专利名称：金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及金丝慈竹的叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
叶绿素是光合作用中捕获光的主要成分，在植物生长发育后期、叶片衰老或果实成熟时，叶绿素被大规模降解。叶绿素降解对叶片衰老过程中蛋白质氮的循环再利用具有重要意义(H5rtensteiner S，Annu Rev Plant Biol, 57: 55-77，2006);同时叶绿素降解是衰老叶肉细胞的一种解毒方式(Matile et al. Plant Physiology and Biochemistry, 27: 595-604， 1989; Matile et al. Plant Physiology, 112: 1403-1409， 1996)。最新的叶绿素降解途径为叶绿素首先脱去镁离子，生成脱镁叶绿素(pheophytin),然后脱续叶绿素在 PPH (Pheophytin Pheophorbide Hydrolase) [Silvia Schelbert, et al. The Plant Cell, 21: 767 - 785，2009]，又称 CRNl (Co-regulated with NYEI) [Ren G, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 52(5) :496-504, 2010]的作用下被脱去植醇形成脱镁叶绿酸(Phaeophorbide a, Pheide)。脱镁叶绿酸是叶绿素降解中最后的绿色色素，它的B卜啉大环在脱镁叶绿酸加氧酶(Pheophorbide a oxygenase, PaO)和红色叶绿素降解物还原酶(red chlorophyll catabolite reductase, RCCR)的作用下经过两步反应被氧化开环。由于卟啉环裂解与叶片色素(绿色)丧失有关，因此这一步是叶片衰老时叶色黄化的关键步骤。该氧化过程的中间产物是红色叶绿素代谢产物(RCC)，最终产物是原初突光叶绿素降解产物(primer fluorescent Chl catabolite, pFCC),它是有突光的四卩比咯线性分子。然后PFCC被运出叶绿体，其C (82)位被羟基化并运送入液泡。在液泡里因为 PH值偏酸性，修饰过的FCCs的D环和次甲基桥上发生非酶催化的异构，最后生成叶绿素最终代谢产物非突光叶绿素代谢产物(non- fluorescent Chl catabolite, NCCs)。叶绿素降解途径中的许多酶都已经被发现。CRN1/PPH基因是最近通过突变体阻断分析的方法，在拟南芥和水稻中被鉴定出来与叶片叶绿素降解代谢途径相关的一个关键基因，该基因突变之后，突变体植株叶片叶绿素降解过程基本被阻断[Ren G, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 52(5):496-504, 2010; Silvia Schelbert, et al. The Plant Cell, 21: 767 - 785,2009; Morita R, et al. Plant Journal 59: 940-952,2009]。
竹类植物是禾本科(Ggramineae)竹亚科(Bambusoideae)植物的总称，是重要的森林资源，主要分布于热带和亚热带地区，在温带和寒温带也有少量分布。中国是亚洲竹子的分布中心，是竹子种类最丰富、分布最广的国家，不论是竹林面积、竹种数量、竹笋和竹材产量均居世界首位，被誉为“竹子王国”。竹类植物因其开花周期长，难以预测且开花后植株通常死亡，所以难以运用传统的杂交方法进行育种。转基因技术在竹类植物育种中则越来越体现出其无可比拟的优越性。但是，目前为止竹类植物可利用的基因资源还非常的少。因此，运用最新的分子生物学手段，挖掘可运用于竹类植物遗传改良的基因资源显得越来越为重要。
本发明通过RACE-PCR的方法从一种重要的观赏竹-金丝慈竹(Bambusa emeiensis ‘Viridif lavus’ )中分离到了一个可用于改良竹类植物绿色性状的基因， BeCRNl，该基因可用于竹类植物叶绿素降解的分子机制研究，并可用于观赏竹类植物色泽性状改良。发明内容
本发明的目的是提供一种金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白，是具有SEQ ID NO. 2所不氣基酸残基序列的蛋白质。
金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白的编码基因，是下列核苷酸之一I)SEQ ID NO. I所示的DNA序列。
2)编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
SEQ ID NO. I由1646个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第46位至1518位碱基；SEQ ID NO. 2由490个氨基酸残基组成。
本发明还包括含有本发明基因的表达载体和细胞系。
本发明还包括上述基因在金丝慈竹滞绿研究中的应用，以及在竹类植物叶绿素降解途径中的应用。
图IBeCRNl基因保守区域I RT-PCR产物电泳图。
图2BeCRNl基因保守区域2 RT-PCR产物电泳图。
