专利名称：一种青霉素酰化酶拆分生产手性氨基酸的方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及一种利用青霉素酰化酶拆分生产手性氨基酸的方法及其产品。
背景技术：
非天然氨基酸在医药开发中作用越来越大。目前新药开发对手性纯度的要求越来越高，很多要求手性含量要达到99. 9%。非天然氨基酸的生产工艺有化学拆分和酶法拆分两种工艺，其中酶法拆分因为条件温和，特异性强，污染小，较化学拆分具有明显的优势。无 论化学拆分和酶法拆分，手性含量都是衡量拆分工艺的优劣的主要考虑因素。青霉素酰化酶拆分生产非天然氨基酸是近来的研究热点，可以用来拆分ALFA-氨基酸和BETA-氨基酸，是酶法拆分非天然氨基酸的最主要工艺，尤其是用于BETA-氨基酸的拆分。使用的青霉素酰化酶有固定化的青霉素酰化酶和游离的青霉素酰化酶两种形式。工艺过程主要是两步第一步氨基酸在溶剂和碱性环境下与苯乙酰氯反应，氨基酸经过酰化成为N-DL-苯乙酰氨基酸，然后用酸调节体系到酸性降温后分离出-N-DL-苯乙酰化-氨基酸；第二步为拆分反应，将上述得到的N-DL-乙酰化-氨基酸制备成溶液，然后加入青霉素酰化酶，拆分反应后得到L-氨基酸或者D-氨基酸。研究发现，一般青霉素酰化酶拆分制备手性氨基酸的工艺中，拆分后的氨基酸手性含量受两个因素控制，一个是拆分用的苯乙酰化-DL-氨基酸的含量，一般苯乙酰化-DL-氨基酸，都含有一定量的未反应原料DL-氨基酸；另外，在调酸结晶过程中，酸也会使部分的苯乙酰化-DL-氨基酸水解成为DL-氨基酸；这样含有DL-氨基酸的苯乙酰化-DL-氨基酸拆分后，不可避免的产物中同时存在一定量的D型或者L-型氨基酸；这样都影响拆分后氨基酸的手性含量。另外一个因素是青霉素酰化酶的特异性以及拆分后因为加热和pH值变化引起的消旋作用。拆分后，要经过较长时间的高温脱色、高温浓缩和结晶过程，这些因素都会导致手性含量的降低，一般情况下，这个过程会导致手性含量降低O. I 3%个百分点。如果不经过精制，一般酶拆分后的氨基酸手性含量在90% 99. 5%，难以达到99. 9%。同时，一般都希望经过酶法工艺，同时得到D-型和L-型的两个手性氨基酸，一般情况下，N-苯乙酰基-DL-氨基酸经过青霉素酰化酶拆分后，产物为L-氨基酸和N-苯乙酰基-D-氨基酸，如果反应不彻底，尽管L-氨基酸的手性含量可以较高，但是N-苯乙酰基-D-氨基酸的手性含量则不会很高，因此水解后得到的D-氨基酸的手性含量会较低。如黄冠华在《合成化学》(Vol 15，2007，P69-72)中的研究，用固定化青霉素酰化酶拆分出来的D-苯丙氨酸手性含量为91.4%。又如李天童在《精细化工》(Vol 15，11，2008，P1066-1069)中用固定化青霉素酰化酶拆分生产D-丙氨酸，D-丙氨酸的光学纯度为95. 3%。其他文献记载的生产工艺，手性含量最高也仅仅达到99%，无法达到99. 9%以上。因此如果要求一个工艺同时得到两个手性含量高的产品，则必须研究提高氨基酸手性含量的方式
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的青霉素酰化酶拆分生产工艺，制备的手性氨基酸手性含量较为低下的缺陷，提供一种新的青霉素酰化酶拆分生产手性氨基酸的方法，该方法包括对中间产物N-DL-苯乙酰化-氨基酸进行离子交换树脂精制，以及最终产品氨基酸的高温重结晶步骤。通过该方法制备得到的最终产品手性含量很高，能够达到99. 9%。本发明同时提供利用该方法所制备的产品。
本发明人为了提高利用青霉素酰化酶拆分制备工艺生产的非天然氨基酸的手性含量，分别对酰化工艺、拆分工艺和手性氨基酸的重结晶工艺进行了大量研究和改进。发明人惊喜地发现通过对常规青霉素酰化酶拆分制备氨基酸工艺乙酰化中间产物进行离子交换树脂精制，以及对最终产品氨基酸的醇溶剂进行高温重结晶，可以使最终产品氨基酸的手性含量显著提高，达到99. 9 %，从而完成了本发明。因此，本发明解决上述技术问题的技术方案如下。本发明采取的技术方案之一是一种青霉素酰化酶拆分生产手性氨基酸的方法，其中包括以下步骤(I)在水中，在NaOH作用下，DL-氨基酸与苯乙酰氯进行乙酰化反应，将所得反应溶液的PH值调节到O. 5 2. 0，过滤回收N-DL-苯乙酰化-氨基酸固体，加水溶解；(2)向步骤(I)所得溶液中加入阳离子交换树脂进行吸附反应，然后过滤收集滤液即N-DL-苯乙酰化-氨基酸溶液；(3)将步骤⑵所得滤液的pH值调节到7. 5 8. 0，加入青霉素酰化酶进行酶促拆分反应，将所得反应溶液去除青霉素酰化酶后浓缩，加入醇类溶剂降温结晶，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的一种或几种，过滤回收固体，即得L-氨基酸，收集滤液；(4)将步骤(3)所得的滤液浓缩后调节pH值到O. 5 2.0，过滤回收固体即N-苯乙酰基-D-氨基酸，该固体中加入酸进行水解反应，将水解产物浓缩，结晶，过滤回收固体，即得D-氨基酸；(5)将步骤(3)或⑷所得L-氨基酸或D-氨基酸加入到温度为60 70°C的醇类溶剂中，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的一种或几种，加入至过饱和状态，然后将该溶液降温结晶，过滤回收固体产物即可。本发明所述方法步骤(I)是在水中，在NaOH作用下，DL-氨基酸与苯乙酰氯进行乙酰化反应，将所得反应溶液的PH值调节到O. 5 2. O,过滤回收N-DL-苯乙酰化-氨基酸固体，加水溶解。其中所述DL-氨基酸是外消旋氨基酸，即L型与D型氨基酸各占一半，旋光度为零的氨基酸。