形成二酮哌嗪的二肽连接子的制作方法

文档序号:3515734阅读:575来源:国知局
专利名称:形成二酮哌嗪的二肽连接子的制作方法
技术领域
本发明系关于一种用于N端肽片段PEP-N及C端肽片段C-PEP的均质溶液相肽合成(HSPPS)的方法,其中C-PEP带有包含二酮哌嗪(DKP)的特定C端保护基,其含有柄状基团(handle group)HG,其中该HG系连接至肽片段的C端;从而此包含DKP的特定C端保护基可自肽如同习知所用的C端保护基一般选择性裂解。藉由使用此包含DKP及HG的C端保护基,可避免基于HSPPS及固相肽合成(SPPS)的组合的汇集肽合成中的某些方法步骤。本发明进一步关于一种藉由SPPS制备该经特定保护的片段C-PEP的方法,其系藉由使用包含特定二肽及HG的连接子以使生长中的肽链连接至树脂而达成,当肽片段C-PEP自支撑树脂裂解时,该连接子形成该DKP基团;且进一步关于制备方法的中间物。
背景技术
在本文中,除非另外说明,否则根据「Nomenclature and symbolism for aminoacidsand peptides J, Pure& Appl.Chem.,第 56 卷,第 5 期,第 595-624 页,1984 使用氨基酸及肽的命名。除非另外说明,否则以下缩写具有下列清单中所给出的意义:CTC氯三苯甲基氯Alloc 烯丙氧基羰基Boc叔丁氧羰基Bsmoc 1,1-二侧氧基苯并[b]噻吩_2_基甲氧羰基Bzl或Bn苯甲基c Hx环己基CtC 端Dpr2,3-二胺基丙酸DdeN_l_ (4,4_ 二甲基_2,6_ 二侧氧基亚环己基)乙基ivDde 1-(4,4_ 二甲基_2,6_ 二侧氧基亚环己基)3_甲基丁基Ddzα,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基DKP2,5-二酮哌嗪Dmab 二甲胺基硼烷Fm9_荷基甲基Fmoc N-(荷基_9_甲氧擬基)Hpr哌啶-2-甲酸,高脯胺酸HSHSPPS混合固相及均质溶液相肽合成HSPPS 均质溶液相肽合成Hyp反_4_羟脯胺酸Mmt4-甲氧基三苯甲基Mpe3_ 甲基戊 _3_ 基
Mtt 4-甲基三苯甲基Orn 鸟胺酸Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基PG 保护基2-PhiPr 2_苯基异丙基 Pmc 2,2,5,7,8-五甲基色满_6_磺酰基PNO2Z 硝基苯甲氧基羰基Py吡啶SPPS 固相肽合成tBu 叔丁基TES SiEt3,三乙基硅烷基TFA 三氟乙酸Tfac 二氣乙酸基Trt或Tr三苯基甲基或三苯甲基Z苯甲氧基羰基除非另外说明,否则术语「片段(fragment)」与「肽片段(peptide fragment)」以同义使用。除非另外说明,否则术语「柄状物(handle)」及「柄状基团(handle group)」(例如「Fmoc-Rink酸胺柄状基团(Fmoc-Rink amide handle group)」、「Rink酸胺柄状物(Rinkamide handle)」或「Rink酰胺柄状基团(Rink amide handle group)」)与术语「连接子(linker)J (例如「Fmoc-Rink 酸胺连接子(Fmoc-Rink amide linker)」或 Fmoc-Rink-OH)常常以同义使用。常常藉由混合固相及均质溶液相肽合成HSHSPPS来制备肽:首先藉由固相肽合成SPPS来制备两个或两个以上肽片段,的后在溶液相中藉由均质溶液相肽合成HSPPS使其偶合,得到所需的目标肽。此方法因其组合SPPS与HSPPS两者的优势而尤其适用于工业规模制备大型肽。特定而言,可研发片段的SPPS且快速地按比例扩大而避免在相对较长片段的HSPPS中常常遇到的众多溶解性问题。生产周期时间相较于溶液相方法较短。另外,由于尤其在偶合反应期间使用过量试剂而使得产率及纯度常常较高,常常使得中间物无需纯化。在对由SPPS制备的片段序列的选择最佳化的后,方法的最终阶段可藉由习知HSPPS方法按比例扩大。方法的此等最终阶段为片段偶合及最终脱除氨基酸残基的保护基,亦即脱除侧链以及N端及C端的保护基,两个阶段皆在溶液中进行。因此,当应用HSHSPPS合成时,可利用SPPS的优势(亦即快速合成具有高纯度的片段)与溶液相合成的优势(亦即充分监测偶合反应以及分离及视情况存在的纯化,包括充分特性化所形成的中间片段)以尤其在工业规模上高效地制备妝。
在HSHSPPS中,始终使由SPPS制备的至少两个片段PEP-N与C-PEP在溶液相中偶合以得到所需肽PEP,该PEP为最终肽,或同样为中间肽片段而的后再与第三肽片段偶合,诸如此类。片段PEP-N在本文中提供肽PEP的N端,片段C-PEP提供肽PEP的C端,且因此片段PEP-N的C端与片段C-PEP的N端偶合得到肽PEP。在溶液相偶合期间需要保护片段PEP-N的N端且需要保护片段C-PEP的C端以免片段PEP-N与片段PEP-N、片段C-PEP与片段C-PEP,或片段C-PEP与片段PEP-N以错误方向发生不合需要的偶合。除非另外说明,否则此N端经保护的肽片段PEP-N在下文中亦称为PEP-Ν。由SPPS在支撑树脂上制备的片段C-PEP在添加最后一个氨基酸残基的后将带有N端保护基,且接着将在最终步骤中自支撑树脂裂解。此裂解通常产生C端未经保护的片段C-PEP,其须在片段C-PEP与片段PEP-N在HSPPS中偶合之前在另一步骤中加以保护。实际上,此对片段C-PEP的C端的必要保护并非仅包含I个步骤,而是包含若干个步骤,诸如反应、纯化及分离,可能具有另一后续纯化及分离。在欲制备的目标肽PEP为肽酰胺PEP-NH2 (亦即其中C端为羧酰胺基)的情况下,在于HSPPS中片段偶合期间,由于羧酰胺基自身可充当保护基,故各别片段C-PEP-NH2的C端通常不需要保护。虽然C端为羧酸的片段C-PEP-OH可容易地在SPPS的后藉由使用在裂解后形成羧酸基的树脂来获得,但使用在裂解后形成羧酰胺基的树脂(例如齐贝尔酰胺树脂(Sieber amide resin))会因片段C-PEP-NH2的侧链在裂解期间部分脱除保护基而引发问题,此系因为自酰胺树脂裂解典型地需要酸性条件,诸如使用于溶剂中的3重量%至5重量%的TFA,而侧链保护基(诸如在Fmoc/Trt SPPS的情况下为Trt (例如His (Trt))或诸如假脯胺酸衍生物(亦即Fmoc-Ser (tBu) -Thr (psiMe, Mepro) -OH)中的缩醛)在该等裂解条件下不完全稳定,导致侧链保护基部分丧失。因此为制备片段C-PEP-NH2,通常以自所需片段C-PEP-NH2的C端氨基酸残基起第二位置上的氨基酸而非以片段C-PEP-NH2的C端氨基酸本身,且以在裂解后提供羧酸 作为C端的树脂开始SPPS。自树脂裂解因此可得到无所需片段C-PEP-NH2的C端氨基酸的片段C-0H,且其中此片段C-OH的C端为自最终所需片段C-PEP-NH2的C端起第二位置上的氨基酸且带有羧酸基。接着使片段C-PEP-NH2缺少的C端氨基酸在溶液相中以其酰胺H-Xaa-NH2形式单独偶合至片段C-0H。W090/09395揭示在肽与支撑树脂之间使用可裂解连接子,其在自树脂裂解时形成二酮哌嗪(DKP)连接子基团,其中该DKP基团经由连接子基团中的Lys的ε胺基与肽的C端之间的酰胺键连接至肽。此DKP连接子基团在随后阶段中不可自肽选择性移除。因此,其不允许制备适用于HSPPS中的具有未经保护的N端且C端完全经保护的片段。此外,W090/09395的连接子基团不允许制备天然或未经修饰的肽。其仅适用于合成C端永久经修饰的肽,此系因为任何自树脂裂解的肽在其C端上始终带有DKP连接子基团,其在肽的其它肽键不裂解的情况下不可裂解。另一缺点为其裂解仅限于在裂解步骤期间使用三氟乙酸(TFA),表示将会部分或全部移除肽的氨基酸残基侧链的任何基于tBu、Boc, Trt或缩醛的保护基,从而其使用仅限于制备具有未经保护的侧链的肽或除tBu、B0C、Trt及缩醛以外的侧链保护基。

