专利名称：一种分离环磷腺苷的方法
技术领域：
本发明属于生物分离领域，具体涉及利用一种新型吸附剂分离环磷腺苷的方法。
背景技术：
环磷腺苷，又名3’，5’ -环磷酸腺苷，简称cAMP，是生物体内一种重要的生理活性物质，具有调节生物体内多种酶催化反应的功能，是细胞内的第二信使。其主要的生理功能有促进心肌收缩，舒张平滑肌、扩张冠状动脉血管、改善肝功能、促进神经再生，抑制皮肤外层上皮细胞分裂及转化异常细胞的功能、促进呼吸链氧化酶的活性及改善心肌缺氧等，对人体的正常代谢起着重要作用。cAMP主要有三种生产方法，即化学合成、天然产物提取和微生物发酵。其生产过程 中的分离步骤主要应用了大孔树脂、阳离子交换树脂和阴离子交换树脂三种吸附剂。专利(TW200922612)公开了一种以含大枣cAMP的原料制备药物或保健食品的方法。其中大枣中cAMP主要是通过大孔树脂0U-2和ME-2两柱连续吸附分离获得的，最终得到萃取物中cAMP的含量为I %，说明大孔树脂作为吸附剂分离cAMP效率极低。而在2000年出版的《最新生化药物制备技术》报道在化学合成的环磷腺苷结晶工艺，分离段所使用的是阳离子交换剂，吸附能力较低，分离纯化效果不佳。专利(201010191525. X)提供了一种分离环磷腺苷的方法，其分离过程采用的吸附剂为阴离子交换树脂，每克湿离子交换树脂吸附量可达到O. 08-0. 15g环磷腺苷。该方法大大提高了吸附剂对环磷腺苷的吸附量，提高了分离效率，但此方法却需调节环磷腺苷溶液的PH为碱性。由于环磷腺苷属于有机弱酸，在水溶液中以cAMP和cAMP_的形式共同存在，需要调节溶液pH在6. 5-11的范围内才能全部解离成为cAMP—。cAMP—才能与阴离子交换树脂进行最大量的交换，达到最大吸附量。而当不调节溶液PH时，部分呈分子状态的cAMP不能被交换到阴树脂上，就会造成阴树脂的吸附量降低。传统离子交换树脂再生时采用6-8BV浓度为3% _5%的酸、碱溶液作为再生剂，除此以外还需要4-5BV的水对树脂柱进行冲洗，才能达到树脂柱的再生完全。此传统方法消耗大量的酸、碱和水，易造成环境污染和资源浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种采用螯合吸附介质分离环磷腺苷的方法，有效解决了现有分离技术中存在的吸附剂吸附量低、洗脱及再生过程耗用大量酸、碱、水的问题。为解决上述技术问题，本发明采用的思路为环磷腺苷是一种有机弱酸，分子式为CltlH12N5O6P,分子中存在大量的N、O、P原子,原子上的孤对电子可与金属尚子的空轨道相结合，形成配位键，从而使环磷腺苷与金属离子间建立稳定的螯合结构。利用此机理，本发明提供了一种新型吸附介质，即将阳离子交换树脂经转型处理可携带上金属离子，即成为具有螯合功能的新型吸附介质，从而可以吸附环磷腺苷。新型树脂与环磷腺苷的配位螯合过程如图I所示。由于环磷腺苷在溶液中呈现不同解离状态时，其N、O、P原子提供孤对电子的能力不会发生改变，因此，吸附剂对环磷腺苷的吸附能力不随溶液PH发生变化。但考虑到碱性溶液中0H_与螯合树脂上金属离子会形成离子键，因此环磷腺苷体系的pH选择为1-7。此外，碱溶液洗脱时，OH—可与树脂上的金属以强离子键结合，因此用少量低浓度碱溶液即可将配位键破坏，从而使环磷腺苷从树脂上脱离。洗脱完全后用纯水淋洗树脂柱至中性，继续采用4-5BV低浓度酸上柱后用纯水淋洗至中性，即可完成吸附剂的再生。具体的技术方案如下
一种分离环磷腺苷的方法，以新型螯合吸附介质(即转型后的阳离子交换树脂)为吸附剂吸附溶液中的环磷腺苷，再利用碱液作为洗脱剂对吸附剂进行洗脱，收集洗脱液，使用酸液作为再生剂对吸附剂进行再生。其中，所述的新型螯合吸附介质的前体为阳离子交换树脂，所述的阳离子交换树脂以苯乙烯系或丙烯酸系为骨架，以磺酸基、磷酸基或羧基为功能基团；优选以苯乙烯系为骨架，以磺酸基团为功能基团。这些阳离子交换树脂代表性的例子有Amberlite IR_124(骨架为苯乙烯，功能基团为磺酸基)、Amberlite IR-116 (骨架为苯乙烯，功能基团为磺酸基)或Amberlite IRC-84 (骨架为丙烯酸，功能基团为羧基)。