专利名称：用于递送活性剂的生物可降解脂质的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物可降解脂质及其用于递送活性剂如核酸的用途。
背景技术：
治疗性核酸包括(例如)小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒、免疫刺激性核酸、反义核苷酸、拮抗剂(antagomir)、antimir、微RNA模拟物、supermir、Ul适配子和适配体。这些核酸通过多种机制起作用。在siRNA或miRNA的情况下，这些核酸可通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调细胞内特定蛋白的水平。siRNA或miRNA引入细胞质后，这些双 链RNA构建体可与称为RISC的蛋白质结合。siRNA或miRNA的有义链离开RISC复合物，在RISC内提供了可识别并结合具有与结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA的模板。结合互补mRNA，RISC复合物裂解所述mRNA并释放裂解的链。RNAi可通过革巴向特定破坏编码蛋白质合成的相应mRNA提供对特定蛋白质的下调。RNAi的治疗应用极其广泛，因为可用针对靶蛋白的任何核苷酸序列合成siRNA和miRNA构建体。到目前为止，siRNA构建体已经在体外和体内模型中显示出特异性下调靶蛋白的能力。另外，siRNA构建体目前正在临床研究中进行评估。然而，siRNA或miRNA构建体目前面临两个问题，第一，它们在血浆中易受核酸酶消化影响，第二，当作为游离siRNA或miRNA全身施用时，它们进入可结合RISC的细胞内隔室的能力有限。可通过在分子内并入经化学修饰的核苷酸连接子，例如硫代磷酸酯基团，稳定这些双链构建体。然而，这些化学修饰仅对核酸酶消化提供了有限防护并且可降低所述构建体的活性。可通过使用载体系统例如聚合物、阳离子脂质体或通过化学修饰所述构建体，例如通过共价连接胆固醇分子促进siRNA或miRNA的细胞内递送。然而，需要经改进的递送系统以增强siRNA和miRNA分子的效能并减少或消除对化学修饰的需要。反义寡核苷酸和核酶也可抑制mRNA翻译成为蛋白质。在反义构建体的情况下，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白mRNA的序列互补的序列并且可通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与所述mRNA结合。这种结合防止祀mRNA翻译和/或触发mRNA转录物的RNA酶H降解。因此，反义寡核苷酸具有特异性作用的巨大潜力(即，下调特定的疾病相关蛋白)。到目前为止，这些化合物在若干体外和体内模型，包括炎性疾病、癌症和HIV 的模型中显不出希望(查阅 Agrawal, Trends in Biotech.14:376-387 (1996))。反义构建体也可通过与染色体DNA特异性杂交影响细胞活性。目前正在进行若干反义药物的高级人体临床评估。这些药物的靶标包括bcl2和载脂蛋白B基因和mRNA产物。免疫刺激性核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。在脱氧核糖核酸的情况下，已经证实某些序列或基序在哺乳动物体内引起免疫刺激。这些序列或基序包括CpG基序、嘧啶富集序列和回文序列。人们认为，脱氧核糖核酸中的CpG基序被内体受体，toll样受体9(TLR-9)特异性识别，然后触发先天性和获得性免疫刺激途径。还报道了某些免疫刺激性核糖核酸序列。人们认为，这些RNA序列通过与toll样受体6和7 (TLR-6和TLR-7)结合触发免疫激活。另外，还报道了双链RNA为免疫刺激性并且认为是通过与TLR-3结合激活。使用治疗性核酸的一个众所周知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间连接键的稳定性和该连接子对核酸酶的敏感性。血清中核酸外切酶和核酸内切酶的存在引起具有磷酸二酯连接子的核酸迅速消化并且，因此，在血清存在下或在细胞内治疗性核酸可具有很短的半衰期。(Zelphati, 0.等，Antisense.Res.Dev.3:323-338 (1993);和 Thierry, A.R.等，Gene Regulation:Biology of Antisense RNA and DNA 中第 147-161 页(Erickson, RP 和Izant，JG编辑；Raven Press,NY(1992)) 0由于这些和其它已知的问题，目前正在研发的治疗性核酸并未采用天然核酸中存在的基本磷酸二酯化学结构。这个问题已经通过降低血清或细胞内降解的化学修饰得到部分克服。已经在核苷酸间磷酸二酯桥(例如，使用硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或氨基磷酸酯连接键)，在核苷酸碱基(例如，5-丙炔基-嘧啶)，或在糖(例如，2'-修饰糖)处试验了修饰(UhlmannE.等，Antisense:Chemical Modifications.Encyclopedia of Cancer,第 X 卷，第 64-81页Academic Press Inc.