发明内容
需要藉由减少反应顺序中的步骤数目来简化HSHSPPS的程序。令人惊奇的是,此可藉由在用于制备片段C-PEP的SPPS中使用特定的形成二酮哌嗪基的二肽连接子来达成,该二肽连接子带有特定的包含二酮哌嗪的C端保护基,以及适当组合不同类型的保护基与连接子与片段C-PEP连接的特定化学性质以使连接子有可能自片段特定裂解。就本发明而言,保护基(PG)根据其系用于保护氨基酸侧链中的官能基或用于保护氨基酸或肽的N端胺基或C端羧基而分为四个不同群组:1.碱可裂解型保护基,在下文中称为“碱型PG”,2.强酸可裂解型保护基,在下文中称为“强型PG”,3.弱酸可裂解型保护基,在下文中称为“弱型PG”,及4.还原可裂解型保护基,在下文中称为“还原型PG”,其中两个群组「强型PG」及「弱型PG」亦统称为“酸可裂解型保护基”或“酸型PG”。在本发明的意义范围内,任何PG系根据下列四种分类反应条件加以分类。使用加载容量为每克树脂1.5mmol至1.7mmol的CTC树脂进行分类,仅以带有欲分类的各别PG的一种氨基酸加载树脂。除非另外说明,否则下列四种分类程序中的术语「份(part)」意谓所加载的CTC树脂起始物质的重量份率。1.用于碱型PG的分类反应条件,在下文中称为“碱性分类条件”:在25±5°C下用7±1份的裂解溶液处理加载有带有碱型PG的氨基酸的树脂25 土 5分钟,该裂解溶液由22.5 ± 2.5重量%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液组成,重量%系以裂解溶液的总重量计。2.用于强型PG的分类反应条件,在下文中称为“强分类条件”:在25±5°C下用7±1份的裂解溶液处理加载有带有强型PG的氨基酸的树脂25 ± 5分钟,该裂解溶液由85 ± 5重量%三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液组成,重量%系以裂解溶液的总重量计。3.用于弱型PG的分类反应条件,在下文中称为“弱分类条件”:在25±5°C下用7±1份的裂解溶液处理加载有带有弱型PG的氨基酸的树脂25±5分钟,该裂解溶液由2± I重量%TFA的DCM溶液组成,重量%系以裂解溶液的总重量计。4.用于还原型PG的分类反应条件,在下文中称为“还原分类条件”:在25 ± 5°C下用溶解于DMF中的7 ± I份DMF及0.1摩尔当量的可溶性有机Pd (O)催化剂(较佳为Pd[PPhJ4)处理加载有带有还原型PG的氨基酸的树脂30±5分钟,摩尔当量系以加载至树脂上的可裂解基团的摩尔数计。肽化学中习知使用的PG以及用于裂解PG的典型反应条件及参数以及试剂在此项技术中已知,例如 T.W.Greene, P.G.M.Wuts,「Protective Groups in OrganicSynthesis」,John ffiley&Sons, Inc., 1999 ;或 Lloyd-ffilliams, P., Albericio, F., Giralt,E., 「Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins」,CRC:BocaRaton, Florida, 1997。碱型PG较佳在下列可能的反应条件(在下文中称为“碱性裂解条件”)下裂解:碱性裂解条件涉及用碱性裂解溶液处理各别物质。碱性裂解溶液包含碱性试剂及溶剂。碱性裂解溶液较佳由碱性试剂及溶剂组成。若碱性试剂在进行碱性裂解的温度下为液体,则碱性试剂亦可同时用作溶剂,亦即不使用不同于碱性试剂的溶剂。碱性试剂较佳为二级胺,碱性试剂更佳选自由以下组成的群:哌啶、4_(胺基甲基)哌唆、三(2-胺基乙基)胺、吗啉、二环己胺、1,3-环己烷双(甲基胺)哌嗪、1,8_ 二氮杂双环[5.4.0] i^一 -7-烯,及其混合物。碱性试剂甚至更佳为哌啶。碱性裂解溶液亦可包含添加剂, 添加剂较佳选自由以下组成的群:6_氯-1-羟基-苯并三唑、2,4- 二硝基苯酚、苦味酸、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-苯并三唑及2-氰基-2-羟亚胺基-乙酸乙酯,及其混合物。溶剂较佳选自由以下组成的群:二甲亚砜(DMS0)、二噁烷、四氢呋喃(THF)U-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMA)、吡啶、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲苯、乙腈及其混合物;溶剂更佳为1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物。在此对碱性裂解条件的描述中术语「份(part)」意谓带有碱型PG的所处理物质的重量份率。较佳使用5份至20份碱性裂解溶液,更佳使用5份至15份碱性裂解溶液。 碱性试剂的量较佳为I重量%至30重量%,更佳为10重量%至25重量%,甚至更佳为15重量%至20重量%,其中重量%系以碱性裂解溶液的总重量计。较佳在10°C至50°C的温度下,更佳在10°C至30°C的温度下,甚至更佳在15°C至25 0C的温度下进行碱性裂解。较佳在大气压下进行碱性裂解。碱性裂解的反应时间较佳为5分钟至2小时,更佳为10分钟至I小时,甚至更佳为15分钟至30分钟。强型PG较佳在下列可能的反应条件(在下文中称为“强裂解条件”)下裂解:强裂解条件涉及用强裂解溶液处理各别物质。强裂解溶液包含酸解性试剂(acidolytic reagent)。酸解性试剂较佳选自由以下组成的群:氢酸,诸如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HC1)、盐酸(HCl )水溶液、液体氢氟酸(HF)或三氟甲烧磺酸;刘易斯酸(Lewis acid),诸如三氟硼酸-乙醚加合物或三甲基硅烷基溴,及其混合物。强裂解溶液较佳包含一或多种清除剂,该等清除剂选自由以下组成的群:二硫苏糖醇(DTT)、乙烷二硫醇(EDT)、二甲基硫化物(DMS)、三异丙基硅烷(TIS)、三乙基硅烷(TES)、1,3-二甲氧基苯(DMB)、苯酚、苯甲醚、对甲酚及其混合物。强裂解溶液亦可包含水、溶剂或其混合物,该溶剂在强裂解条件下稳定。较佳,溶剂选自由以下组成的群:二氯甲烷、二氯乙烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃、TFA、二噁烷及其混合物。更佳,酸解性试剂同时用作溶剂,因此不需要其它溶剂。在此对强裂解溶液的描述中术语「份(part)」意谓带有强型PG的所处理物质的重
量份率。较佳使用10份至30份强裂解溶液,更佳使用15份至25份强裂解溶液,甚至更佳使用19份至21份强裂解溶液。酸解性试剂的量较佳为30重量%至100重量%,更佳为50重量%至100重量%,甚至更佳为70重量%至100重量%,尤其为80重量%至100重量%,其中重量%系以强裂解溶液的总重量计。较佳使用总量为I重量%至25重量%的清除剂,更佳使用总量为5重量%至15重量%的清除剂,其中重量%系以强裂解溶液的总重量计。较佳在-10°C至30°C的温度下,更佳在-10°C至30°C的温度下,甚至更佳在5°C至15°C的温度下进行强裂解。