其中，所述的新型螯合吸附介质的制备方法，是以无机金属盐水溶液为离子转型齐U，使其与阳离子交换树脂接触，将金属离子以离子键与阳离子交换树脂上的酸性功能基团结合，从而固载到阳离子交换树脂上不会脱落，转型后的阳离子交换树脂的功能基团为金属离子。其中，所述的无机金属盐水溶液中，金属离子为Fe2+、Fe3+、CU2+、Zn2+或Co2+，优选Fe3+、Cu2+或Zn2+ ;无机金属盐浓度为I 50g/L，优选3_20g/L。转型前的阳离子交换树脂对环磷腺苷的吸附量为10-40mg/g湿树脂，转型后的吸附量可达到80-160mg/g湿树脂。阳离子交换树脂具体转型步骤如下(I)称取一定量阳离子交换树脂装柱；(2)将离子转型剂以恒定流速流过树脂柱，直到出口溶液浓度等于进口溶液浓度；(3)将去离子水以恒定流速流过树脂柱，至流出液中无金属离子；(4)用乙醇淋洗树脂柱；(5)在30_60°C下真空干燥步骤(4)得到的树脂，完成转型。根据本发明提供的转型方法，完成转型的新型吸附剂负载的金属离子的量为O. 05-2. OOmmol/g 树脂。其中，环磷腺苷溶液的浓度可以为l_8g/L，上柱流速可以为O. 5_4BV/h。其中，所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，浓度为O. 01 O. 6mol/L，优选O. 1-0. 4mol/L ;碱液用量为2 5BV，优选3-4BV ;洗脱流速为O. 5_3BV/h。其中，所述的酸液为盐酸或硫酸，浓度为O. 01-0. 6mol/L，优选O. 1-0. 4mol/L ;酸液用量为2-5BV，优选3-4BV。其中，再生前，先用去离子水淋洗吸附剂至中性，再生后，再用去离子水淋洗吸附剂至中性后重复使用吸附剂。有益效果本发明提供的方法采用新型螯合吸附介质分离环磷腺苷，与传统树脂分离环磷腺苷相比，本发明的优点是此吸附介质可适用于任何PH1-7条件下的环磷腺苷体系，吸附量可达到80-160mg/g树脂，环磷腺苷浓度可提高4-5倍。且此新型介质洗脱、再生过程酸、碱用量均可节约50%以上，水用量可节约20% -30%，是一种清洁环保、价格低廉、易得的吸附剂。
图I是转型后新型吸附剂(苯乙烯骨架、磺酸基团)对环磷腺苷的配位吸附过程图。图2是不同pH环磷腺苷体系下新型螯合吸附介质对环磷腺苷的吸附量。
图3是实施例5测定的新型吸附剂吸附容量和洗脱收率的变化情况图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。环磷腺苷溶液的制备以下实施例所用的环磷腺苷溶液按如下方法制备得到发酵培养基成分为葡萄糖5% (g/100mL，以下相同)，K2HPO4 I %, KH2PO4 1%,MgSO4 I %，尿素0.5%，蛋白胨0.5%，同时每升培养基中添加O. Ig NaF、0. Ig VBl和5g次
黄嘌呤。种子培养基成分为葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，牛肉膏1%，NaClO. 3%。培养方法将节杆菌A302(CGMCC No. 3584)接入种子培养基，在30°C、240rpm下培养18小时。再以10% (v/v)的接种量接入发酵培养基中，以NaOH控制pH为7.0，溶氧控制为30%，400rpm、3(TC下发酵72小时。放罐时，环磷腺苷产量为3_8g/L。然后将发酵液通过离心机离心除去菌体，再将离心得到的上清液透过超滤膜去除大部分蛋白质，可得到浓度范围在3-8g/L的环磷腺苷溶液。实施例I :称取50g阳离子交换树脂Amberlite IR-124装柱，将浓度为3g/L的氯化铁溶液以lBV/h流过树脂柱，待流出液浓度亦为3g/L时，停止转型。以相同流速继续通入去离子水，至流出液中不含铁离子。最后用乙醇淋洗树脂柱，淋洗完成后，将树脂至于30°C真空干燥箱内真空干燥，完成吸附剂的转型。取20g转型后的吸附剂填充树脂柱，平衡后将浓度为4. 5g/L的环磷腺苷溶液上柱，以3. 5BV/h流过树脂柱，吸附饱和后测定吸附量为126mg/g湿树脂。