图3BeCRNl基因保守区域3 RT-PCR产物电泳图。
图4BeCRNl基因3’ RACE产物电泳图。
图5BeCRNl基因5’ RACE产物电泳图。
图6BeCRNl基因全长电泳图。
图7BeCRNl与其他物种来源的CRNl的进化树分析及多重序列比较。
图8BeCRNl互补拟南芥突变体cr/ 7表型分析图。其中，a，黑暗处理4天后的各植株离体叶片表型；b，a中叶片及的表达量。Col-0，野生型拟南芥；0X_1，0X_3，0X-6， OX-7, OX-9 和 OX-16, BeCRNl 转基因植株。
具体实施方式
实施例I、金丝慈竹叶绿素降解代谢调控相关蛋白编码基因ifeOW/的获得。
I. I RNA 提取。
取衰老的金丝慈竹叶片材料约0. lg。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管， 加Iml TRIzol ( invitrogen公司)，混勻后，室温放置15分钟,加0. 2ml氯仿异戍醇 (24:1),剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀， 室温干燥15分钟。溶解于适量的经0. 1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备用。
1.2 cDNA第一链合成和反转录PCR。
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2呢制备的总RNA，0. 5W Rnase inhibitor,加DEPC处理过的去离子水至 8. 5Ml, 2Ml 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C , 5min, 室温放置 IOmin, 13000rpm 简短离心 5s。再依次加入 4Ml 5 X First-Strand buffer, 0. 5M-1 RNase Inhibitor, 2M-1 IOOmM DTT, 2M-I dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37°C反转录I小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心5秒钟，存放于_20°C 待用1.3及基因三段保守片段的获得。
1.3.1 ifeOW基因第一段保守片段的获得。
以金丝慈竹cDNA第一链作为RT-PCR的模板，设计了两条引物CRNlFl和CRNlRl 作为RT-PCR-I反应的引物。
CRNlFl :5’_ TGAACCAGTTTATATTGTGGGGAA- 3’ (SEQ ID NO 3)CRNlRl :5’ -CCAAATAGGTCTAACCCAAGGATC-3’ (SEQ ID NO 4)RT-PCR反应体系如下(50W体系)
权利要求
1.一种金丝慈竹叶绿素降解代谢调控相关蛋白，其特征在于为SEQ ID NO. 2所示氨基酸残基序列的蛋白质，记为BeCRNl。
2.金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白BeCRNl编码基因，其特征在于其DNA序列为SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或者为编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于该基因的编码框为自5’端第46位到第 1518位碱基的DNA序列。
4.含有如权利要求2或3所述金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白BeCRNl的编码基因的表达载体。
5.含有如权利要求2或3所述金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白BeCRNl的编码基因的细胞系。
6.如权利要求2或3所述金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白的编码基因在竹类植物绿色性状改良中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开一种金丝慈竹叶绿素降解代谢途径相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的叶绿素降解代谢相关蛋白，来源于金丝慈竹。蛋白名称为BeCRN1,其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。金丝慈竹叶绿素降解代谢相关蛋白BeCRN1的编码基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，或者为编码SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明的基因可用于金丝慈竹叶绿素降解分子机制研究，并用于观赏竹类植物色泽性状改良，包括改善观赏竹类植物绿色性状等。
文档编号C07K14/415GK102532293SQ201210043769
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月26日 优先权日2012年2月26日
发明者丁雨龙, 曹慧敏, 胡佩, 魏强 申请人:南京林业大学