较佳在大气压下进行强裂解。强裂解的反应时间较佳为30分钟至20小时,更佳为I小时至10小时,甚至更佳为I小时至5小时。弱型PG较佳在下列可能的反应条件(在下文中称为“弱裂解条件”)下裂解:弱裂解条件涉及用弱裂解溶液处理各别物质。弱裂解溶液包含酸解性试剂。酸解性试剂较佳选自由以下组成的群:氢酸,诸如三氟乙酸(TFA)、三氟乙醇(TFE)、盐酸(HC1)、乙酸(AcOH),其混合物及/或与水的混合物。弱裂解溶液亦包含水、溶剂或其混合物,该溶剂在弱裂解条件下稳定。溶剂较佳选自由以下组成的群:二氯甲烷、二氯乙烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃、TFA、二噁烷及其混合物。在此对弱裂解溶液的描述中术语「份(part)」意谓带有弱型PG的所处理物质的重
量份率。较佳使用4份至20份弱裂解溶液,更佳使用5份至10份弱裂解溶液。酸解性试剂的量较佳为0.01重量%至5重量%,更佳为0.1重量%至5重量%,甚至更佳为0.15重量%至3重量%,其中重量%系以弱裂解溶液的总重量计。较佳在10°C至50°C的温度下,更佳在20°C至40°C的温度下,甚至更佳在25°C至35°C的温度下进行弱裂解。较佳在大气压下进行弱裂解。

弱裂解的反应时间较佳为5分钟至2小时,更佳为10分钟至I小时,甚至更佳为10分钟至30分钟。弱型PG可再分为其它群组,此等群组彼此相区别且可根据裂解所需的酸的量连续排列。根据上述对弱分类条件的定义,所有弱型PG可使用2±1重量%TFA的DCM溶液裂解,重量%系以裂解溶液的总重量计。仅可由至少I重量%TFA的DCM溶液裂解,而不可由含较少量TFA的溶液裂解的弱型PG称为「弱I型PG」且该等裂解条件称为“弱I型裂解条件”;已可由至少0.1重量%TFA的DCM溶液裂解,而不可由含较少量TFA的溶液裂解的弱型PG称为“弱2型PG”且该等裂解条件称为“弱2型条件”;已可由至少0.01重量%TFA的DCM溶液裂解的弱型PG称为”弱3型PG”且该等裂解条件称为“弱3型条件”;重量%系以裂解溶液的总重量计。还原型PG较佳在下列可能的反应条件(在下文中称为“还原裂解条件”)下裂解:还原裂解条件涉及用还原性裂解溶液处理各别物质。还原性裂解溶液包含催化齐U、添加剂及溶剂。催化剂较佳选自由Pd(O)的有机衍生物及Pd(II)的有机衍生物组成的群,更佳选自由以下组成的群:Pd[PPh3]4>PdCl2[PPh3]2> Pd[OAc]2[P(2,4-二甲苯酰基)3]2、Pd
2[P(邻甲苯基)3]2、就地制备的Pd(O)催化剂,其系藉由混合稳定性较低的配位Pd错合物与配体来制备,诸如 PdCl2 (PPh3) 2/PPh3、PdCl2 (PPh3) 2/P (邻甲苯基)3、Pd (DBA) 2/P (邻甲苯基)3 或Pd [P (邻甲苯基)3] 2、Pd (OAc) / 亚磷酸三乙酯、Pd (OAc) 2/PPh3 或 Pd (OAc) 2/P (邻甲苯基)3,
及其混合物;甚至更佳选自由以下组成的群:Pd[PPh3] 4、PdCl2 [PPh3] 2、Pd [OAc] 2 [P (2,4_ 二甲苯酰基)3] 2、Pd [OAc] 2 [P (邻甲苯基)3] 2及其混合物。添加剂较佳选自由以下组成的群:二甲基巴比妥酸、硫代水杨酸、N-甲基苯胺、Bu4N+BH4' NH3BH3、Me2NHBH3、tBu_NH2BH3、Me3NBH3、PyBH3、HC00H/DIEA、二乙基二硫代胺基甲酸钠、双甲酮(dimedone)、吗啉、AcOH/NMM、苯基硅烷、亚磺酸(包含PhS02H、tolS02Na)、2_乙基己酸钠(SHO、2-噻吩亚磺酸钠(STS)、4-氯-3-硝基苯亚磺酸钠(SCNBS)及i_BuS02Na,及其混合物;添加剂更佳为tolS02Na。溶剂较佳选自由以下组成的群:二甲亚砜(DMS0)、二噁烷、四氢呋喃(THF)、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N,N- 二甲基乙酰胺(DMA)、吡啶、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲苯、乙腈及其混合物;溶剂更佳为1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物。较佳,催化剂 可溶解于溶剂中且已溶解于溶剂中。在此对还原裂解条件的描述中术语「份(part)」意谓带有还原型PG的所处理物质
的重量份率。较佳使用4份至20份还原性裂解溶液,更佳使用5份至10份还原性裂解溶液。较佳使用0.001摩尔当量至I摩尔当量的催化剂,更佳使用0.01摩尔当量至0.05摩尔当量的催化剂,该摩尔当量系以加载至树脂上的还原可裂解基团的摩尔数计。较佳使用I摩尔当量至10摩尔当量的添加剂,更佳使用1.5摩尔当量至5摩尔当量的添加剂,该摩尔当量系以加载至树脂上的还原可裂解基团的摩尔数计。较佳在10°C至60°C的温度下,更佳在30°C至50°C的温度下,甚至更佳在35°C至45 °C的温度下进行还原裂解。较佳在大气压下进行还原裂解。还原裂解的反应时间较佳为15分钟至10小时,更佳为30分钟至4小时,甚至更佳为30分钟至2小时。还原性裂解溶液较佳应避光保存。较佳在由金属制成的容器中进行还原裂解。碱型PG不可由强裂解条件或弱裂解条件所裂解。较佳,碱型PG不可由强裂解条件、弱裂解条件或还原裂解条件所裂解。强型PG不可由弱裂解条件或碱性裂解条件所裂解。较佳,强型PG不可由弱裂解条件、碱性裂解条件或还原裂解条件所裂解。弱型PG不可由碱性裂解条件所裂解,但其可由强裂解条件所裂解。较佳,弱型PG不可由碱性裂解条件或还原裂解条件所裂解,但其可由强裂解条件所裂解。弱I型PG不可由弱2型裂解条件或弱3型裂解条件所裂解;弱2型PG可由弱I型裂解条件所裂解,但不可由弱3型裂解条件所裂解;弱3型PG可由弱I型裂解条件及弱2型裂解条件所裂解。较佳,弱I型PG、弱2型PG及弱3型PG亦不可由碱性裂解条件或还原裂解条件所裂解。较佳,还原型PG不可由强裂解条件、弱裂解条件及碱性裂解条件所裂解,此等PG称为“单独还原型PG”。还原型PG不可由弱裂解条件及碱性裂解条件所裂解,但可由强裂解条件所裂解;此等PG称为“混合型PG”。连接子与肽的连接亦可分类为可在此四种裂解条件之一下裂解。氨基酸与树脂的连接亦可分类为可在此四种裂解条件之一下裂解。较佳,碱型PG选自由以下组成的群:Fmoc、Bsmoc> Tfac、Dde> Dmab及cHx。较佳,强型PG 选自由以下组成的群:Boc、tBu、Pmc、Mpe、Pbf、Z、Bzl、cHx、pN02Z 及Ddz。较佳,弱型PG选自由以下组成的群:Trt、Mmt、Mtt、缩醒及2_PhiPr。弱型PG实际上为弱I型PG抑或弱2型PG,视其保护的侧链基团而定。较佳,还原型PG选自由Alloc、烯丙基、ivDde及Z组成的群。更佳,碱型PG为Fmoc。 更佳,强型PG为Boc。更佳,弱型PG为Trt。更佳,还原型PG为Alloc。在习知SPPS中,在完成SPPS的后自树脂裂解肽,该裂解产生视SPPS中所用的树脂及可能选用的柄状物而定C端呈自由羧酸基形式或呈羧酰胺形式的肽。若在HSPPS中使用此在C端上具有自由羧基的肽作为C端肽片段C-PEP,则首先须保护此自由羧酸基,的后该肽可用于HSPPS中。此对自由C端的保护需要若干方法步骤(反应、分离,或许纯化)。本发明揭示一种减少此等为保护片段中由在SPPS后自树脂裂解片段而产生的C端自由羧酸所需的步骤的方法。此系藉由在SPPS中使用该形成二酮哌嗪的二肽连接子以使所需片段C-PEP的第一氨基酸XaaCil)经由该连接子偶合于树脂支撑物上来达成,该连接子在完成SPPS且自树脂裂解所合成的片段C-PEP时形成包含二酮哌嗪残基的C端保护基。