专利名称：一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于化学技术领域，涉及一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，具体涉及一种将酪蛋白分步骤连续酶解制备酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的方法。
背景技术：
乳是哺乳动物乳腺的分泌产物，是一种营养十分丰富的生物液体。乳的营养价值，对人类和动物生长调节与免疫保护中的独特功能以及各成分之间的合适比例，是新生哺乳动物最好的营养素。乳脂、乳糖和乳蛋白是乳的基本成份，牛乳中蛋白质含量约为3. 3% 3.5%，人乳中为1.4%。乳蛋白是一类营养全价的蛋白质，它种类多，含量丰富，分布广泛。·乳蛋白主要有酪蛋白(casein, CN)和乳清蛋白(wheyprotein)两大类，以及含量相对较少的乳脂肪球膜蛋白(MFGMP)。酪蛋白是乳腺上皮细胞合成的一组含有大量磷和钙的蛋白质。在PH为4. 6，温度为20°C的条件下，即可从脱脂乳中沉淀得到酪蛋白。酿蛋白是乳含量最丰富的蛋白质，占乳蛋白的76% 86，含有人体生长发育所必须的氨基酸。酪蛋白作为一种重要的营养物质，有着广泛的用途，如用于酪蛋白活性肽的制备，食品的增稠剂和乳化剂等。目前为止，人们已从酪蛋白酶解物中发现了多种具有生物活性的功能肽，如酪蛋白抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽等等。但在目前报道中，都以某一功能肽为目标进行制备生产，没有关于分步骤联产4种活性肽的报道，对原料和能源造成极大的浪费。自1966年Katzir等人从凝乳酶酶解酪蛋白酶解产物中发现具有抗菌特性的物质以来，酪蛋白活性肽活性肽日趋成为乳品领域的研究热点进展极为迅速。迄今为止，人们已经中发现了数十种具有重要生理功能的酪蛋白生物活性肽，它们具有广泛而重要的生物学机能和机体调节功能。目前的专利报道中，湖北武汉的邹远东报道了“用复合蛋白酶酶解酪蛋白制得酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备方法和用途”的专利；日本卡尔皮斯株式会社山本直之等人报道了“酪蛋白水解物及其生产过程与应用”，该专利涉及发明了一种含有在体内具有最低酶分解性的游离氨基酸及体内非分解性的肽的酪蛋白水解物，预计它能够在活体内表现出诸如降血压作用等功能；浙江工业大学的孟祥河等人发明了“一种酪蛋白糖巨肽的制备方法”;但目前并没有联产4种酪蛋白活性肽研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，本发明所联产的4种活性肽，其中酪蛋白抗菌肽具有抗病毒、抗感染、抗寄生虫、抗肿瘤等功能；酪蛋白磷酸肽(CPPs)具有促进钙铁锌等矿物元素的吸收、抗龋齿、促进动物体外受精和增强机体免疫力等功能；酪蛋白酪啡肽具有镇静止痛、安眠和延迟胃排空时间，抑制肠道运转消化物等生理作用；酪蛋白糖巨肽(CGMP)具有对益生菌的增殖作用、免疫调节作用和抑制病毒和细菌等附着的作用。其技术方案为
一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，包括以下步骤1)酪蛋白抗菌肽的制备在97份lOOmg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，调节酶解液PH为8. 5，55°C恒温水解2. 5h，之后使用分子量为3000和10000的超滤膜对水解液进行超滤，收集分子量3000-10000的酶水解液冷冻干燥即得到酪蛋白抗菌肽；2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备取步骤I)中剩余的酶水解液继续水解lh，在4°C条件下，10000r/min离心20min除去未水解的大分子物质和溶液中的杂质,沉淀收集备用，向上清液中加入10% (v/v)CaCl2和无水乙醇，使两者在溶液中的终浓度分别为1%和50%,上清液室温放置过夜，在4°C条件下，10000r/min离心20min，收集沉淀，用无水乙醇经过3次洗涤沉淀，最终沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)；3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制备取步骤I)和步骤2)中剩余的酶水解残留物质，调节pH至I. 6使沉淀溶解,配制成为10mg/ml溶液,按照胃蛋白酶与酶解液质量比 I 100在温度55°C、pH值为I. 6条件下水解2h，调节水解液pH为4. 6，4°C条件下，IOOOOr/min离心20min，取上清液备用，回调pH到7. 