Spg11基因突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分离的编码SPG11突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法、筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的系统以及用于筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的试剂盒。其中，分离的编码SPG11突变体的核酸，与SEQ?ID?NO：1相比，具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变。通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫。
【专利说明】SPG11基因突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及SPGll基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码SPGll突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法、筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的系统以及用于筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的试剂盒。
【背景技术】
[0002]遗传性疫挛性截瘫(hereditaryspastic paraplegia, HSP)于 1876 年由Seeligmuller首先报道，是一种以双下肢进行性肌张力增高和无力、剪刀步态为特征的具有明显遗传异质性的综合征。病理改变主要为脊髓中的双侧皮质脊髓束的轴索变性和脱髓鞘，以胸髓为重。起病初期常表现为双下肢僵硬、无力，行走易跌倒，逐渐发展成双下肢痉挛性截瘫，不能行走。不同遗传分型的HSP患者的临床表现、病情轻重及病程长短各不相同，且同一家系内不同患者的病情也不尽相同。根据不同的临床表现，HSP可分为单纯型和复杂型，单纯型表现为逐渐进展的双下肢痉挛、步态不稳、腱反射亢进，可合并膀胱括约肌功能障碍和深感觉减退；复杂型患者除上述表现外，还伴有其他表现，如智力障碍、癫痫、鱼鳞病、周围神经病、白内障及共济失调等。发病率为2/10万~10/10万。
[0003]HSP为单基因遗传病，根据遗传方式的不同，HSP可分为常染色体显性遗传(autosomal dominant, AD)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive, AR)以及 X 连锁隐性遗传(X-linked recessive，XR)。不同基因类型具有各自的临床特点，确定HSP患者的基因分型有助于明确其临床亚型，以及为家系内尚未发病的患者提供基因诊断依据，同时可为下一代提供产前诊断依据，以期生育健康的后代。
[0004]近年来，与HSP致病相关的基因位点不断被发现，已经报道与HSP发病相关的基因有46个，20个致病基因已被克隆，其中以AD为最常见。而SPGll基因突变是AR-HSP中最常见的类型，约占AR-HSP患者的18.9%。以复杂型多见。
[0005]然而，现阶段对常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫(AR-HSP)的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0006]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫(简称“AR-HSP”)的致病基因上的新突变。
[0007]本发明是基于发明人的下列工作而完成的:发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的致病基因上的新突变(SPG11, c.C6856T 和 c.2863delG)。
[0008]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码SPGll突变体的核酸(即SPGll基因突变体)。根据本发明的实施例，该核酸与SEQ ID NO:1相比，具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变。根据本发明的实施例，发明人确定了 SPGll基因突变体，该突变体与AR-HSP的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫。
[0009]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽与SEQ ID NO:2相比，具有选自p.Arg2286X和p.Glu955Lysfs*7的至少一种突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫。
[0010]根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相t匕，具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变是所述生物样品易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的指示。通过根据本发明实施例的筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫(即AR-HSP)的生物样品的方法，可以有效地筛选易患AR-HSP的生物样品O[0011]根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变，判断所述生物样品是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品。
[0012]根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有:适于检测SPGll基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，所述SPGll基因突变体具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品。
[0013]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0015]图1显示了根据本发明实施例的筛选易患AR-HSP的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，A为根据本发明实施例的筛选易患AR-HSP的生物样品的系统的示意图，B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0016]图2显示了根据本发明实施例的一个AR-HSP家系的家系图；[0017]图3显示了根据本发明实施例的患者112的SPGll基因突变位点的Sanger测序验证峰图，其中，A为c.C6856T突变位点Sanger测序验证峰图，B为c.2863delG突变位点Sanger测序验证峰图；
[0018]图4显示了根据本发明实施例的家系内正常人13的SPGll基因突变位点的Sanger测序验证峰图,其中,A为c.C6856T突变位点Sanger测序验证峰图,B为c.2863delG突变位点Sanger测序验证峰图；
[0019]图5显示了根据本发明实施例的家系内正常人12的SPGll基因突变位点的Sanger测序验证峰图,其中,A为c.C6856T突变位点Sanger测序验证峰图,B为c.2863delG突变位点Sanger测序验证峰图；以及
[0020]图6显示了根据本发明实施例的家系内正常人14的SPGll基因突变位点的Sanger测序验证峰图,其中,A为c.C6856T突变位点Sanger测序验证峰图,B为c.2863delG突变位点Sanger测序验证峰图。
【具体实施方式】
[0021]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0022]SPGll基因突变体
[0023]根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码SPGll突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO:1相比，该核酸具有选自C.C6856T和c.2863delG的至少一种突变。在本文中所使用的表达方式“编码SPGll突变体的核酸”，是指与编码SPGll突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与SPGll突变体的编码基因(即SPGll 基因突变体)相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码SPGll突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了 SPGll基因的突变体，该突变体与常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫。
[0024]这些编码SPGll突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的致病基因上的新突变。并且，在现有技术中并未见SPGll基因上的c.C6856T和c.2863delG突变与AR-HSP相关的报道。
[0025]野生型SPGll基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列(7332nt):
[0026]ATGGCTGCAGAGGAAGGGGTCGCGAGTGCTGCTTCCGCCGGCGGTAGCTGGGGCACCGCGGCCATGGGGCGGGTTCTACCGATGCTGTTGGTGCCAGTCCCCGCCGAGGCGATGGGGCAGCTCGGCTCCCGGGCGCAGCTGCGCACACAGCCGGAGGCTCTGGGGAGCCTGACGGCTGCGGGCAGCCTCCAAGTGCTTTCTTTGACGCCTGGCAGCCGGGGCGGGGGTCGCTGCTGCCTGGAGGGCCCCTTCTGGCACTTTCTATGGGAGGATTCTCGTAACAGCAGCACACCAACTGAAAAGCCCAAACTGCTCGCTCTTGGTGAAAATTATGAACTGCTTATCTATGAATTTAATTTGAAAGATGGAAGATGTGA
【权利要求】
1.一种分离的编码SPGll突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述核酸具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID N0:2相比，所述分离的多肽具有选自p.Arg2286X 和 p.Glu955Lysfs*7 的至少一种突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3.一种筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤: 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变是所述生物样品易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的指示， 任选地，所述生物样品为选自人体血液、皮肤、毛发和肌肉的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括: 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ；以及 基于所述RNA样本，通过反转录反`应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括: 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序， 任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括: 利用SPGll基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，所述SPGll基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:7_10所示的核苷酸序列。
6.一种筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的系统，其特征在于，包括: 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，是否具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变，判断所述生物样品是否易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括:RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连,用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括: 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地,所述文库构建单元进一步包括: PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有SPGll基因外显子特异性引物，以便利用SPGll基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述SPGll基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:7_10所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自Hiseq2000、SOLiD,454和单分子测序装置的至少一种。
9.一种用于筛选易患常染色体隐性遗传型遗传性痉挛性截瘫的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有: 适于检测SPGll基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO:1相比，所述SPGll基因突变体具有选自c.C6856T和c.2863delG的至少一种突变。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针， 任选地，所述试剂盒包含具有如SEQ ID NO:7-10所示核苷酸序列的SPGll基因外显子特异性引物。
【文档编号】C07K14/47GK103627710SQ201210301974
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月22日 优先权日:2012年8月22日
【发明者】张家堂, 刘慧 , 赵威, 于生元, 管李萍, 王俊, 汪建, 杨焕明 申请人:中国人民解放军总医院, 深圳华大基因科技有限公司