(1997))。其它人已试图使用2' -5'糖连接键提高稳定性(见，例如，美国专利N0.5，532，130。还尝试了其它改变。然而，经证明这些解决方案都不完全令人满意，并且体内游离治疗性核酸仍然仅仅具有有限的功效。另外，正如上面所提到的，关于siRNA和miRNA，问题仍在于治疗性核酸跨过细胞膜的能力有限(见，Vlassov 等，Biochim.Biophys.Acta 1197:95-1082(1994))和与全身毒性相关的问题，例如补体介导的过敏反应、凝结性质改变和血细胞减少(Galbraith等，Antisense Nucl.Acid Drug Des.4:201-206 (1994))。为视图提高功效，调研人员还采用了基于脂质的载体系统来递送经化学修饰或未修饰的治疗性核酸。在 Zelphati，0和 Szoka，F.C.，J.Contr.Rel.41:99-119(1996)中，作者提到阴离子(常规)脂质体、PH敏感脂质体、免疫脂质体、融合脂质体和阳离子脂质/反义聚集物。类似地，已经在阳离子脂质体中系统性施用了 siRNA，并且已经报道这些核酸-脂质颗粒在哺乳动物，包括非人灵长类动物中提供了对祀蛋白的更好下调(Zimmermann等，Nature 441:111-114(2006))。尽管有这种进展，但是在本领域中仍需要适合一般治疗使用的改良脂质-治疗性核酸组合物。优选地，这些组合物将以高效率封装核酸，具有高药物:脂质比，防止封装的核酸从血清中降解和清除，适合全身递送，并且提供了对封装核酸的细胞内递送。另外，这些脂质-核酸颗粒应耐受良好并且提供足够的治疗指数，以致在核酸的有效剂量下患者治疗不会伴有对患者的显著毒性和/或风险。提供了化合物、制备化合物的方法和使用所述化合物将核酸引入细胞的方法，包括治疗疾病的方法。发明概沭本发明涉及一种阳离子 脂质，其具有位于所述阳离子脂质的脂质部分(例如，疏水链)的中间或远端部分的一个或多个生物可降解基团。这些阳离子脂质可并入脂质颗粒中用于递送活性剂，如核酸(例如，siRNA)。生物可降解基团并入阳离子脂质中引起在将活性剂递送至靶标区域后阳离子脂质从体内更快代谢和去除。因此，这些阳离子脂质的毒性大大低于没有生物可降解基团的相似阳离子脂质。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质为下式的化合物:
权利要求
1.种式⑴的化合物:
2.据权利要求1所述的化合物，其中M1和M2各自独立地为:-0C(0)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O) S-, -OC(S)-, -C(S)O-、-S-S-、-C(R5) = N-、-N = C(R5)-、-C(R5)=N-O-、-O-N = C(R5)-、-C(O) (NR5)-、-N(R5)C(O)-' -C(S) (NR5)-、-N(R5)C(O)-' -N(R5)C(O)N (R5) -、-OC (0) 0-、-OSi (R5) 20_、-C (0) (CR3R4) C (0) 0-或-OC (0) (CR3R4) C (0) _。
3.据权利要求2所述的化合物，其中M1和M2各自独立地为:-C(O)-O-、-OC(O)-、-C(R5) = N-, -C(R5) = N_0_、-0-C(O)0_、-C(O)N(R5)-、-C(O)S-、-C (S) O-、-OSi (R5) 20_、-C (O) (CR3R4) C (O) O-或-OC (O) (CR3R4) C (O) _。
4.据权利要求2和3中任一项所述的化合物，其中M1和M2各自为-C(O) O-。
5.据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R1和R2各自为烷基。
6.据权利要求5所述的化合物，其中R1和R2各自为甲基。
7.据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中Q为不存在、-C(O)O-、-OC (O) -、-C (O) N (R4) -、-N (R5) C(O)-, -S-S-、-OC (O) 0_、-C (R5) = N-O-, -OC (O)N (R5) -、-N (R5) C (O) N (R5) -、-N (R5) C (O) O-、-C (O) S-、-C (S) O-或-C (R5) = N-O-C (O) _。
8.据权利要求1-7所述的化合物，其中Q不存在。
9.据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中R的每个实例独立地为 _CH2-、-C (CH3) 2_ 或 _CH (iPr)-。
10.据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中Q1和Q2各自独立地为不存在或-O-。
11.据权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中a为2、3或4并且b为O。
12.据权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中与生物可降解基团连接的碳原子α或β经一个或两个烷基或一个螺环基团取代。