0，此时水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍体存在，其分子量为20000 40000之间，而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000，使用分子量为1000的超滤膜对上清液进行超滤分离，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的组分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的组分中，分别冷冻干燥两种组分。步骤I)中以大肠杆菌为指示菌，测出其抑菌圈大小为19. 43mm，得率为18. 83Img/g°步骤2) CPPs 得率为 11. 41mg/g，氮磷比为 10.27。步骤3)中水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率为40. 13%，得率为1.693mg/g。^ -酪啡肽-5 含量 0. 0297mg/mg,得率为 0. 1257mg/g, ^ -酪啡肽-7 含量 0. 03054mg/mg,得率为 0. 1292mg/g。与现有技术相比，本发明的有益效果为本发明一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，充分利用了酪蛋白酶和胃蛋白酶不同酶解条件，以及水解目的产物分子量不同的特点，分布水解得到抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽。各种功能肽的产率均较高，且各种性质和生物活性具有重现性和稳定性，弥补了已有生产工艺单一的不足。
图I是蛋白抗菌肽在以大肠杆菌为指示菌株产生的抑菌圈；图2是酪蛋白酪啡肽@ -酪啡肽-5和￠-酪啡肽-7的色谱图；图3是酪蛋白抗菌肽抑菌图；图4是验证实验酪蛋白抗菌肽抑菌图；图5是酪蛋白酪啡肽色谱图；图6是验证实验酪蛋白酪啡肽色谱图。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明的制备方法作进一步详细地说明。实施例I
I)酪蛋白抗菌肽的制备在97份100mg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，调节酶解液pH为8. 5，55°C恒温水解2. 5h，之后使用分子量为3000和10000的超滤膜对水解液进行超滤，收集分子量3000-10000的酶水解液冷冻干燥即得到酪蛋白抗菌肽。以大肠杆菌为指示菌，测出其抑菌圈大小为19.43_，得率为18.831mg/g。蛋白抗菌肽在以大肠杆菌为指示菌株产生的抑菌圈如图I所示。2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备取步骤I)中剩余的酶水解液继续水解lh，在4°C条件下，10000r/min离心20min除去未水解的大分子物质和溶液中的杂质,沉淀收集备用。向上清液中加入10% (v/v) CaCl2和无水乙醇，使两者在溶液中的终浓度分别为I %和50%。上清液室温放置过夜，在4°C条件下，10000r/min离心20min，收集沉淀，用无水乙醇经过3次洗涤沉淀，最终沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)，此时CPPs得率为11.41mg/g，氮磷比为10. 27。3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制备取步骤I)和步骤2)中剩余的酶水解残留物质，调节pH至I. 6使沉淀溶解,配制成为10mg/ml溶液,按照胃蛋白酶与酶解液质 量比I : 100在温度55°C、pH值为I. 6条件下水解2h，调节水解液pH为4. 6，4°C条件下，10000r/min离心20min，取上清液备用。回调pH到7. 0，此时水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍体存在，其分子量为20000 40000之间,而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000。使用分子量为1000的超滤膜对上清液进行超滤分离，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的组分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的组分中，分别冷冻干燥两种组分。此时水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率为40. 13%，得率为1.693mg/g。P -酪啡肽_5含量0. 0297mg/mg，得率为0. 1257mg/g, ^ -酪啡肽-7含量0. 03054mg/mg，得率为0. 1292mg/g，色谱图见图2。实施例2I)酪蛋白抗菌肽的制备及检测配制浓度lOOmg/mL的酪蛋白溶液，以胰蛋白酶在酶底比3%、温度55°C、pH值为8. . 5条件下水解，水解2. 5h后，灭酶，经离心过滤、微滤去除未水解大分子物质，收集沉淀备用。上清液分别使用分子量为3000和10000的超滤管对水解液进行超滤，分离酪蛋白抗菌肽，据现有技术报道，酪蛋白抗菌肽分子量大于3000，故取分子量在3000-10000区间内的水解液冷冻干燥，测定其得率，以大肠杆菌为指示菌，验证其抑菌性。利用水解2. 5h后分离出抗菌肽，冷冻干燥后各取Ig样品溶于ImL蒸馏水(浓缩20倍)使用大肠杆菌验证抑囷性。结果如表I、图3和图4所不。表I酪蛋白抗菌肽实验结果