形成二酮哌嗪的二肽连接子包含二肽部分,其第一氨基酸Xaal经由其羧酸基连接至树脂,且其第二氨基酸Xaa2经由其侧链连接柄状基团HG,该柄状基团HG连接至肽基,且Xaa2带有N端保护基PG2。该包含二酮哌嗪残基的C端保护基系藉由以下而形成:裂解Xaa2的保护基PG2,从而使得Xaa2与Xaal之间有可能进行分子内死循环,该死循环形成该二酮哌嗪残基且同时使Xaal自树脂裂解。此藉由自树脂裂解而形成的包含二酮哌嗪残基的C端保护基在自树脂裂解后仍连接至片段C-PEP的C端且从而充当片段C-PEP的C端的保护基,该片段C-PEP因此可直接用于HSPPS中。在此C端片段C-PEP与N端肽片段PEP-N藉由HSPPS偶合产生肽PEP后,使包含二酮哌嗪残基的C端保护基自肽PEP裂解,较佳与脱除片段PEP中的任何经保护侧链的保护基同时进行。形成二酮哌嗪的二肽连接子及所得的包含二酮哌嗪残基的C端保护基包含柄状基团HG,其使得肽PEP有可能自包含二酮哌嗪残基的C端保护基裂解。为使此所需功能成为可能,以某种方式建构该形成二酮哌嗪的二肽连接子,以使以下四个主要裂解步骤:1.在SPPS的循环期间裂解氨基酸的各N端保护基,
2.藉由以下使片段C-PEP自树脂裂解:使保护基PG2自Xaa2裂解,且接着藉由形成包含二酮哌嗪残基的C端保护基使Xaal自树脂裂解,及3.使包含二酮哌嗪残基的C端保护基自肽PEP裂解,该裂解为使肽自包含二酮哌嗪残基的C端保护基中的HG裂解;4.裂解任何侧链PG;可在不同反应条件下进行,因此各裂解可各别地且独立于其它裂解在反应顺序中的适当时间点进行。为达成此功能,涉及反应策略中的各种PG的化学性质以及连接子的柄状基团HG与肽的连接的化学性质系以如下方式选择,以使任何PG以某种方式属于四种PG类型之一,且柄状基团HG与肽的连接可在该等反应条件下裂解,以使此对保护基的分组以及此对柄状基团HG与肽的连接性质的选择允许所需且必要的各别及逐步裂解。若所需肽C-PEP中存在一或多个侧链PG,则一个较佳具体实例为1.任何侧链保护基为强型PG、还原型PG或混合型PG ;及2.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外) 的任何N端PG为碱型PG,或若任何侧链保护基不为还原型PG或混合型PG,则SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG为碱型PG、还原型PG或混合型PG ;及3.若任何侧链保护基及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG不为还原型或混合型PG,则PG2为弱型、还原型或混合型PG,或PG2为弱型PG;及4.SPPS中用于合成C-PEP的最后一个氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG为碱型PG或弱型PG,或若任何侧链保护基不为还原型或混合型PG,则SPPS中用于合成C-PEP的最后一个氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG为碱型PG、弱型PG、还原型PG或混合型PG ;及5.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪残基的C端保护基可在以下条件下自肽PEP或C-PEP裂解:在强裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为还原型或混合型PG,则在强裂解条件或还原裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为弱型PG,则在弱裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为弱I型PG,则在弱I型裂解条件下裂解。若所需肽C-PEP中存在一或多个侧链PG,则一个更佳具体实例为
1.任何侧链保护基为强型PG ;及
2.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG为碱型PG ;及3.若任何侧链保护基及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG不为还原型或混合型PG,则PG2为弱型、还原型或混合型PG ;及4.若任何侧链保护基不为还原型或混合型PG,则SPPS中用于合成C-PEP的最后一个氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG为碱型PG、弱型PG、还原型PG或混合型PG;及5.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪残基的C端保护基可在以下条件下自肽PEP或C-PEP裂解:在强裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为还原型或混合型PG,则在强裂解条件或还原裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为弱型PG,则在弱裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为弱I型PG,则在弱I型裂解条件下裂解。若所需肽C-PEP中存在一或多个侧链PG,则另一个更佳具体实例为1.任何侧链保护基为强型PG、还原型PG或混合型PG ;及2.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG为碱型PG ;及3.PG2 为弱型 PG;及4.SPPS中用于合成C-PEP的最后一个氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG为碱型PG或弱型PG ;及5.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪残基的C端保护基可在以下条件下自肽PEP或C-PEP裂解:若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为还原型或混合型PG,则在强裂解条件或还原裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为弱I型PG,则在弱I型裂解条件下裂解。若所需肽C-PEP中不存在侧链PG,则一个较佳具体实例为1.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG为碱型、还原型或混合型PG ;及2.若SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG不为还原型或混合型PG,则PG2为强型、弱型、还原型或混合型PG,或