13.据权利要求1所述的化合物，其中以下的一项或多项适用: (i)Q1和Q2不存在；(ii)M1和 M2 均为-C(O)O-； (iii)g和h均为I ;(iv)g和h均为O ;(V) c和e总计为7 ；(vi)d和f总计为7 ；(vii)c、e和i总计为7 ；(viii)d、f和j总计为7 ；(ix)i和j各自为7;(X) k和I均为I ;(xi)m和η均为O;(xii)m和q总计为I或m和q总计为2 ；(xiii)m和I总计为6；(xiv)r和η总计为6 ；(XV) P和ο均为O ;(xvi)η和r总计为2或η和r总计为I ;并且 (xvii)Q3为 H。
14.据权利要求1所述的化合物，其选自:
15.种式IA-1的化合物
16.据权利要求15所述的化合物，其中q不存在并且R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-基团为(CH3)2N-(CH2)3-C (O) O-、(CH3)2N-(CH2)2-NH-C (O) O-、(CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-或(CH3)2N-(CH2)3-C(CH3) = N-0-。
17.种式IA-2的化合物
18.据权利要求17所述的化合物，其中R’为不存在或烷基。
19.据权利要求17或18所述的化合物，其中R1和R2各自独立地为C1-C4烷基。
20.据权利要求17-19中任一项所述的化合物，其中每次出现的R独立地为-CH2-或-CH (CH3) ~o
21.据权利要求17-20中任一项所述的化合物，其中Q3和Q4各自独立地为H、芳基或胆固醇部分。
22.据权利要求17-21中任一项所述的化合物，其中M1和M2各自为-C(0)_0_。
23.据权利要求17-22中任一项所述的化合物，其中e+3g+i+m+3o+q的总和为约8至约20。
24.据权利要求17-22中任一项所述的化合物，其中d+3h+j+n+3p+r的总和为约8至约20。
25.种式IB的化合物
26.据权利要求25所述的化合物，其中R9和Rw各自独立地为C4-C12亚烷基或C4-C12亚烯基，M1和M2为-C (O) O-,并且R11和R12为C4-C12亚烷基或C4-C12亚烯基。
27.据权利要求25或26所述的化合物，其中R9J1和R11总长度为12-24个碳原子。
28.据权利要求25或26所述的化合物，其中R1(1、M2和R12总长度为12-24个碳原子。
29.据权利要求25-28中任一项所述的化合物，其中所述R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-基团为(CH3)2N-(CH2)3-C (O) O-、(CH3)2N-(CH2)2-NH-C (O) O-、(CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-或(CH3)2N-(CH2)3-C(CH3) = N-0-。
30.种式IC的化合物
31.据权利要求30所述的化合物，其中每个生物可降解基团为-C00R13，其中每个R13独立地为烧基。
32.据权利要求30或31所述的化合物，其中所述R’R1R2N- (R) a_Q_ (R) b_基团为(CH3)2N-(CH2)3-C (O) O-、(CH3)2N-(CH2)2-NH-C (O) O-、(CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-或(CH3)2N-(CH2)3-C(CH3) = N-0-。
33.种式ID的化合物
34.种化合物，其选自式I1-XXIII的化合物:
35.种化合物，其具有: (i)中心碳原子， ( )含有与所述中心原子结合的头基的氮，和(iii)2个与所述中心碳原子直接结合的疏水尾，每个疏水尾包含与所述中心碳原子连接的C8或更大的脂族基，其中所述脂族基(a)被生物可降解基团中断，以致在所述生物可降解基团和所述中心碳原子之间有一条至少4个碳原子的链，或(b)包括在所述疏水尾末端的生物可降解基团。
36.据权利要求35所述的化合物，其中所述生物可降解基团选自-0C(0)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O) S-, -OC(S)-, -C(S)O-、-S-S-、-C(R5) = N-、-N = C(R5)-、-C(R5)=N-O-、-O-N = C(R5)-、-C(O) (NR5)-、-N(R5)C(O)-' -C(S) (NR5)-、-N(R5)C(O)-' -N(R5)C(O)N (R5) -、-OC (0) 0-、-OSi (R5) 20_、-C (0) (CR3R4) C (0) 0-和-OC (0) (CR3R4) C (0) _。
37.据权利要求35和36所述的化合物，其中在所述阳离子脂质的其中一个或两个疏水尾中的所述脂族基包括至少一个碳-碳双键。
38.据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物呈药学上可接受的盐的形式。
39.据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物呈阳离子脂质的形式。