本发明所述DL-氨基酸较佳地选自DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸、DL-谷氨酸、DL-天冬氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-苯甘氨酸、DL-纟颜氨酸、DL-売氨酸、DL-赖氨酸、DL-鸟氨酸、DL-叔亮氨酸、DL-对氟苯甘氨酸和DL-邻氯苯甘氨酸中的一种或几种。其中所述NaOH，可选自苛性钠、烧碱、离子膜烧碱、氢氧化钠溶液和液碱中的一种或几种，更佳地采用片碱和氢氧化钠溶液。其中所述DL-氨基酸与NaOH的摩尔比较佳地是I : I I : 4，更佳地摩尔比为I : I。N-DL-苯乙酰氨基酸粗品中加入的水量以使苯乙酰化的DL-氨基酸能够充分溶解为准，并适当过量，更佳地为加入质量比2 10倍水进行溶解。本发明所述方法步骤(2)是向步骤(I)所得溶液中加入阳离子交换树脂进行吸附反应，然后过滤收集滤液即N-DL-苯乙酰化-氨基酸溶液。其中阳离子交换树脂用量一般按照摩尔交换容量计算，根据检测的游离的氨基酸含量对应加入酸性阳离子交换树脂，较佳地阳离子交换树脂加入量是游离的氨基酸理论量的I倍以上，更佳地，本发明所述的阳离子交换树脂交换量摩尔数量是游离氨基酸摩尔数量的I. 5 5倍。本发明所述阳离子交换树脂吸附反应时间较佳地为吸附反应完全后停止，即所得滤液经薄层层析(TLC)检测，溶液中不能检出游离氨基酸时为止，吸附反应时间更佳地为I 30分钟。本发明所述阳离子交换树脂较佳地选自强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂和大孔阳离子交换树脂中的一种或几种；更佳地采用强酸性阳离子大孔树脂。本发明所述方法步骤(3)是将步骤(2)所得滤液的pH值调节到7. 5 8. 0，加入青 霉素酰化酶进行酶促拆分反应，将所得反应溶液去除青霉素酰化酶后浓缩，加入醇类溶剂降温结晶，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的一种或几种，过滤回收固体，即得L-氨基酸，收集滤液。本发明所述的青霉素酰化酶是指用于催化青霉素的侧链与母核之间的酰胺键的水解反应，以获得青霉素母核6-APA(6-氨基青霉烷酸)的一类酶，该酶可应用于合成手性肽，手性拆分等。所述青霉素酰化酶根据酶的底物专一性包括青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶和氨苄青霉素酰化酶。较佳地，本发明所述技术方案采用固定化青霉素酰化酶。所述固定化青霉素酰化酶的用量根据青霉素酰化酶对不同氨基酸的比活力确定，一般用量是24小时内可以转化完毕的理论量的2 5倍。考虑到拆分的彻底性，上述的拆分的时间较佳的为12 48小时，更佳地是24小时。所述固定化青霉素酰化酶拆分反应温度较佳地为25 40°C，更佳的反应温度是30°C。其中固定化青霉素酰化酶拆分反应较佳地PH值为7. O 8. O,更佳的pH值为7. 5，可以通过在反应液中加入片碱维持。所述的醇类试剂较佳地选自甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的一种或几种，更佳的醇类溶剂是乙醇。本发明所述方法步骤(4)是将步骤(3)所得的滤液浓缩后调节pH值到O. 5 2. O,过滤回收固体即N-苯乙酰基-D-氨基酸，该固体中加入酸进行水解反应，将水解产物浓缩，结晶，过滤回收固体，即得D-氨基酸。其中所述的浓缩步骤较佳地方法是将所得的滤液浓缩至浓缩液出现固体后停止浓缩，按照剩余浓缩液体积的一倍补水，然后再浓缩至浓缩液出现固体后停止浓缩。其中所述的酸较佳的是盐酸，更佳地是10倍体积的2N盐酸。本发明所述方法步骤(5)是将步骤(3)或⑷所得L-氨基酸或D-氨基酸加入到温度为60 70°C的醇类溶剂中，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的一种或几种，加入至过饱和状态，然后将该溶液降温结晶，过滤回收固体产物即可。其中所述醇溶剂较佳地选自甲醇，乙醇，乙二醇中的一种或几种，更佳地醇类溶剂是甲醇。所述醇溶剂较佳的温度为60 70°C，所述甲醇溶剂的更佳的地温度是66°C;所述结晶温度较佳地为45 60°C，结晶温度更佳地是55 60°C。本发明采取的技术方案之二是通过上述方法制备的手性氨基酸产品。其中所述氨基酸最终产品的手性含量较佳地是99. 9%。本发明采取的技术方案之三是上述手性氨基酸产品在制备手性药物中的应用。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明通过对现有青霉素酰化酶拆分制备工艺中间产物对苯乙酰基氨基酸进行了离子交换树脂吸附和最终产品氨基酸醇类溶剂高温重结晶，并经过两道工序联用，使最终产品氨基酸手性含量显著提高，达到99. 9%以上。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“常温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。所用原料的来源和设备的名称规格为固定化青霉素酰化酶IPA2-750 (酶活100 130U · g—1):湖南福来格公司；
