专利名称：挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法。
背景技术：
随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究更显重要，而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域。(郭晓强，郭争亮.真核生物转录机理的结构基础.生物学通报，2006,41(11) :60-61)细胞基因的表达，即由DNA转录成RNA再翻译成蛋白质的过程，是受到严格的调节控制的。在细胞的生长、发育和分化过程中，遗传信息的表达可按一定时间程序发生变化，而且随着细胞内外环境条件的改变而加以调整，这就是时序调控和适应调控。其中，转录水平的调控是关键的环节，因为遗传信息的表达首先涉及到的是转录过程。·转录调控主要发生在起始和终止阶段。启动子是转录起始的控制部位，它是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子(蛋白质)称为转录因子，它的作用或是识别DNA的顺式作用位点，或是识别其他因子，或是识别RNA聚合酶。实际上，基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式，涉及基因组DNA和一系列结合蛋白的相互作用。不同生理条件下特异性的基因转录调控依赖于不同的反式作用因子与顺式作用元件的特异性结合。因此，深入研究基因表达调控的分子机制，必须要研究DNA-蛋白质的相互作用，即需要明确哪些转录因子与哪些基因的转录调控区域发生了特异性结合° (BrivanlouA H, Damell J E Jr. Signaltransduction and the controlof gene expression. Science, 2002, 295 (5556) :813-818)建立有效的研究方法可以大大促进该领域的研究。蛋白分子与启动子DNA的结合具有特异性，这是研究启动子DNA结合蛋白的前提。目前研究DNA与蛋白相互作用的常见方法有DNaseI足纹法(DNaseI footpriting)、酵母单杂交系统(Yeast One-Hybrid System)、凝胶阻滞试验(gel retardation assay)等。但上述方法都有一定的局限性。DNaseI法只是针对某一特定蛋白与核酸互作，或是某一特定短核酸序列与蛋白互作的研究，因此获得的只是某个单一的核酸片段或单一的蛋白；而酵母单杂交系统同样是研究细胞内蛋白质与DNA的特定序列间的相互作用，但一次只能研究特定基因的一个启动因子；而凝胶阻滞试验则是一种定性研究蛋白与基因互作的方法，但无法确定具体的蛋白。因此，亟待开发出新的工具和技术手段来研究DNA与蛋白的相互作用。从而从转录水平上研究基因表达的调节，寻找新的蛋白并了解其对转录调节的作用，为阐明某些疾病的发病机制及基因治疗奠定了基础
发明内容
本发明旨在针对现有研究DNA与蛋白相互作用的方法中存在的不足，提供一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的新方法。为了实现本发明目的，本发明的一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法，包括以下步骤I)将5’或3’端带有生物素的启动子序列或其片段与表面吸附有链亲和素的磁珠结合，形成磁珠-启动子二元复合物；2)分别从处于不同生长、发育或分化阶段的细胞或组织中提取核蛋白，然后分别将这些特定时期的核蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合，从而形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物；3)对步骤2)中得到的三元复合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，找出差异条带，以确定所要候选目的蛋白的片段长度，然后进行二维电泳分离提纯目的蛋白，并对纯化的目的蛋白进行质谱分析或氨基酸测序，从而确定所含蛋白。·优选地，所述步骤2)为分别从处于不同生长、发育或分化阶段的细胞或组织中提取核蛋白，并分别将这些特定时期的核蛋白与能够竞争性封闭所述启动子序列或其片段上非特异性蛋白结合位点的蛋白混合，然后分别将这些混合好的蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合，从而形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物。