PG2为强型、弱型或混合型PG ;及3.SPPS中用于合成C-PEP的最后一个氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG为碱型、强型、弱型、还原型或混合型PG ;及4.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪残基的C端保护基可在以下条件下自肽PEP或C-PEP裂解:若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型PG,则在强裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型、还原型及混合型PG,则在强裂解条件或还原裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型或弱型PG,则在弱裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型或弱I型PG,则在弱I型裂解条件下裂解。若所需肽C-PEP中不存在侧链PG,则一个更佳具体实例为1.SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸除最后一个氨基酸以外(亦即除肽C-PEP的N端氨基酸的N端PG以外)的任何N端PG为碱型PG ;及2.PG2为强型、弱型、还原型或混合型PG,或3.SPPS中用于合成C-PEP的最后一个氨基酸(亦即肽C-PEP的N端氨基酸)的N端PG为碱型、强型、弱型、还原型或混合型PG ;及4.PEP或C-PEP的包含二酮哌嗪残基的C端保护基可在以下条件下自肽PEP或C-PEP裂解:若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型PG,则在强裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型、还原型及混合型PG,则在强裂解条件或还原裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型或弱型PG,则在弱裂解条件下裂解,或若PG2及SPPS中用于合成C-PEP的氨基酸的任何N端PG不为强型或弱I型PG,则在弱I型裂解条件下裂解。本发明的主题为制备肽C-PEP的方法(C-PEP),C-PEP包含肽基PEP-C,PEP-C的C端由保护基DKP-PG保护,DKP-PG包含柄状基团HG,视情况包含间隔基SG且包含二酮哌嗪残基DKP ;SG为肽化学中习知使用的间隔基;DKP为衍生自二肽残基DPR的二酮哌嗪残基;DPR包含α氨基酸残基Xaal及Xaa2 ;Xaal为DPR 的C端氨基酸残基;Xaa2为DPR的N端氨基酸残基,且Xaa2具有侧链,该侧链经官能基FG取代;PEP-C 经由 XaaC(1)连接至 HG ;
XaaC为PEP-C的氨基酸残基;XaaC(1)中的索引(I)表示PEP-C的C端位置;XaaCω为PEP-C的C端氨基酸残基; HG为固相肽合成SPPS中习知用于使肽的C端连接至固相的柄状基团,其允许C端在不使肽中连接两个氨基酸残基的酰胺键裂解的条件下自HG裂解;HG直接连接至FG,或若存在SG,则HG连接至SG且SG连接至FG ;方法(C-PEP)包含步骤(iii);步骤(iii)包含反应(INRIFO);反应(INRIFO)为如下反应,其包含在肽PEP-C-DKP-L-树脂A中的分子内成环反应及同时的裂解反应;PEP-C-DKP-L-树脂A为C-PEP的前驱体且包含PEP-C及树脂DKP-L-树脂A,其中PEP-C系连接至DKP-L-树脂A ;DKP-L-树脂A包含树脂A及形成DKP-PG的连接子DKP-L,其中树脂A系连接至DKP-L,树脂A为在SPPS中习知用作固相`的树脂,DKP-L包含HG,视情况包含SG,及DPR,其中DPR的C端羧酸基(其为Xaal的羧酸基)连接至树脂A ;
`
反应(INRIFO)中的分子内成环为DPR的N端胺基(其为Xaa2的α胺基)与DPR的C端羧酸基进行反应,从而形成DKP,从而同时使Xaal自树脂A裂解且形成DKP-PG ;HG以某种方式选择,以使HG与XaaCw之间的键不在反应(INRIFO)期间裂解。藉由使用HG,提供XaaC(1)与树脂A之间的裂解位点,该裂解位点可在肽中任何介于两个氨基酸之间的酰胺键不裂解的情况下选择性裂解;该裂解位点为XaaCw与HG之间的键。藉由此裂解,以未经保护的自由羧酸基形式释放XaaC(1)的C端,或以酰胺基形式,较佳以C(O)NH2形式释放C端羧酸基,视HG的化学性质而定。藉由使用HG,此包含DKP的特定C端保护基如同肽化学中习知使用的C端保护基
一般起作用。较佳,在反应(INRIFO)之前藉由固相肽合成SPPS (PEP-C)制备PEP-C,SPPS(PEP-C)更佳使用DKP-L-树脂A作为固相。因此,本发明的另一主题为方法(C-PEP),其中该方法(C-PEP)以及其所有较佳具体实例如上文所定义,其中在步骤(iii)之前藉由固相肽合成SPPS (PEP-C)制备PEP-C,SPPS (PEP-C)更佳使用DKP-L-树脂A作为固相。在SPPS (PEP-C)中,藉由使XaaC首先连续地偶合至固相,接着偶合至生长中的肽链来构筑PEP-C。各个XaaC可个别且依序地偶合,但其中两者或两者以上亦可例如以二肽、三肽或寡肽形式偶合至固相或偶合至生长中的肽链。树脂A以某种方式选择,以使树脂A与Xaal之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解。较佳,SPPS (PEP-C)进一步包含步骤(i)及步骤(ii);在步骤(i )中,使XaaC(1)连接至DKP-L-树脂A ;在步骤(ii)中,藉由SPPS (PEP-C)使其它氨基酸XaaC根据PEP-C的序列连续地最初连接至XaaCw且接着连接至生长中的肽基链的N端,该生长中的肽基链经由DKP-L结合至树脂A ;HG以某种方式选择,以使HG与XaaCw之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解;且HG与XaaC(1)之间的键不在反应(INRIFO)期间裂解;其中C-PEPjMg A、DKP-PG, HG、SG、DPR、DKP、XaaU XaaC(1)、XaaC, PEP-C、SC-PG,反应(INRIFO)以及其所有较佳具体实例如上文所定义;且其中PEP-C、HG、SG及DPR以及树脂A之间的连接性以及其所有较佳具体实例如上文所定义。在反应(INRIF0)之前,藉由保护基PG2保护DPR的N端,该N端为Xaa2的α胺基。因此,本发明的另一主题为方法(C-PEP),其中该方法(C-PEP)以及其所有较佳具体实例如上文所定义,其中步骤(iii)包含裂解保护基PG2 ;PG2为肽化学中习知使用的N端保护基且选自由以下组成的群:碱可裂解型保护基、酸可裂解型保护基以及还原可裂解型保护基。在反应(INRIFO)之前在步骤(iii)中使PG2自Xaa2裂解。较佳,在SPPS (PEP-C)的后使PG2自Xaa2裂解。较佳,在步骤(ii)中添加PEP-C的N端氨基酸残基的后使PG2自Xaa2裂解。

使PG2自Xaa2裂解可与反应(INRIFO)连续或同时进行。PG2以某种方式选择,以使PG2与Xaa2之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解。PG2及HG以某种方式选择,以使HG与XaaCil)之间的键不在使PG2自Xaa2裂解期间裂解。在C-PEP或PEP-C中存在I个以上SC-PG的情况下,C-PEP或PEP-C的任何侧链可独立于C-PEP或PEP-C的任何其它侧链由保护基SC-PG保护,此等SC-PG彼此独立地相同或不同。任何SC-PG为肽化学中习知用于在SPPS期间或在HSPPS期间保护肽的氨基酸残基的侧链或保护氨基酸的侧链的保护基。较佳,任何SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在SPPS (PEP-C)期间裂解。较佳,任何SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在反应(INRIFO)期间裂解。较佳,PG2及任何保护基SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在使PG2自Xaa2裂解期间裂解。为避免冗述,针对用于合成PEP-C及C-PEP的氨基酸使用缩写XaaC,或将其分别用于PEP-C及C-PEP或PEP-N的氨基酸残基;且同样,针对用于合成PEP-N的氨基酸使用XaaN,或将其用于PEP-N的氨基酸残基。因此,此等缩写不区分氨基酸与氨基酸残基。熟习此项技术者可根据上下文明确区分表示氨基酸抑或氨基酸残基。为概述连接性:PEP-C 经由 XaaC(1)连接至 HG。HG经由FG直接连接至Xaa2,或若存在SG,则HG连接至SG且SG经由FG连接至