阳离子交换树脂购自国药试剂公司。实施例I在130ml去离子水中加入DL-2-苯丙氨酸16. 5克(O. Imol)和片碱4. O克(O. Imol)，(TC同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和6. 5mol/L NaOH水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h常温搅拌3h，滴加2. Omol/L盐酸，至溶液pH = 3，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-2-苯丙氨酸26. O克，经HPLC分析，含量为98. 6%。在锥形瓶中加入去离子水IOOOmL,加入N-苯乙酰基-DL-2-苯丙氨酸28. 3g，用片碱调整pH到7. 5，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750 (酶活100 130U g—1，湖南福来格公司)I. 0g，于30°C拆分反应，同时用片碱维持pH为7. 5，24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-苯丙氨酸8克，经手性HPLC分析，手性EE为98. 4%。滤液继续浓缩至浓缩液出现固体后停止浓缩，按照剩余浓缩液体积的一倍补水再浓缩至浓缩液出现固体后停止浓缩，冷却后调PH2. O过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-2-苯丙氨酸12克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-2-苯丙氨酸7. I克，经过分析，手性含量为91.5%。实施例2在130ml去离子水中加入DL-3-苯丙氨酸16. 5克(0. Imol)和片碱4. O克(0. Imol)，(TC同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和6. 5mol/L NaOH水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. 0mol/L盐酸，至溶液pH = 3. 0，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-3-苯丙氨酸25. 5克，经HPLC分析，含量为98. 5%。在锥形瓶中加入去离子水IOOOmL,加入N-苯乙酰基-DL-3-苯丙氨酸28. 3g，用片碱调整pH到7. 5，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g_S湖南福来格公司)I. Og,于30°C拆分反应，同时用片碱维持pH为7. 5，24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶过滤，得到L-3-苯丙氨酸7. 9克，经分析，手性EE为
98.4%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH2. O,过滤，干燥得到N-苯乙酰基_D_3_苯丙氨酸12. I克，加入10倍体积2N盐酸水解,浓缩，结晶，过滤,干燥,得到D-3-苯丙氨酸7. 2克，经过分析，手性含量为92. 5%。实施例3在130ml去离子水中加入DL-2-苯丙氨酸16. 5克(0. Imol)和片碱4. O克(0. Imol)，(TC 同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和 6. 5mol/L NaOH 水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. Omol/L盐酸，至溶液pH = 3，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-2-苯丙氨酸26. O克，加入2000ml水，然后加入2克强酸性阳离子交换树脂，搅拌2分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整pH到7. 5，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g_\湖南福来格公司)I. 0g，于30°C拆分反应，同时用片碱维持pH为7. 5，24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤得到L-苯丙氨酸7. 5克，经分析，手性EE为99. 4%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH2. O,过滤，干燥得到N-苯乙酸基-D-2-苯丙氨酸12. I克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-2-苯丙氨酸7. I克，经过分析，手性含量为92. 5%。
实施例4在130ml去离子水中加入DL-3-苯丙氨酸16. 5克(O. Imol)和片碱4. O克(O. Imol)，(TC同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和6. 5mol/L NaOH水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. Omol/L盐酸，至溶液pH = 3，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-3-苯丙氨酸25. 5克，加入2000ml水，然后加入2克弱酸性阳离子交换树月旨(购自国药集团试剂公司)，搅拌2分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整pH到7. 5，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 lSOU^g—1，湖南福来格公司)1.0g，于30°C拆分反应，同时用片碱维持PH为7. 5，24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-3-苯丙氨酸7. 8克，经分析，手性EE为99. 