其中，能够封闭所述启动子序列或其片段上非特异性蛋白结合位点的蛋白为BSA蛋白或脱脂奶粉。此外聚核苷酸竞争物、鲑精DNA等也可以提高杂交的特异性。本发明是基于DNA-蛋白质相互作用的原理，结合生物素-链亲和素系统、磁珠分离技术开发出一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法。生物素-链亲和素系统是近几年来应用广泛的一门生物学技术，二者以超强的非共价键特异性结合，且这种结合高度稳定；二者都可以耦联蛋白质、核酸、糖和酶等生物活性物质，一个蛋白质(或核酸等)分子上可结合多个生物素分子，而一个亲和素又可结合4个生物素，因而两者的结合具有多级放大作用。(张晓春，陆燕蓉.生物素-亲和素技术的研究进展.现代预防医学，2001，28 (4) =485-486,494)1979年，John Ugelstad等人开发出一种生产大小一致的多聚体微球的技术。通过此项技术,可生产出直径为I. 5 100 μ m、结构对称的多聚体微球。现在将这种采用复合顺磁物质制成的小球命名为Dynabead。它具有以下特点(I) Dynabead是由Y Fe2O3和Fe3O4磁性材料合成的均一、超顺磁、单发散性多聚微球。每个微球体包被一层多聚材料，作为吸附和结合各种分子的载体。(2)Dynabead形状和大小的均一性保证了微球表面物理化学性质的一致，而高质量结果的获得和结果的可重现性是建立于它的这些特性上的。(3)Dynabead形状和大小的均一性为其本身与靶物质之间提供最佳的反应动力学,这就大大方便了它们之间快速、高效的结合。在许多情况下，仅需10分钟就可完成结合过程。(4)它的球形、确定的表面减少了化学粘附和非特异性结合。(5)均一的微球表面保证了目标探针的有效使用和最佳结合。(6)Dynabead的多聚外壳可保证祀物质免遭铁离子的破坏。Dynabead是超顺磁，它们能够在磁场中表现出磁性而在无磁场时无磁性。(7)不同的Dynabeads类型特殊的亲水和疏水特性能促进分子结合到它们的表面上。本发明的方法中使用的磁珠优选为Dynabead，或由其它具有吸附生物素特性的且不会影响到祀物质结构的材料制成。
本发明根据DNA-蛋白质相互作用的原理，将生物素-链亲和素系统与磁珠分离技术相结合，提供一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的新方法。新基因、新蛋白质的发现和鉴定以及它们之间相互作用的研究将赋予分子生物学以永不衰竭的生命力，为从转录水平上研究基因表达的调节，寻找新的蛋白并了解其对转录调节的作用提供了新思路，并为进一步阐明某些疾病的发病机制及基因治疗奠定了基础。采用本发明的方法不仅能够将与核酸片段互作的蛋白分离出来，更为重要的是能够一次性获得生长、发育或分化等某一特定状态下调控特定基因表达的蛋白群，并且最终通过质谱显示出在该条件下调控该基因表达的图谱。
图I为构建得到的Myog启动子荧光素酶表达载体的结构示意图。图2PCR反应扩增Myog启动子后的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，I为含生物素的目的片段，3为不含生物素的目的片段，2和4为阴性对照，M为DNAMarker。图3为本发明三元复合物的SDS-PAGE结果，其中I为蛋白Marker，2为分化前总 蛋白，3为分化前核蛋白+磁珠+含生物素的启动子，4为分化前核蛋白+磁珠+不含生物素的启动子(阴性对照)，5为分化后总蛋白，6为分化后核蛋白+磁珠+含生物素的启动子，7为分化后核蛋白+磁珠+不含生物素的启动子(阴性对照)。图4为本发明的实施例挖掘C2C12细胞分化过程中myog基因的转录调控蛋白的流程示意图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例挖掘C2C12细胞分化过程中myog基因的转录调控蛋白包括以下步骤I.模板的构建参照NCBI公布的Myog序列，提取长白猪基因组作为模板，扩增并构建了 Myog启动子荧光素酶表达载体。引物序列F:5，-TAGGGTAAGTGGGATTGAGTC-3，R:5，-CAGGTCGGAAAAGGCTTG-3’PCR 体系缓冲液2.5μ1
dNTP2.5 μ
引物F0.5μ1
引物R0.5μ1
模板Ιμ
Taq_0.5μ1 (50U)
CidH2O 17.75μ!