Χββ2 οXaa2经由肽键与Xaal连接,在DPR中Xaa2为N端氨基酸且Xaal为C端氨基酸。
在PEP-C-DKP-L-树脂A中,Xaal的羧酸基连接至树脂A。树脂A以某种方式选择,以使树脂A与Xaal之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解。HG以某种方式选择,以使HG与XaaCw之间的键不在反应(INRIFO)期间裂解。HG以某种方式选择,以使HG与XaaCw之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解。PG2以某种方式选择,以使PG2与Xaa2之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解。PG2及HG以某种方式选择,以使HG与XaaCil)之间的键不在使PG2自Xaa2裂解期间裂解。较佳,任何SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在SPPS (PEP-C)期间裂解。较佳,任何SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在反应(INRIFO)期间裂解。较佳,PG2及任何保护基SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在使PG2自Xaa2裂解期间裂解。较佳,C-PEP为 PEP-C,其 C 端由 DKP-PG 保护。较佳,DPR由氨基酸残基Xaal及Xaa2组成。Xaal及Xaa2以某种方式选择,以使其允许藉由反应(INRIFO)形成DKP。较佳,C-PEP的任何侧链由保护基SC-PG保护。若C-PEP中存在任何SC-PG,则较佳以某种方式选择HG,以使HG及从而DKP-PG在裂解SC-PG、较佳所有SC-PG的反应中同时自XaaCw裂解。较佳,SC-PG选自由碱可裂解型保护基、酸可裂解型保护基及还原可裂解型保护基组成的群。更佳,任何SC-PG为强型PG。较佳,FG在连接至HG或连接至SG时以连接基团CG形式存在。较佳,FG选自由C00H、NH2、OH及SH组成的群,更佳选自由NH2及OH组成的群;因此CG较佳选自由-C (O) O-、-N (H) _、-O-及-S-组成的群,更佳选自由-N (H)-及-O-组成的群。HG与FG之间的键,或若DKP-PG中存在SG,则HG与SG之间的键及SG与FG之间的键,经选择而具有如下化学性质,其不在SPPS (PEP-C)期间裂解;且其不在反应(INRIF0)、步骤(i )、步骤(ii )或步骤(iii )期间裂解;较佳,其亦不在任何保护基的任何裂解期间裂解。较佳,HG与FG之间的键,或若DKP-PG中存在SG,则HG与SG之间的键及SG与FG之间的键,为酰胺键或酯键,更佳为酰胺键。尤其,此等键与肽中介于两个氨基酸残基之间的习知酰胺键具有相似的性质或稳定性。C-PEP的N端可由保护基N-PG保护,N-PG为肽化学中习知使用的N端保护基。较佳,N-PG选自由碱可裂解型保护基、酸可裂解型保护基及还原可裂解型保护基组成的群。 因此,C-PEP包含N端未经保护的具体实例及PEP-C的N端由N-PG保护的具体实例。本发明的另一主题为制备C-PEP的方法(C-PEP),其特征在于步骤(i)、步骤(ii)及步骤(iii),该等步骤包含固相肽合成SPPS (PEP-C)及后续反应(INRIFO);在作为固体支撑物的树脂DKP-L-树脂A上进行SPPS (PEP-C),DKP-L-树脂A为带有形成DKP-PG的连接子DKP-L作为官能基的树脂A,DKP-L包含HG,视情况包含SG,及DPR,其中DPR的Xaal经由其C端羧酸基连接至树脂A,反应(INRIFO)为DPR的N端胺基与DPR的C端羧酸基进行分子内成环反应,从而形成DKP ;且藉由反应(INRIF0),使Xaal同时自树脂A裂解且形成DKP-PG ;在步骤(i )中,使XaaC(1)连接至DKP-L-树脂A ;在步骤(ii)中,藉由SPPS (PEP-C)使其它氨基酸XaaC根据PEP-C的序列连续地最初连接至XaaCw且接着连接至生长中的肽链的N端,该生长中的肽链经由DKP-L结合至树脂A ;

在步骤(ii)中添加PEP-C的N端氨基酸残基的后进行步骤(iii),在步骤(iii)中,藉由反应(INRIFO)形成C-PEP,树脂A以某种方式选择,以使树脂A与Xaal之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解;HG以某种方式选择,以使HG与XaaCw之间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解;且HG与XaaC(1)之间的键不在反应(INRIF0)期间裂解;保护C-PEP的侧链的任何SC-PG以某种方式选择,以使SC-PG不在SPPS (PEP-C)期间裂解;且SC-PG不在反应(INRIF0)期间裂解;其中C-PEPjMg A、DKP-PG, HG、SG、DPR、DKP、XaaU XaaC(1)、XaaC、PEP-C、SC-PG、反应(INRIFO)以及其所有较佳具体实例如上文所定义;且其中PEP-C、HG、SG及DPR以及树脂A之间的连接性以及其所有较佳具体实例如上文所定义。本发明的另一主题为制备形成DKP-PG的连接子DKP-L的方法(DKP-L),方法(DKP-L)包含步骤(DKP-L-1)、步骤(DKP_L_iii)且视情况包含步骤(DKP-L-1i);在步骤(DKP-L-1)中,使 Xaa2 偶合至 Xaal ;若DKP-L中存在SG,则在视情况选用的步骤(DKP_L_ii )中,使SG偶合至Xaa2 ;在步骤(DKP-L-1ii)中,若DKP-L中存在SG,则使HG偶合至SG,或使HG偶合至Xbb2 ;其中DKP-PG、DKP-L、DKP、Xaa2、Xaa1、HG及SG以及其所有较佳具体实例如上文所定义。步骤(DKP-L-1)、步骤(DKP-L-1ii)及视情况选用的步骤(DKP-L-1i)可以任何次
序进行。较佳,首先进行步骤(DKP-L-1),若DKP-L中存在SG,则接着进行视情况选用的步骤(DKP-L-1 i ),且进行步骤(DKP-L-1 i i )作为最后步骤。本发明的另一主题为制备DKP-L-树脂A的方法(DKP-L-树脂A),
方法(DKP-L-树脂A)为方法(XI)或方法(X2);方法(Xl)包含步骤(Xl-1)、步骤(Xl-1i)、步骤(Xl-1v)且视情况包含步骤(Xl-1ii);在步骤(Xl-1)中,使氨基酸Xaal偶合至树脂A ;在步骤(Xl-1i)中,使氨基酸Xaa2偶合至Xaal ;若DKP-L-树脂A中存在SG,则在视情况选用的步骤(Xl_iii )中,使SG偶合至Xaa2的侧链;在步骤(Xl-1v)中,若DKP-L-树脂A中存在SG,则使HG偶合至SG,或使HG偶合至 Xaa2 ;方法(X2 )包含步骤(X2_i ); 在步骤(X2_i )中,使DPK-L偶合至树脂A ;

