可能包含如前述的适当的医药上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，该组合物是以经口或经鼻呼吸途径施用以提供局部或系统性效应。在医药上可接受的较佳无菌溶剂中的组合物可通过使用气体加以喷雾化。经喷雾化的溶液可从喷雾装置直接吸入，或该雾化装置可与面罩、帷幕或间歇性正压呼吸器连接。溶液、悬浮液或粉末组合物可自装置优选地经口或经鼻施用，该装置以适当方式递送制剂。B. pH依赖性抗体本发明所使用的抗体可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合抗体、单链(ScFv)、其突变物、包含抗体部位的融合蛋白(例如结构域抗体)、人抗体、人源化抗体及任何其他含有该所需特异性的抗原辨认区的免疫球蛋白分子的经修饰构型，包括抗体的糖基化变异体、抗体的氨基酸序列变异体及经共价修饰的抗体。该抗体可为小鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方式中，该pH依赖性抗体是单克隆抗体。该pH依赖性抗体亦可为人源化抗体。在其他实施方式中，该抗体是人抗体。在一些实施方式中，该抗体包含经修饰的恒定区，诸如免疫惰性的恒定区，亦即具有减少的引发免疫反应的能力。在一些实施方式中，该恒定区是经如Eur. J. Immunol.，1999，29 :2613-2624 ；PCT
发明者J·庞斯, J·R·沙博特, J·F·查帕罗里格斯, B·C·戈梅斯, H·梁, K·马亚瓦拉, J·T·梅特托尔二世, A·拉吉帕尔, D·L·谢尔顿 申请人:瑞纳神经科学公司, 辉瑞大药厂