用O. 4mol/L氢氧化钠进行洗脱，洗脱流速lBV/h，洗脱剂用量为3BV，收集洗脱液，环磷腺苷的浓度为16. 50g/L，纯度为95. 12%，收率98. 48%。实施例2 称取50g阳离子交换树脂Amberlite IR-116装柱，将浓度为10g/L的氯化铜溶液以lBV/h流过树脂柱，待流出液浓度亦为10g/L时，停止转型。以相同流速继续通入去离子水，至流出液中不含铜离子。最后用乙醇淋洗树脂柱，淋洗完成后，将树脂至于40°C真空干燥箱内真空干燥，完成吸附剂的转型。取IOg转型后的吸附剂填充树脂柱，平衡后将浓度为4g/L的环磷腺苷溶液上柱，以2BV/h流过树脂柱，吸附饱和后测定吸附量为85mg/g湿树脂。再用O. 3mol/L氢氧化钠进行洗脱，洗脱流速2BV/h，洗脱剂用量为4BV。收集洗脱液，环磷腺苷浓度为11. 06g/L，纯度为94. 75%，收率97. 67%。实施例3 称取50g阳离子交换树脂Amberlite IR-116装柱，将浓度为15g/L的氯化亚铁溶液以lBV/h流过树脂柱，待流出液浓度亦为15g/L时，停止转型。以相同流速继续通入去离子水，至流出液中不含亚铁离子。最后用乙醇淋洗树脂柱，淋洗完成后，将树脂至于50°C真空干燥箱内真空干燥，完成吸附剂的转型。取30g转型后的吸附剂填充树脂柱，平衡后将浓度为3g/L的环磷腺苷溶液上柱，以3. 5BV/h流过树脂柱，吸附饱和后测定吸附量为109mg/g湿树脂。用O. 2mol/L氢氧化钠进行洗脱，洗脱流速2. 5BV/h，洗脱剂用量为5BV。收集洗脱液，环磷腺苷浓度为14. lg/L，纯度为94. 87%，收率97. 10%。 实施例4 称取IOOg阳离子交换树脂Amberlite IRC-84装柱，将浓度为8g/L的氯化铁溶液以lBV/h流过树脂柱，待流出液浓度亦为8g/L时，停止转型。以相同流速继续通入去离子水，至流出液中不含铁离子。最后用乙醇淋洗树脂柱，淋洗完成后，将树脂至于40°C真空干燥箱内真空干燥，完成吸附剂的转型。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液pH为I,上柱吸附饱和后计算吸附量。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液pH为2,上柱吸附饱和后计算吸附量。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液PH为3，上柱吸附饱和后计算吸附量。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液pH为4,上柱吸附饱和后计算吸附量。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液pH为5,上柱吸附饱和后计算吸附量。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液pH为6,上柱吸附饱和后计算吸附量。称取IOg转型后Amberlite IRC-84装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为3g/L并调节溶液PH为7，上柱吸附饱和后计算吸附量。由图2可知,不同pH环磷腺苷溶液体系下,经转型处理后的Amberlite IRC-84对环磷腺苷的饱和吸附量基本不变。说明，此螯合吸附介质适用于PH1-7条件下的环磷腺苷体系。实施例5 称取30g阳离子交换树脂Amberlite IR-124装柱，将浓度为2g/L的氯化铁溶液以lBV/h流过树脂柱，待流出液浓度亦为2g/L时，停止转型。以相同流速继续通入去离子水，至流出液中不含铁离子。最后用乙醇淋洗树脂柱，淋洗完成后，将树脂至于30°C真空干燥箱内真空干燥，完成吸附剂的转型。称取20g转型后Amberlite IR-124装柱，上柱环磷腺苷溶液浓度为4. 5g/L，吸附饱和后计算吸附量。之后进行再生，首先用5BV 0.4mol/LNa0H进行洗脱，洗脱完全后计算洗脱量。