其中DKP-L-树脂 A、树脂 A、DKP-PG、DKP-L、DKP、Xaa2、Xaa1、HG 及 SG 以及其所有
较佳具体实例如上文所定义。在方法(Xl)中,步骤(Xl-1)、步骤(Xl-1i)、步骤(Xl-1v)及视情况选用的步骤(Xl-1ii)可以任何次序进行。较佳,首先进行步骤(Xl-1 ),接着进行步骤(Xl-1i ),若DKP-L-树脂A中存在SG,则接着进行视情况选用的步骤(Xl-1iii),且进行步骤(Xl-1v)作为最后步骤。HG、任何SG、Xaa2及Xaal在方法(DKP-L-树脂A)或方法(DKP-L)中用作构筑嵌段时可带有保护基:在方法(Xl)或方法(DKP-L)中用作构筑嵌段的Xaal系以习知C端经保护的氨基酸形式使用,保护基为保护基C-PG。Xaal的α胺基未经保护且在各别偶合反应中为偶合位点。在方法(Xl)或方法(DKP-L)中用作构筑嵌段的Xaa2系以习知N端经保护的氨基酸形式使用,保护基为保护基N-PG。Xaa2的1_羧酸基未经保护且在各别偶合反应中为偶合位点。Xaal或Xaa2的任何侧链亦较佳由SC-PG保护。C-PG为肽化学中习知用于保护氨基酸的羧酸基或用于保护肽的C端的保护基。较佳,C-PG选自由碱可裂解型保护基、酸可裂解型保护基及还原可裂解型保护基组成的群。呈用于各别偶合反应中的个别构筑嵌段形式的各HG及SG具有至少两个活性官能基。第一活性官能基用作类似于肽合成中的氨基酸构筑嵌段的α胺基的官能基,且可由适合保护基保护,较佳由保护基N-PG保护;较佳,此官能基为OH或NH2且在经保护状态下以-O-或-N⑶-形式存在。HG及SG的另一活性官能基用作类似于肽合成中的氨基酸构筑嵌段的羧酸基的官能基,且通常未经保护,且在各别偶合反应中为偶合位点。较佳,此未经保护的位点为羧酸基。在此偶合反应的后,第一活性官能基的任何保护基、较佳该N-PG可经裂解,以使此第一官能基可用于下一偶合反应。可由方法(DKP-L)获得的形成DKP-PG的连接子DKP-L通常仍带有HG的任何保护基,以可用于在方法(Χ2)中偶合至树脂Α。
在方法(X2)中进行偶合之前,须使Xaal的C-PG裂解掉。较佳,方法(DKP-L)包含此使C-PG自Xaal裂解。因此,DKP-L包含两个具体实例,一个具体实例在Xaal上具有保护基C-PG,另一个具体实例在Xaal上不具保护基C-PG。在DKP-L-树脂A中,HG可仍带有用于制备DKP-L-树脂A的构筑嵌段HG中所存在的保护基。HG上的任何保护基须在方法(C-PEP)中的步骤(i)之前裂解。较佳,方法(DKP-L-树脂A)包含此使任何保护基自HG裂解。因此,DKP-L-树脂A包含两个具体实例,一个具体实例在HG上具有任何保护基,另一个具体实例在HG上不具任何保护基。本发明的另一主题为制备肽PEP的方法(PEP-HSPPS),方法(PEP-HSPPS)包含步骤(1-ρ印)及步骤(i1-ρ印),在步骤(1-pep)中,根据方法(C-PEP)制备肽C-PEP ;接着在步骤(i1-p印)中,藉由均质溶液相肽合成HSPPS使在步骤(1-PEP)中获得的C-PEP与N端经保护的氨基酸或N端经保护的肽PEP-N偶合;其中方法(C-PEP)、C-PEP及PEP-N以及其所有较佳具体实例如上文所定义。方法(PEP-HSPPS)为包含另一步骤(ii_p印)的方法(C-PEP)。在PEP-N中存在I个以上SC-PG的情况下,PEP-N的任何侧链可独立于PEP-N的任何其它侧链由保护基SC-PG保护,此等SC-PG彼此独立地相同或不同;其中SC-PG以及其所有较佳具体实例如上文所定义。在方法(PEP-HSPPS)中使用N端未经保护的C-PEP。因此,在方法(PEP-HSPPS)的偶合反应之前使保护C-PEP的N端的 任何保护基N-PG裂解。在方法(C-PEP)中较佳包含此裂解反应。由于藉由SPPS (PEP-C)制备PEP-C,故通常使用在α胺基上具有经保护的胺基N-PG的用于SPPS (C-PEP)中的PEP-C的N端氨基酸。视PEP-C的N端的此保护基N-PG的性质而定,此N-PG可在反应(INRIFO)中的成环的条件下同时自N端裂解,或其可在反应(INRIFO)之前与使PG2自Xaa2裂解同时自N端裂解。本发明的其它主题为下列方法:1.方法(PEP-HSPPS),其中已藉由方法(DKP-L-树脂A)制备方法(C-PEP)的DKP-L-树脂A ;2.方法(PEP-HSPPS ),其中已藉由方法(DKP-L-树脂A)的方法(Xl)制备方法(C-PEP)的DKP-L-树脂A ;3.方法(PEP-HSPPS ),其中已藉由方法(DKP-L-树脂A)的方法(X2)制备方法(C-PEP)的DKP-L-树脂A ;且其中已藉由方法(DKP-L)制备方法(DKP-L-树脂A)的DKP-L ;4.方法(C-PEP),其中已藉由方法(DKP-L-树脂A)制备DKP-L-树脂A ;5.方法(C-PEP),其中已藉由方法(DKP-L-树脂A)的方法(Xl)制备DKP-L-树脂A ;6.方法(C-PEP),其中已藉由方法(DKP-L-树脂A)的方法(X2)制备DKP-L-树脂A ;且其中已藉由方法(DKP-L)制备方法(DKP-L-树脂A)的DKP-L。
本发明的另一主题为选自由以下组成的群的化合物:C_PEP、PEP-C-DKP-L-树脂A、DKP-L-树脂 A 及 DKP-L,其中 C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂 A、DKP-L-树脂 A 及 DKP-L 以及其所有较佳具体实例如上文所定义。本发明的另一主题为C-PEP的用途,其中C-PEP以及其所有较佳具体实例如上文所定义,其在均质溶液相肽合成HSPPS中用于藉由C-PEP与N端经保护的氨基酸或N端经保护的肽PEP-N进行偶合反应来制备肽PEP。本发明的其它主题为选自由C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂A、DKP_L_树脂A及DKP-L组成的群的化合物的用途;或DKP-L的用途,其用作形成DKP-PG的连接子,其用于肽化学中;或用于制备肽;或用于制备肽的方法中;或
用于制备肽的方法的步骤中;或用于肽偶合反应中;或用于制备肽的SPPS中;或用于制备肽的HSPPS中;其中C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂 A、DKP-L-树脂 A、DKP-L 及 DKP-PG 以及其所有较佳具体实例如上文所定义。在至此所述的本发明具体实例中包含本发明的下列任何具体实例。本发明的另一主题为制备式(II1-PEP-PG)化合物的方法(A),
权利要求