3%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调PH2. O,过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-3-苯丙氨酸12. O克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-3-苯丙氨酸7. 2克，经过分析，手性含量为94. 5%。实施例5在130ml去离子水中加入DL-2-苯丙氨酸16. 5克(0. Imol)和片碱4. O克(0. Imol)，(TC同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和6. 5mol/L NaOH水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. 0mol/L盐酸，至溶液pH = 3，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-2-苯丙氨酸26. O克，加入2000ml水，然后加入2克强酸性阳离子交换树月旨，搅拌2分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整pH到7. 5，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g_\湖南福来格公司)I. 0g，于30°C拆分反应，同时用片碱维持pH7. 5，24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-苯丙氨酸7. 5克，经分析，手性EE为99. 4% ;以上L-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流660C，保留10分钟，然后降温到58°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. 4克L-苯丙氨酸，光学纯度99. 9%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH2. 0，过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-2-苯丙氨酸12. I克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-2-苯丙氨酸7. I克，经过分析，手性含量为92. 5%。以上D-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流66°C，保留10分钟，然后降温到58°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到6. 7克，光学纯度99. 9 %。实施例6在130ml去离子水中加入DL-3-苯丙氨酸16. 5克(0. Imol)和片碱4. O克(0. Imol)，(TC同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和6. 5mol/L NaOH水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. 0mol/L盐酸，至溶液pH = 2. 0，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-3-苯丙氨酸25. 5克，加入2000ml水，然后加入2克弱酸性阳离子交换树脂，搅拌2分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整pH到7. 5，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g_\湖南福来格公司)I. 0g，于30°C拆分反应，同时用片碱维持PH为7. 5，24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-3-苯丙氨酸7. 8克，经分析，手性EE为99. 3% ;以上L-3-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流66°C，保留10分钟，然后降温到55°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. 7克，光学纯度99. 9%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH2. O,过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-3-苯丙氨酸12. O克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-3-苯丙氨酸7. 2克，经过分析，手性含量为94. 5 %。以上D-3-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流70°C，保留10分钟，然后降温到58°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. I克，光学纯度99.9%。实施例7以DL-叔亮氨酸为原料用例I的工艺实施，苯乙酰化后，测定含量为98. 5% ;手性拆分后，L-叔亮氨酸光学纯度为98. 6%, D-叔亮氨酸光学纯度为98. 2%。实施例8以DL-叔亮氨酸为原料用例3的工艺实施，苯乙酰化后，强酸性大孔阳离子交换树脂精制，拆分后，L-叔亮氨酸光学纯度为99. I%，D-叔亮氨酸光学纯度为98. 8%。实施例9以DL-叔亮氨酸为原料用例5的工艺实施，苯乙酰化后，弱酸性大孔阳离子交换树脂精制，乙醇高温重结晶后，L-叔亮氨酸光学纯度为99. 9%，D-叔亮氨酸光学纯度为