用3BV去离子水冲洗树脂柱为中性，然后用4BV O. 4mol/L盐酸浸泡6h，再用3BV去离子水冲洗树脂柱为中性，树脂完成再生后备用。以上述相同条件进行转型树脂的吸附，吸附饱和后再生，如此循环四次，比较吸附容量的变化情况，结果如图3所示，转型树脂的再生效果很好，吸附容量基本不变。 实施例6 与实施例2的方法相同，所不同的是，离子转型剂以氯化锌替代氯化铁。实施例7 与实施例2的方法相同，所不同的是，离子转型剂以氯化钴替代氯化铁。实施例8 同实施例2的方法相同，所不同的是，氯化铁浓度为lg/L。实施例9 与实施例2的方法相同，所不同的是，氯化铁浓度为50g/L。实施例10 与实施例2的方法相同，所不同的是，环磷腺苷溶液的浓度为lg/L，上柱流速为O. 5BV/h至吸附饱和。实施例11 与实施例2的方法相同，所不同的是，环磷腺苷溶液的浓度为8g/L，上柱流速为4BV/h至吸附饱和。实施例12 与实施例2的方法相同，所不同的是，以O. 01mol/L氢氧化钾水溶液为洗脱剂，洗脱剂用量为5BV，洗脱流速为O. 5BV/h。实施例13 与实施例2的方法相同，所不同的是，以O. 6mol/L氢氧化钾水溶液为洗脱剂，洗脱剂用量为2BV，洗脱流速为3BV/h。实施例14 与实施例5的方法相同，所不同的是，再生剂为硫酸，浓度为O. 01mol/L，再生剂用量为5BV。实施例15 与实施例5的方法相同，所不同的是，再生剂为硫酸，浓度为O. 6mol/L，再生剂用量为2BV。
权利要求
1.一种分离环磷腺苷的方法，其特征在于，以新型螯合吸附介质为吸附剂吸附溶液中的环磷腺苷，再利用碱液作为洗脱剂对吸附剂进行洗脱，收集洗脱液，使用酸液作为再生剂对吸附剂进行再生。
2.根据权利要求I所述的分离环磷腺苷的方法，其特征在于，所述的新型螯合吸附介质的前体树脂为阳离子交换树脂，以苯乙烯系或丙烯酸系为骨架，以磺酸基、磷酸基或羧基为功能基团。
3.根据权利要求2所述的分离环磷腺苷的方法，其特征在于，所述的新型螯合吸附介 质的制备，是指以无机金属盐水溶液为离子转型剂，使其与阳离子交换树脂接触，将金属离子固载到阳离子交换树脂上，转型后的阳离子交换树脂的功能基团为金属离子。
4.根据权利要求3所述的分离环磷腺苷的方法，其特征在于，所述的无机金属盐水溶液中，金属离子为Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+或Co2+,无机金属盐浓度为I 50g/L。
5.根据权利要求I所述的分离环磷腺苷的方法，其特征在于，所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，浓度为O. Ol O. 6mol/L，碱液用量为2 5BV。
6.根据权利要求I所述的分离环磷腺苷的方法，其特征在于，所述的酸液为盐酸或硫酸，浓度为O. 01-0. 6mol/L，酸液用量为2-5BV。
7.根据权利要求I所述的分离环磷腺苷的方法，其特征在于，再生前，先用去离子水淋洗吸附剂至中性，再生后，再用去离子水淋洗吸附剂至中性后重复使用吸附剂。
全文摘要
本发明公开了一种分离环磷腺苷的方法，以新型螯合吸附介质为吸附剂吸附溶液中的环磷腺苷，再利用碱液作为洗脱剂对吸附剂进行洗脱，收集洗脱液，使用酸液作为再生剂对吸附剂进行再生。本发明提供的方法采用新型螯合吸附介质分离环磷腺苷，与传统树脂分离环磷腺苷相比，本发明的优点是此吸附介质可适用于任何pH1-7条件下的环磷腺苷体系，吸附量可达到80-160mg/g树脂，环磷腺苷浓度可提高4-5倍。且此新型介质洗脱、再生过程酸、碱用量均可节约50％以上，水用量可节约20％-30％，是一种清洁环保、价格低廉、易得的吸附剂。
文档编号C07H1/06GK102617683SQ20121006826
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年2月29日
发明者吴菁岚, 应汉杰, 杨丽, 柏建新, 谢婧婧, 钱文斌, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学