专利名称：富硒酵母中含硒蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法。
背景技术：
硒是人和动物体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分。硒还具有多种生物学功能，如具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用，它的生物学功能主要是以硒蛋白表现的。已发现的硒蛋白大多数是具有重要作用的酶，又称之为硒酶。目前已有大量研究表明人体40多种疾病如克山病、甲状腺肿、关节炎、糖尿病、白内障、癌症等与硒的营养状况有密切的关系，因此，对硒蛋白的研究已成为近年来的热点研究课题。如，陈汉杰等通过反复冻融提取酵母中的硒蛋白(陈汉杰等.硒酵母中硒蛋白的色谱分离和分析.暨南大学学报，1993，14 (I) :60-62. )，Laure等人利用超声破碎酵母细胞后提取含硒蛋白(Laure et al. Identification of selenium-containingproteins in selenium-rich yeast aqueous extract by 2D gel lectrophoresis, nanoHPLC - ICPMS and nanoHPLC - ESI MS/MS, Talanta, 2008, 75:1140-1145.)等，现有富硒酵母中含硒蛋白的制备方法通常采用超声、酸提或反复冻融来破碎酵母细胞后提取含硒蛋白，但因为酵母细胞壁厚，超声破碎效率不高，化学方法提取后蛋白质易失活，后期纯化的蛋白较少，极大的限制了硒蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种酵母破碎率高，蛋白提取失活少，提取含硒蛋白纯度高的方法。本发明富硒酵母中含硒蛋白的制备方法包括以下步骤酵母的高压匀质破碎，离心，沉淀，含硒粗蛋白收集，含硒蛋白洗脱收集。具体操作步骤如下
I.富硒酵母菌体浸泡在5 10倍体积的50-150 mmol/L,pH为7. 4-7. 8的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后5000-15000 rpm/min,2-6°C,离心15-45 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比759Γ90%的硫酸铵，在T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后5000-15000 rpm/min，2-6°C，离心15-45 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042—，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白。作为优选，Tris-HCl缓冲液pH为7. 6，浓度为100 mmol/L，离心转速为10000 rpm/min,温度为4°C,离心时间为30 min。2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0. 22μ m的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。作为优选，过葡聚糖凝胶柱条件参数为流速I ml/min作为洗脱液的缓冲液为100 mmol/LTris-HClο
本发明以富硒酵母菌体为原料，首先制备水溶性粗蛋白，并通过硫酸铵沉淀蛋白，葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析对水溶性粗蛋白进行纯化，即制备得到目标含硒蛋白。本发明的有益效果在于因破碎率高，粗蛋白提取充分，纯化后获得蛋白中硒含量高，同时利用SDS-PAGE电泳后均为均一条带，说明制备的蛋白纯度高。
具体实施例方式 本发明技术方案不局限于以下所列举实施方案，还包括具体实施方式
间的任意组合。实施例一
因酵母细胞壁较厚，细胞壁破碎的效率对蛋白提取的效率有很大的影响，因此对不同破碎条件下提取蛋白含量进行测定，以优选出破碎的方法。表I.不同破碎条件下从富硒酵母中提取蛋白和硒的含量
I超声破碎 I高压均质 I反复冻融 I酸-热水处理 蛋白含量(g/100ml) 0·216±0·05 O. 365±0· 11 O. 113±0· 06 O. 214±0· 04 褊含量(mg/kg)丨630±13丨986±16丨321±10丨587±13 一
注n=3
从上述实验结果可知，高压均质破碎富硒酵母效率最高，比超声破碎、酸-热水处理高约I. 7倍，比反复冻融破碎富硒酵母高越3. 2倍。实施例二
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行
I.富硒酵母的培养是通过液体发酵培养，在发酵液中添加亚硒酸钠，通过酵母在生长过程中对无机硒的吸收、富集、转化为有机形态的硒，最后离心收集富集酵母菌体，收集的富硒酵母菌体，测定菌体的硒含量为1000 yg/g。取富硒酵母菌体10 g浸泡在50ml的100 mmol /T,, pH7. 6 的 Tris-HCl 缓冲液中，超声破碎 Ih,破碎后 10000 rpm/min, 4°C,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%的硫酸铵,在3 5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min,4°C,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白，粗蛋白含硒量为900 μ g/g°2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过O. 22μ m的微孔滤膜后取2 ml上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为I ml/min,检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分，即得到富硒酵母含硒蛋白。实施例三
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行
I.富硒酵母的培养是通过液体发酵培养，在发酵液中添加亚硒酸钠，通过酵母在生长过程中对无机硒的吸收、富集、转化为有机形态的硒，最后离心收集富集酵母菌体，收集的富硒酵母菌体，测定菌体的硒含量为1000 μ g/g。取富硒酵母菌体10 g浸泡在50ml的100mmol/L, pH7. 6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎,破碎后10000 rpm/min, 4°C,离心30min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%的硫酸铵,在3 5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min,4°C,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白，粗蛋白含硒量为1200 μ g/g。2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过O. 22μ m的微孔滤膜后取2 ml上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为I ml/min,检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分，即得到富硒酵母含硒蛋白。实施例四
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行
I.将10 g总硒含量为1000 μ g/g的富硒酵母菌体浸泡在50 ml的100 mmol/L, pH7. 6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min, 4°C,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比90%的硫酸铵，在:T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4°C，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉 淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过O. 22μ m的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为I ml/min,检测波长为280nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。实施例五
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行