实验平均抑菌圈直径(mm)每克酷蛋白中抗菌狀得率(mg/g)联产实验19.43188.31 验证实验 19.17 182.252)酪蛋白磷酸肽的制备水解3. 5h时，采用乙醇沉淀法分离出酪蛋白磷酸肽。并使用旋转蒸发仪回收水解液中的乙醇。收集收集水解产生的酪蛋白磷酸肽冷冻干燥，计算其得率，测定其中氮含量、磷含量以及氮磷比。水解3. 5h后分离出酪蛋白磷酸肽，冷冻干燥，测定其中的氮元素、磷元素以及氮磷比的值。结果如表2所示。表2酪蛋白磷酸肽测定结果
权利要求
1.ー种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产エ艺，其特征在于，包括以下步骤1)酪蛋白抗菌肽的制备在97份100mg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，调节酶解液PH为8. 5，55°C恒温水解2. 5h，之后使用分子量为3000和10000的超滤膜对水解液进行超滤，收集分子量3000-10000的酶水解液冷冻干燥即得到酪蛋白抗菌肽； 2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备取步骤I)中剩余的酶水解液继续水解lh，在4°C条件下，10000r/min离心20min除去未水解的大分子物质和溶液中的杂质,沉淀收集备用，向上清液中加入10% (v/v)CaCl2和无水こ醇，使两者在溶液中的终浓度分别为1%和50%，上清液室温放置过夜，在4°C条件下，10000r/min离心20min,收集沉淀,用无水こ醇经过3次洗涤沉淀，最终沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)； 3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制备取步骤I)和步骤2)中剰余的酶水解残留物质，调节pH至I. 6使沉淀溶解,配制成为10mg/ml溶液,按照胃蛋白酶与酶解液质量比I 100在温度55°C、pH值为I. 6条件下水解2h，调节水解液pH为4. 6，4°C条件下，IOOOOr/min离心20min，取上清液备用，回调pH到7. 0，此时水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍体存在，其分子量为20000 40000之间，而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000，使用分子量为1000的超滤膜对上清液进行超滤分离，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的组分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的组分中，分别冷冻干燥两种组分。
2.根据权利要求I所述的联产エ艺，其特征在于，步骤I)中以大肠杆菌为指示菌，测出其抑菌圈大小为19. 43mm，得率为18. 831mg/g。
3.根据权利要求I所述的联产エ艺，其特征在于，步骤2)CPPs得率为11.41mg/g，氮磷比为10. 27。
4.根据权利要求I所述的联产エ艺，其特征在于，步骤3)中水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率为40. 13%，得率为1.693mg/g，P -酪啡肽_5含量0. 0297mg/mg，得率为.0.1257mg/g，^ -酪啡肽-7 含量 0. 03054mg/mg，得率为 0. 1292mg/g。
全文摘要
本发明公开了一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，包括以下步骤1)酪蛋白抗菌肽的制备；2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备；3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制备。本发明充分利用了酪蛋白酶和胃蛋白酶不同酶解条件，以及水解目的产物分子量不同的特点，分布水解得到抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽。各种功能肽的产率均较高，且各种性质和生物活性具有重现性和稳定性，弥补了已有生产工艺单一的不足。
文档编号C07K1/30GK102732590SQ20121021873
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者代斌, 张良, 杜军, 章华, 胡莉莉, 袁永俊 申请人:西华大学