40.种脂质颗粒，其包含中性脂质、能够减少聚集的脂质和权利要求39所述的阳离子脂质。
41.据权利要求20所述的脂质颗粒，其中所述中性脂质选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE或SM ;所述能够减少聚集的脂质为PEG脂质；并且所述脂质颗粒进一步包含固醇。
42.据权利要求40和41中任一项所述的脂质颗粒，其中所述阳离子脂质以约20%和约60%的摩尔百分比存在；所述中性脂质以约5%至约25%的摩尔百分比存在；所述固醇以约25%至约55%的摩尔百分比存在；并且所述PEG脂质为PEG-DMA、PEG-DMG或其组合，并且以约0.5%至约15%的摩尔百分比存在。
43.据权利要求40-42中任一项所述的脂质颗粒，其进一步包含活性剂。
44.据权利要求43所述的脂质颗粒，其中所述活性剂为选自质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、拮抗剂(antagomir)、适配体和核酶的核酸。
45.据权利要求40-44中任一项所述的脂质颗粒，其中所述脂质颗粒的体内半衰期(t1/2)小于约3小时。
46.据权利要求40-44中任一项所述的脂质颗粒，其中所述脂质颗粒的体内半衰期(tl/2)比含有相同阳离子而不含生物可降解基团的脂质的体内半衰期小约10%。
47.种药物组合物，其包含权利要求40-46中任一项所述的脂质颗粒和药学上可接受的载体。
48.种调节靶基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括为所述细胞提供权利要求40-46中任一项所述的脂质颗粒。
49.据权利要求48所述的方法，其中所述活性剂为选自质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、拮抗剂(antagomir)、适配体和核酶的核酸。
50.种治疗受试者中特征在于多肽过表达的疾病或病症的方法，所述方法包括为所述受试者提供权利要求47所述的药物组合物，其中所述活性剂为选自siRNA、微RNA和反义寡核苷酸的核酸,并且其中所述siRNA、微RNA或反义寡核苷酸包括与编码所述多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体。
51.种治疗受试者中特征在于多肽表达不足的疾病或病症的方法，所述方法包括为所述受试者提供权利要求47所述的药物组合物，其中所述活性剂为编码所述多肽或其功能变异体或片段的质粒。
52.种诱导受试者免疫反应的方法，所述方法包括为所述受试者提供权利要求47所述的药物组合物，其中所述活性剂为免疫刺激性寡核苷酸。
53.据权利要求52所述的方法，其中所述靶基因选自因子VI1、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA, TTR、RSV, PDGFP 基因、Erb-B 基因、Src 基因、CRK 基因、GRB2 基因、RAS 基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erkl/2基因、PCNA (p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活蛋白基因、Her2/Neu基因、SORTl基因、XBPl基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶II α 基因、ρ73 基因、p21(WAFl/CIPl)基因、p27 (KIPl)基因、PPMlD 基因、RAS 基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、Μ68基因、肿瘤抑制基因和ρ53肿瘤抑制基因。
54.据权利要求53所述的方法，其中所述靶基因含有一个或多个突变。
55.种递送核酸分子的方法，所述方法包括施用包含所述核酸分子和阳离子脂质的核酸脂质颗粒，所述阳离子脂质具有 (i)中心碳原子， ( )含有与所述中心原子结合的头基的氮，和 (iii)2个与所述中心碳原子直接结合的疏水尾，每个疏水尾包含与所述中心碳原子连接的C14或更大的脂族基，其中所述脂族基(a)被生物可降解基团中断，以致在所述生物可降解基团和所述中心碳原子之间有一条至少4个碳原子的链，或(b)包括在所述疏水尾末端的生物可降解基团，以致所述疏水尾在体内发生裂解后，所述阳离子脂质保持完整直到递送所述核酸分子为止。
全文摘要
本发明涉及一种阳离子脂质，其具有位于所述阳离子脂质的脂质部分(例如，疏水链)的中间或远端部分的一个或多个生物可降解基团。这些阳离子脂质可并入脂质颗粒中用于递送活性剂，例如核酸。本发明还涉及脂质颗粒，其包含中性脂质、能够减少聚集的脂质、本发明的阳离子脂质和(任选地)固醇。所述脂质颗粒可进一步包括治疗剂，如核酸。
文档编号C07C211/63GK103096875SQ201180037927
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者姆夏·马诺哈兰, 马丁·迈尔, 穆图萨米·贾亚拉曼, 松田茂夫, 纳拉亚南奈尔·K·贾亚普拉卡什, 卡兰托塔特·G·拉杰夫, 埃金·埃金科, 托马斯·A·贝利 申请人:阿尔尼拉姆医药品有限公司