I.将10 g总硒含量为1000 μ g/g的富硒酵母菌体浸泡在100 ml的100 mmol/L, pH7. 6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min, 4°C,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比80%的硫酸铵，在:T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4°C，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过O. 22μ m的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为I ml/min,检测波长为280nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。实施例六
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行
I.将10 g总硒含量为1500 μ g/g的富硒酵母菌体浸泡在50 ml的100 mmol/L, pH7. 6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min, 4°C,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比80%的硫酸铵，在:T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4°C，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22μ m的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为I ml/min,检测波长为280nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。实施例七
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行
I.将20 g总硒含量为1500 μ g/g的富硒酵母菌体浸泡在100 ml的100 mmol/L, pH7. 6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min, 4°C,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比90%的硫酸铵，在:T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4°C，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。2.将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过O. 22μ m的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为I ml/min,检测波长为280nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。本发明以富硒酵母菌体为原料，采用高压均质破碎，破碎效率高，能充分提取粗蛋白，再经过葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析对水溶性粗蛋白进行纯化，即制备得到3中含硒蛋白，与现有方法相比，纯化后获得蛋白中硒含量高，同时利用SDS-PAGE电泳后均为均 一条带，说明制备的蛋白纯度高。
权利要求
1.一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤酵母的高压匀质破碎，离心，沉淀，含硒粗蛋白收集，含硒蛋白洗脱收集。
2.根据权利要求I所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于所述酵母的高压匀质破碎之前将富硒酵母菌体浸泡在5 10倍体积的50-150 mmol/L,pH为7. 4-7. 8的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎后以5000-15000 rpm/min, 2_6°C,离心15-45 min,并收集上清液。
3.根据权利要求2所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于所述酵母的高压匀质破碎之前浸泡的Tris-HCl缓冲液pH为7. 6，浓度为100 mmol/L，破碎后离心转速为10000 rpm/min,温度为4°C，离心时间为30 min。
4.根据权利要求I所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于所述含硒粗蛋白收集过程包括向离心上清液中加入质量百分比759^90%的硫酸铵，在:T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后5000-15000 rpm/min，2-6°C，离心15-45 min，收集沉淀，再用少量缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042_，透析完毕；用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白。
5.根据权利要求4所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于所述离心转速为10000 rpm/min,温度为4°C，离心时间为30 min。
6.根据权利要求I所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于所述含硒蛋白洗脱收集过程在于将粗蛋白溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0. 22V- m的微孔滤膜后通过葡聚糖凝胶柱,在流速为0. 5-3 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
7.根据权利要求6所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于所述葡聚糖凝胶柱条件参数为流速I ml/min，洗脱液的缓冲液为100 mmol/LTris-HCl0
8.根据权利要求1-7中任一项所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤(I)富硒酵母菌体浸泡在5 10倍体积的50-150 mmol/L, pH为7. 4-7. 8的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后5000-15000 rpm/min, 2-6°C,离心15-45 min,收集上清；(2)向离心上清液中加入质量百分比759^90%的硫酸铵，在:T5°C条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后5000-15000 rpm/min，2-6°C，离心15-45 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无S042—，透析完毕；用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白；(3)将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0. 22 Um的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
全文摘要
本发明公开了一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法。主要包括下述步骤(1)富硒酵母高压均质破碎后离心；(2)向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵搅拌后离心收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀后放入透析袋中透析，用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白。(3)将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，过0.22μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3ml/min，检测波长为280nm，洗脱液为50-150mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。本发明相对于现有技术破碎率高，粗蛋白提取充分，纯化后获得蛋白中硒含量高，同时指标的含硒蛋白纯度高。
文档编号C07K1/36GK102775466SQ20121028824
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者朱元元 申请人:苏州硒谷科技有限公司