1.一种制备肽C-PEP的方法(C-PEP), C-PEP包含肽基PEP-C,PEP-C的C端由保护基DKP-PG保护,DKP-PG包含柄状基团HG,视情况包含间隔基SG,及二酮哌嗪残基DKP ; SG为肽化学中习知使用的间隔基; DKP为衍生自二肽残基DPR的二酮哌嗪残基; DPR包含α氨基酸残基Xaal及Xaa2 ; Xaal为DPR的C端氨基酸残基; Xaa2为DPR的N端氨基酸残基,且Xaa2具有侧链,该侧链经官能基FG取代; PEP-C经由XaaC(1)连接至HG ; XaaC为PEP-C的氨基酸残基; XaaCw中的索引(I)表示PEP-C的C端位置; XaaCw为PEP-C的C端氨基酸残基; HG为固相肽合成SPPS中习知用于使肽的C端连接至固相的柄状基团,其允许该C端在不使肽中连接两个氨基酸残基的酰胺键裂解的条件下自HG裂解; HG直接连接至FG,或若存在SG,则HG连接至SG且SG连接至FG ; 方法(C-PEP )包含步骤 (i i i ); 步骤(iii)包含反应(INRIFO); 反应(INRIFO)为包含以下的反应:在肽PEP-C-DKP-L-树脂A中的分子内成环反应及同时的裂解反应; PEP-C-DKP-L-树脂A为C-PEP的前驱体且包含PEP-C及树脂DKP-L-树脂A,其中PEP-C系连接至DKP-L-树脂A ; DKP-L-树脂A包含树脂A及形成DKP-PG的连接子DKP-L,其中树脂A系连接至DKP-L, 树脂A为在SPPS中习知用作固相的树脂, DKP-L包含HG,视情况包含SG,及DPR,其中DPR的C端羧酸基为Xaal的羧酸基且连接至树脂A; 反应(INRIFO)中的分子内成环为DPR的N端胺基与DPR的C端羧酸基反应,从而形成DKP,从而同时使Xaal自树脂A裂解且形成DKP-PG,其中该DPR的N端胺基为Xaa2的α胺基; HG以某种方式选择,以使HG与XaaCil)的间的键不在反应(INRIFO)期间裂解。
2.如权利要求第I项的方法(C-PEP),其中在步骤(iii)的前藉由固相肽合成SPPS(PEP-C)制备 PEP-C ;且 树脂A以某种方式选择,以使树脂A与Xaal的间的键不在SPPS (PEP-C)期间裂解。
3.一种制备形成DKP-PG的连接子DKP-L的方法(DKP-L), 方法(DKP-L)包含步骤(DKP-L-1)、步骤(DKP-L-1ii)且视情况包含步骤(DKP_L_ii); 在步骤(DKP-L-1 )中,使Xaa2偶合至Xaal ; 在视情况选用的步骤(DKP-L-1i)中,使SG偶合至Xaa2 (若在DKP-L中存在SG); 在步骤(DKP-L-1ii)中,使HG偶合至SG (若在DKP-L中存在SG)或Xaa2 ; 其中DKP-PG、DKP-L, DKP、Xaa2、XaaUHG及SG如权利要求第I项中所定义。
4.一种制备DKP-L-树脂A的方法(DKP-L-树脂A),方法(DKP-L-树脂A)为方法(Xl)或方法(X2); 方法(Xl)包含步骤(Xl-1)、步骤(Xl-1i)、步骤(Xl-1v)且视情况包含步骤(Xl_iii); 在步骤(Xl-1)中,使氨基酸Xaal偶合至树脂A ; 在步骤(Xl-1i)中,使氨基酸Xaa2偶合至Xaal ; 在视情况选用的步骤(Xl-1ii )中,使SG偶合至Xaa2的侧链(若在DKP-L-树脂A中存在 SG); 在步骤(Xl-1v)中,使HG偶合至SG (若在DKP-L-树脂A中存在SG)或Xaa2 ; 方法(X2)包含步骤(X2-1); 在步骤(X2-1 )中,使DPK-L偶合至树脂A ; 其中 DKP-L-树脂 A、树脂 A、DKP-PG, DKP-L, DKP、Xaa2、Xaal、HG 及 SG 如权利要求第 I项中所定义。
5.如权利要求第I项至第4项中任一项的方法,其中 HG为选自由以下组成的群的柄状基团:式(HGF-1)柄状基团、式(HGF-1I)柄状基团、式(HGF-1II)柄状基团、式(HGF-1V)柄状基团、式(HGF-V)柄状基团及式(HGF-VI)柄状基团,
6.如权利要求第I项至第5项中任一项的方法,其中 SG为选自由以下组成的群的间隔基:式(SG-1)间隔基、式(SG-1I)间隔基、式(SG-1II)间隔基、式(SG-1V)间隔基及式(SG-V)间隔基;
7.如权利要求第I项至第6项中任一项的方法,其中 Xaal选自由以下组成的群:天然存在的α氨基酸残基、α -N-甲基氨基酸残基、L-Hpr残基、D-Hpr残基、DL-Hpr残基、2- (C^5烧基)-D-氨基酸残基、2- (C^5烧基)-L-氨基酸残基、2- ((V5烷基)-DL-氨基酸残基及衍生自式(HypX)化合物的残基;
8.如权利要求第I项至第7项中任一项的方法,其中 Xaa2选自由以下组成的群:L_Lys残基、D-Lys残基、DL-Lys残基、L-Orn残基、D-Orn残基、DL-Orn残基、L-4-胺基脯胺酸残基、D-4-胺基脯胺酸残基、DL-4-胺基脯胺酸残基、L-α, y-二胺基-丁酸残基、D-a, y-二胺基丁酸残基、DL-a , y-二胺基-丁酸残基、L-α, β-二胺基丙酸残基、D-a,β - 二胺基-丙酸残基、DL-a,β - 二胺基丙酸残基、L-Ser残基、D-Ser 残基、DL-Ser 残基、L-Thr 残基、D-Thr 残基、DL-Thr 残基、L-Cys 残基、D-Cys残基、DL-Cys残基、L-高半胱胺酸残基、D-高半胱胺酸残基、DL-高半胱胺酸残基、L-Asp残基、D-Asp残基、DL-Asp残基、L-Glu残基、D-Glu残基及DL-Glu残基。
9.如权利要求第I项至第8项中任一项的方法,其中 树脂A选自由以下组成的群:羟甲基聚苯乙烯(HMPS)树脂、基于聚乙二醇(PEG)的树脂、PEG接枝至不同于PEG树脂的树脂上的树脂、聚苯乙烯树脂、对苯甲氧基苯甲醇树脂、氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂、聚(乙烯醇)-接枝-聚(乙二醇)(PVA-g-PEG)树脂。
10.一种制备肽PEP的方法(PEP-HSPPS), 方法(PEP-HSPPS)包含步骤(1-p印)及步骤(i1-p印), 在步骤(1-pep)中,根据如权利要求第I项中所定义的方法(C-PEP)制备肽C-PEP ; 接着 在步骤(i1-pep)中,藉由均质溶液相肽合成HSPPS使在步骤(1-PEP)中所获得的C-PEP与N端经保护的氨基酸或与N端经保护的肽PEP-N偶合; 其中方法(C-PEP)及C-PEP如权利要求第I项中所定义。
11.一种化合物,其选自由以下组成的群:C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂A、DKP-L-树脂A及DKP-L ;其中C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂A、DKP-L-树脂A及DKP-L如权利要求第I项中所定义。
12.一种选自由C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂A、DKP-L-树脂A及DKP-L组成的群的化合物用于肽化学中的用途,或一种DKP-L作为形成DKP-PG的连接子的用途;其中C-PEP、PEP-C-DKP-L-树脂A、DKP-L-树脂A、DKP-L及DKP-PG如权利要求第I项中所定义。
全文摘要
本发明系关于一种用于N端肽片段PEP-N及C端肽片段C-PEP的均质溶液相肽合成(HSPPS)的方法,其中C-PEP带有包含二酮哌嗪(DKP)的特定C端保护基,其含有柄状基团HG,其中HG系连接至肽片段的C端;从而此包含DKP的特定C端保护基可自肽如同习知所用的C端保护基一般选择性裂解。藉由使用此包含DKP及HG的C端保护基,可避免基于HSPPS及固相肽合成(SPPS)的组合的汇集肽合成中的某些方法步骤。本发明进一步关于一种藉由SPPS制备该经特定保护的片段C-PEP的方法,其系藉由使用包含特定二肽及HG的连接子以使生长中的肽链连接至树脂而达成,当肽片段C-PEP自支撑树脂裂解时,该连接子形成该DKP基团;且进一步关于制备方法的中间物。
文档编号C07K1/04GK103189384SQ201180052637
公开日2013年7月3日 申请日期2011年10月20日 优先权日2010年10月29日
发明者费尔南多·阿尔贝利西欧, 米谢勒·克里斯托, 马蒂厄·吉罗, 米里亚姆·贡戈拉贝尼特斯, 茱蒂特·图拉-普赫 申请人:隆萨有限公司
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