99.9%。实施例10在130ml去离子水中加入DL-3-苯丙氨酸16. 5克(O. Imol)和片碱16.0克(0.4mOl)，0°C 同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和 6. 5mol/L NaOH 水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. Omol/L盐酸，至溶液pH = O. 5，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-3-苯丙氨酸25. 5克，加入50ml水，然后加入2克弱酸性阳离子交换树脂，搅拌I分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整PH到8.0，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g_\湖南福来格公司)I. 0g，于30°C拆分反应，同时用片碱维持PH为8. O, 24小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-3-苯丙氨酸7. 8克，经分析，手性EE为99. 3% ;以上L-3-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流60°C，保留10分钟，然后降温到45°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. 7克，光学纯度99. 9%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH为0. 5，过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-3-苯丙氨酸12. O克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-3-苯丙氨酸7. 2克，经过分析，手性含量为94. 5%。以上D-3-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流66°C，保留10分钟，然后降温到60°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. I克，光学纯度99.9%。实施例11 在130ml去离子水中加入DL-2-苯丙氨酸16. 5克(0. Imol)和片碱4. O克(0. Imol)，(TC同时滴加苯乙酰氯(5mL，0. llmol)和6. 5mol/L NaOH水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. Omol/L盐酸，至溶液pH = I. 5，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-2-苯丙氨酸26. O克，加入2000ml水，然后加入2克强酸性阳离子交换树脂，搅拌30分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整pH到7. 0，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g_\湖南福来格公司)I. 0g，于25°C拆分反应，同时用片碱维持PH为7. 5，12小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-苯丙氨酸7. 5克，经分析，手性EE为99. 4% ;以上L-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流66°C，保留10分钟，然后降温到58°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. 4克，光学纯度99. 9%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH2. 0，过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-2-苯丙氨酸12. I克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-2-苯丙氨酸7. I克，经过分析，手性含量为92. 5 %。以上D-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流66°C，保留10分钟，然后降温到58°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到 6. 7克，光学纯度99.9%。实施例12在130ml去离子水中加入DL-3-苯丙氨酸16. 5克(O. Imol)和片碱8. O克(O. 2mol)，0°C 同时滴加苯乙酰氯(15mL，0. llmol)和 6. 5mol/L NaOH 水溶液(30mL)，滴加完全后，搅拌2h，常温搅拌3h，滴加2. Omol/L盐酸，至溶液pH = 2. 0，过滤干燥，得白色粉状固体N-苯乙酰基-DL-3-苯丙氨酸25. 5克，加入50ml水，然后加入2克弱酸性阳离子交换树脂，搅拌25分钟，过滤去掉树脂，然后用片碱调整到pH7. 0，然后加入固定化青霉素酰化酶IPA2-750(酶活100 130U · g—1，湖南福来格公司)I. 0g，于40°C拆分反应，同时用片碱维持PH为8. 0,48小时后滤除IPA2750，然后浓缩至300ML，加入乙醇冷却结晶，过滤，得到L-3-苯丙氨酸7. 