专利名称：Krt84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及KRT84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用。
背景技术：
类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis, RA)是一种自身免疫性疾病。临床上通过检测自身免疫抗体存在和表达水平的方法为RA诊断提供依据。常用于RA检测的自我免疫抗体包括类风湿因子(rheumatoid factor, RF)、抗聚角蛋白微丝蛋白(anti fiIaggrin autoantibody, AFA)、抗角蛋白(anti keratin antibody, AKA)、抗细胞核周围因子(anti perinuclear factor, APF)和抗波型蛋白(anti vimentin)和抗环状瓜氨酸妝(anti cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP)。但以上 RA 诊断标记物的知识产权全部属于西方发达国家，这些诊断试剂在中国医疗市场上价格昂贵，96人份的检测试剂盒价格在4000-6000元之间。绝大多数RA自身免疫抗体的B细胞决定簇都是瓜氨酸残基。瓜氨酸是人体非自然氨基酸，由蛋白质中的精氨酸经肽基脱亚胺酶催化而成。虽然像聚丝蛋白、纤维蛋白和波型蛋白等瓜氨酸蛋白已经被证实是RA自身免疫抗体的瓜氨酸化蛋白抗原，但到目前为止， 作为RA自身免疫抗原的瓜氨酸化蛋白还没有被系统地研究、筛查。我们应用二维免疫印迹 (2-D western blotting, 2D WB)和蛋白质组学技术对RA瓜氨酸化自身免疫抗原进行系统性研究，计划发现更多的、新的RA瓜氨酸化蛋白抗原，并从中筛选出具有临床检测价值的、 新的RA诊断标记物。
发明内容
针对上述现有技术，本发明筛选出了一种新的诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物-KRT84自我免疫抗体。本发明通过实验研究(二维免疫印迹法、蛋白质组学技术和ELISA技术)发现，RA 患者的血液中抗KRT84自身免疫抗体表达水平比正常人明显增高，因此，抗KRT84自我免疫抗体可以作为RA的诊断标记物。应用时，以ELISA技术、胶体金试纸等常见的抗原、抗体特异性结合的免疫化学方法均可以用于检测KRT84自我免疫抗体。
图I :用二维免疫印迹法筛选新型的自身免疫抗原设计原理图。图2 :RA滑膜蛋白的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和二维western blotting ;从 RA滑膜组织中提取总蛋白进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行考马斯亮蓝染色(A，B)，将胶上的滑膜蛋白通过湿转法转移到PVDF膜上，用纯化的RA患者血清(C)或抗瓜氨酸抗体 (D)进行免疫，最后运用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪进行质谱鉴定蛋白点。
图3 :滑膜组织中候选蛋白进行WB实验分析，AlAT (A)、TBB⑶和KRT84 (C)在RA 或OA患者的滑膜组织中表达,用抗GAPDH抗体免疫杂交作为标准内参,箭头标记出分子量大小。图4 :运用ELISA法检测RA患者的血液中自身免疫抗体抗AlAT (A)、TBB(B)和 KRT84(C)的表达水平，在405nm检测OD值。以健康组样本作为对照，自身免疫抗体抗KRT84 在RA血液中具有显著性高表达。
具体实施例方式下面结合实验对本发明作进一步的说明。实验一、设计原理RA的组织病理学特征是关节滑膜炎症、增生，并在自我免疫抗原的刺激下由B细胞簇分泌大量自我免疫抗体。我们首先用双向凝胶电泳对RA滑膜总蛋白进行分离，然后将蛋白转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，随之分别用纯化的RA患者血清和抗瓜氨酸抗体作为探针进行杂交。瓜氨酸化抗体和RA患者血液中都识别的蛋白被认为是RA瓜氨酸化自我免疫抗原。最后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪对RA瓜氨酸化自我免疫抗原进行分析鉴定，决定这些蛋白到底是哪些蛋白。对上述实验设计的解释见图I :做两套(每套两块A和B、C和D)相同的双向凝胶电泳图，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后分别用纯化的RA患者血清和抗瓜氨酸抗体对上述两套胶的其中一块分别进行免疫杂交。将二维western blotting结果与同套胶的另一块对比每套两块(A和B、C和D)，确定与免疫信号对应的蛋白点。将RA患者血清和抗瓜氨酸抗体都识别的那些蛋白点挖出，用通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行分析鉴定。被RA患者血清和抗瓜氨酸抗体免疫都识别的蛋白点被认为是RA瓜氨酸化蛋白自身免疫抗原。二、发现过程和数据本研究将RA滑膜组织中提取的总蛋白用2-D凝胶电泳分离，每张2-D电泳凝胶上呈现约300个蛋白质点(见图2)。通过比较二维电泳图谱和免疫印迹图谱，用RA患者血清或抗瓜氨酸抗体杂交获得的特异蛋白点从双向电泳图谱上取下来后进行质谱鉴定。用RA 患者血清作为探针的2D WB结果与双向电泳图谱质谱鉴定比较，筛选出37个差异蛋白点。 同时，用抗瓜氨酸抗体作为探针的2D WB结果与双向电泳图谱质谱鉴定比较，筛选出45个差异蛋白点。在这些蛋白点中，其中有12个蛋白点是RA患者血清和抗瓜氨酸抗体共同鉴定出相同的点。这些点分别是α I抗胰蛋白酶(Alpha-l-antitrypsin,AlAT)、动力蛋白重 Iil 3 (dynein heavy chain3, DYH3)、纤维蛋白原 B β 链(fibrinogen beta chain, FIBB)、 角蛋白 84(keratin type IIcuticular Hb4, KRT84)、基膜聚醣(lumican, LUM)、微管蛋白 β _2A 链(tubulin beta_2Achain, TBB2A)、微管蛋白 β _2B 链(tubulin beta_2Bchain, TBB2B)、微管蛋白 β-2。链(tubulin beta_2Cchain，TBB2C)、微管蛋白 β-3 链(tubulin beta_3chain, TBB3)、微管蛋白 β-4 链(tubulin beta_4chain, TBB4)、微管蛋白 β-5 链 (tubulin beta_5chain,TBB5)和波型蛋白(vimentin, VIME)。见表 I。实验结果重复 3 次。表I获得特异蛋白点
权利要求
1.KRT84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用。
2.KRT84蛋白作为诊断、检测类风湿性关节炎的检测物的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述KRT84蛋白的氨基酸序列为=ESYITN LRRQLEVLVSDQARLQAERNHLQDVLEGFKKKYEEEVVCRANAE，如序列表 I 所示。
全文摘要
本发明公开了KRT84自我免疫抗体作为诊断、检测类风湿性关节炎的诊断标记物的应用。本发明通过实验研究(二维免疫印迹法、蛋白质组学技术和ELISA技术)发现，RA患者的血液中抗KRT84自身免疫抗体表达水平比正常人明显增高，因此，抗KRT84自我免疫抗体可以作为RA的诊断标记物。应用时，以ELISA技术、胶体金试纸等常见的抗原、抗体特异性结合的免疫化学方法均可以用于检测KRT84自我免疫抗体。
文档编号C07K14/47GK102590530SQ20121005355
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者孟红, 常晓天 申请人:孟红, 常晓天