PCR 条件945min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 2min 30s, 30 个循环；72°C 7min ；4°C存放15min。采用PCR方法得到Myog基因翻译起始位点上游约2. 4kb的基因片段，构建T载体并进行酶切和测序；然后用限制性内切酶Nhe I和Xho I双酶切上述片段，并克隆至PGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。获得的Myog启动子荧光素酶表达载体的结构如图I所示。2.以步骤I构建得到的表达载体为模板进行PCR反应，特异性扩增Myog启动子，所使用的下游引物5’端带有生物素。扩增后回收2400bp左右的片段(图2)。引物序列F:5，-TAGGGTAAGTGGGATTGAGTC-3，R:5，-CAGGTCGGAAAAGGCTTG-3’PCR 体系
缓冲液 2.5μ1 dNTP 2.5μ1 引物F 0.5μ1 引物R 0.5μ1 模板Ιμ
TaqSI 0.5μ1 (50U)
CldH2O17.75μΙPCR 条件945min ；94°C 30s,60°C 30s, 77 L min 30s, 30 个循环；72°C 7min ；4°C存放15min。3.将下游含有生物素的启动子序列与表面结合有链亲合素的磁珠Dynabead(Dynabeads kilobaseBINDER Kit, Invitrogen) 40 μ I (400 μ g)与 IOpmol 启动子序列结合，形成磁珠-启动子二元复合物。4.分别提取分化前和分化后的小鼠C2C12细胞中的核蛋白。采用Nuclear-Cytosol Extraction Kit (北京普利莱基因技术有限公司)提取核蛋白。5.将3%牛血清白蛋白(BSA)6 μ g分别与分化前的细胞核蛋白和分化后的细胞核蛋白210 μ g混合，然后与上述二元复合物结合。BSA蛋白起到封闭启动子上非特异性蛋白结合位点的作用。6.分别将步骤4混合好的蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合(相当于核蛋白210 μ g和IOpmol磁珠-启动子二元复合物的比例),形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物。7.将步骤5的两组(即分化前和分化后)三元复合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，找出差异条带(图3)。确定所要候选目的蛋白的片段长度。然后进行二维电泳分离提纯目的蛋白。8.对差异条带进行质谱，确定其中的蛋白成分，并进一步通过与小鼠基因对比，分析出可能的基因和mRNA序列。图4为本发明的实施例挖掘C2C12细胞分化过程中myog基因的转录调控蛋白的·流程示意图。目前对转录水平的研究，是通过对某特定细胞(如肝脏细胞)的某一特定状态下(如生长期)全部表达的蛋白或mRNA水平(称为转录组)的研究。而本发明是针对在特定细胞(如肌肉细胞)的某一特定状态下(如生长期)，某个特定基因(如本例中的MyoG)具体受到哪些蛋白因子调控的研究。换言之，该基因之所以表达(或关闭)，是因为某些蛋白(核蛋白)与启动子的特定部分结合(或解离)而导致了该基因的启动(或关闭)表达。由于与该基因启动子结合的蛋白因子是调控该基因转录的一组蛋白核因子，因此称之为转录调控组。通过改变某个基因在多种状态下的调控组进行比较，即可以知从A状态(生长/发育状态)到B状态(分化状态)，控制该基因转录水平的调控组的变化，最终阐述基因的调控机制。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将5’或3’端带有生物素的启动子序列或其片段与表面吸附有链亲和素的磁珠结合，形成磁珠-启动子二元复合物； 2)分别从处于不同生长、发育或分化阶段的细胞或组织中提取核蛋白，然后分别将这些特定时期的核蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合，从而形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物； 3)对步骤2)中得到的三元复合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，找出差异条带，以确定所要候选目的蛋白的片段长度，然后进行二维电泳分离提纯目的蛋白，并对分离纯化的目的蛋白进行质谱分析或氨基酸测序，从而确定所含蛋白。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤2)为分别从处于不同生长、发育或分化阶段的细胞或组织中提取核蛋白，并分别将这些特定时期的核蛋白与能够封闭所述启动子序列或其片段上非特异性蛋白结合位点的蛋白混合，然后分别将这些混合好的蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合，从而形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，能够封闭所述启动子序列或其片段上非特异性蛋白结合位点的蛋白为BSA蛋白或脱脂奶粉。
全文摘要
本发明提供了一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法，首先将5’或3’端带有生物素的启动子序列或其片段与表面吸附有链亲和素的磁珠结合，形成磁珠-启动子二元复合物，然后从组织或细胞中提取特定时期的核蛋白，与磁珠-启动子二元复合物结合形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物，对该三元复合物进行SDS-PAGE分析，找出差异条带，以确定所要候选目的蛋白的片段长度，然后进行二维电泳分离提纯目的蛋白，并对纯化的目的蛋白进行质谱分析，从而确定所含蛋白。为从转录水平上研究基因表达的调节，寻找新蛋白并了解其对转录调节的作用提供了新思路，并为进一步阐明某些疾病的发病机制及基因治疗奠定了基础。
文档编号C07K1/00GK102887938SQ20121034828
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年2月28日
发明者孟庆勇, 王萌, 高婧, 李宁 申请人:中国农业大学