8克，经分析，手性EE为99. 3% ;以上L-3-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流60°C，保留10分钟，然后降温到45°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. 7克，光学纯度99. 9%。滤液继续浓缩至小体积，补水再浓缩一次，冷却后调pH为0. 5，过滤，干燥得到N-苯乙酰基-D-3-苯丙氨酸12. O克，加入10倍体积2N盐酸水解，浓缩，结晶，过滤，干燥，得到D-3-苯丙氨酸7. 2克，经过分析，手性含量为94. 5%。以上D-3-苯丙氨酸，加入20倍甲醇，加热到回流66°C，保留10分钟，然后降温到60°C，保持5分钟，保持此温度过滤，得到7. I克，光学纯度99.9%。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种青霉素酰化酶拆分生产手性氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)在水中，在NaOH作用下，DL-氨基酸与苯こ酰氯进行こ酰化反应，将所得反应溶液的PH值调节到0. 5 2. 0，过滤回收N-DL-苯こ酰化-氨基酸固体，加水溶解； (2)向步骤(I)所得溶液中加入阳离子交換树脂进行吸附反应，然后过滤收集滤液即N-DL-苯こ酰化-氨基酸溶液； (3)将步骤(2)所得滤液的pH值调节到7.5 8. 0，加入青霉素酰化酶进行酶促拆分反应，将所得反应溶液去除青霉素酰化酶后浓缩，加入醇类溶剂降温结晶，所述醇类溶剂选自甲醇、こ醇、こニ醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的ー种或几种，过滤回收固体，即得L-氨基酸，收集滤液； (4)将步骤(3)所得的滤液浓缩后调节pH值到0.5 2.0，过滤回收固体即N-苯こ酰基-D-氨基酸，该固体中加入酸进行水解反应，将水解产物浓缩，結晶，过滤回收固体，即得D-氨基酸； (5)将步骤(3)或(4)所得L-氨基酸或D-氨基酸加入到温度为60 70°C的醇类溶剂中，所述醇类溶剂选自甲醇、こ醇、こニ醇、正丙醇、异丙醇和丁醇中的ー种或几种，加入至过饱和状态，然后将该溶液降温结晶，过滤回收固体产物即可。
2.如权利要求I所述方法，其特征在于，步骤(I)所述DL-氨基酸选自DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸、DL-谷氨酸、DL-天冬氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-苯甘氨酸、DL-纟颜氨酸、DL-売氨酸、DL-赖氨酸、DL-鸟氨酸、DL-叔亮氨酸、DL-对氟苯甘氨酸和DL-邻氯苯甘氨酸中的一种或几种。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述DL-氨基酸与NaOH的摩尔比是I : I I : 4，所述溶解步骤是将N-DL-苯こ酰化-氨基酸固体溶解于质量比为2 .10倍的水中。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述阳离子交换树脂选自强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂和大孔阳离子交换树脂中的ー种或几种，所述的阳离子交换树脂用量为水溶液中游离氨基酸量的I. 5 5倍(摩尔比)。
5.权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述阳离子树脂吸附反应的时间为I 30分钟。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述青霉素酰化酶是固定化青霉素酰化酶，所述酶促拆分反应的时间为12 48小时，拆分反应的温度为25 40°C，拆分反应的pH值为7.0 8. O。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述浓缩步骤是二次浓缩将所得的滤液浓缩至出现固体后停止浓缩，按照剰余浓缩液体积的一倍补水，然后再浓缩至浓缩液出现固体后停止浓缩，其中所述加入酸进行水解反应是加入盐酸进行水解反应。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述结晶温度为45 60°C。
9.如权利要求I 8任一项所述方法制备的手性氨基酸产品。
10.如权利要求9所述手性氨基酸产品在制备手性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种青霉素酰化酶拆分生产手性氨基酸的方法，包括以下步骤在水中和NaOH作用下，DL-氨基酸与苯乙酰氯进行乙酰化反应，将溶液pH值调到0.5～2.0，过滤回收N-DL-苯乙酰化-氨基酸固体，溶于水后，加入阳离子交换树脂进行吸附反应，将该溶液的pH值调节到7.5～8.0，加入青霉素酰化酶进行酶促拆分反应，得到L-氨基酸或D-氨基酸固体。将氨基酸产物加入60～70℃的醇类溶剂中至过饱和状态，降温结晶，过滤回收固体产物即可。通过对现有工艺中间产物对苯乙酰基氨基酸进行离子交换树脂吸附和终产品氨基酸醇溶剂高温重结晶，以及两道工序联用，使终产品氨基酸手性含量显著提高，达到99.9％以上。
文档编号C07C229/08GK102628075SQ20121004444
公开日2012年8月8日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者元波, 冀鹏飞, 李莉, 杨召鹏, 马士忠, 马道功 申请人:上海瀚鸿化工科技有限公司