专利名称：一种蛋白琥珀酸铁的制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种蛋白琥珀酸铁的制备方法。
背景技术：
贫血(aniema)是指循环血液中的红细胞数或血红蛋白长期低于正常值的病理现象。通常贫血分为三类缺铁性贫血(iron deficiency aneima, IDA)、巨幼红细胞性贫血和再生障碍性贫血。缺铁性贫血产生原因主要为血液损失或铁吸收不足所致，如女性月经过多、消化系统溃疡、痔疮等慢性失血性贫血，营养不良、妊娠、儿童生长期等缺铁性贫血。理想的口服补铁药物，必须克服无机铁盐的胃肠道等副反应，使患者有好的顺应性；还要能被患者较好的吸收，最好是在十二指肠内吸收。 蛋白琥珀酸铁在胃内不被胃蛋白酶消化，在中性pH值时却能被胰蛋白酶水解。由于它具有这些独特的特性，蛋白琥珀酸铁受蛋白膜的保护而不被胃酸破坏和胃蛋白酶酶解，对胃黏膜不造成损伤。在进入肠道后，它重新溶解，并被胰蛋白酶所消化。蛋白保护膜被消化后，铁在十二指肠内开始释放。蛋白琥珀酸铁适应症为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍、急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血，妊娠与哺乳期贫血。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备蛋白琥珀酸铁的方法，所述方法制备的蛋白琥珀酸铁具有酰化度高、载铁量大、溶解性好、质量稳定、杂质含量低和疗效显著等优点，所述方法包括如下步骤(a)在反应釜中加入酪蛋白和15倍量水,加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在9. O 10. O使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中按重量比酪蛋白丁二酸酐I : 1-5 I分多次缓慢加入丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在9. O 10. 0，丁二酸酐加完后继续搅拌O. 5h，离心过滤，滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. O 4. 0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加15倍量水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至
9.O 10. 0，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液；(b)将上述琥珀酸蛋白溶液置于反应釜中，琥珀酸蛋白三氯化铁按重量比
I O. I -I I称取三氯化铁，配制I. 85%三氯化铁溶液，在搅拌下缓慢加入配制好的I. 85%三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O 10. 0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌O. 5h，离心过滤，得蛋白琥珀酸铁的滤液；(c)将滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至I. O 4. O,离心，用水洗沉淀·，再加水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O 10. O,使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节PH值至I. O 4. 0，离心，用水洗沉淀，再加水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O 10. 0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经I. 2 μ m陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. O 4. O,使蛋白琥拍酸铁沉淀,离心分离,用去离子水洗漆沉淀；
(d)将沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，沉淀在_40°C时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10 30Pa，以每小时升高2-4°C升温至_20°C，保持8小时；再以每小时升高2-5°C升温至30°C，保持约6小时，破除真空，出箱，得蛋白琥珀酸铁。本发明所述的步骤(a)中，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值优选为9. 5。本发明所述的步骤(a)中，酪蛋白丁二酸酐的重量比优选为2 I。本发明所述的步骤(a)中，3mol/L盐酸溶液调节pH值优选为2. O。本发明所述的步骤(b)中，琥珀酸蛋白三氯化铁的重量比优选为I : 0.28。本发明所述的步骤(b)中，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值优选为9. 5。本发明所述的步骤(C)中，3mol/L盐酸溶液调节pH值优选为2. O。 本发明所述的步骤(C)中，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值优选至9. 5。本发明所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法直接用酪蛋白为原料，反应收率高，产品纯度好。反复精制可以除去可能存在的酪蛋白、丁二酸、氯化钠等杂质。采用冷冻干燥，得到的蛋白琥珀酸铁蓬松，易粉碎，颜色均一，呈棕黄色。冷冻干燥后蛋白琥珀酸铁性状良好，其他指标均符合要求。本发明的又一目的是提供所述的蛋白琥珀酸铁在制备治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍导致的急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血和妊娠与哺乳期贫血。本发明的又一目的提供所述的蛋白琥珀酸铁用于制备药剂的用途，其中该剂型通常用于口服。
具体实施例方式以下的实施例用于说明和进一步解释本发明，但决不限制本发明。如果没有特别指出，本发明中所述的百分比均指重量百分比。一、实施例蛋白琥珀酸铁的制备实施例I(a)制备琥珀酸蛋白于500L反应釜中，加入约105kg水及7. Okg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入7kg 丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 0，丁二酸酐加完后继续搅拌O. 5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. 0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O,使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约108L。取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6. 72kg)。(b)载铁反应根据琥珀酸蛋白三氯化铁按重量比I : O. 1，称取O. 672kg三氯化铁，并配制I. 85%三氯化铁溶液36. 3L。
将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的I. 85%三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌O. 5h,离心过滤。(c)精制滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至I. 0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O,使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. 0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经I. 2 μ m陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。(d)冷冻干燥将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在_40°C时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10Pa，以每小时升高2°C升温至至_20°C，保持约8小 时；再以每小时升高2°C升温至30°C，保持6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6. 18kg，收率91. 8%。实施例2(a)制备琥珀酸蛋白于500L反应釜中，加入约105kg水及7. Okg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. O使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入I. 4kg 丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在10. 0，丁二酸酐加完后继续搅拌O. 5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至4. 0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg 7jC，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. O,使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约105L。取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6. 70kg)。(b)载铁反应根据琥珀酸蛋白三氯化铁按重量比I : 1，称取6. 70kg三氯化铁，并配制I. 85%三氯化铁溶液362L。将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的I. 85%三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. 0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌O. 5h，离心过滤。(C)精制滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至4. O,离心,用水洗沉淀.，再加约192kg水,用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. O,使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调pH值至4. 0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. 0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经I. 2 μ m陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至4. O,使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。(d)冷冻干燥将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在_40°C时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在30Pa，以每小时升高4°C升温至至_20°C，保持约8小时；再以每小时升高5°C升温至30°C，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6. 02kg，收率 89. 9%o实施例3(a)制备琥珀酸蛋白于500L反应釜中，加入约105kg水及7. Okg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 5使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入3. 5kg 丁二酸酐，边加边用4mo/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 5，丁二酸酐加完后继续搅拌O. 5h，离心过滤。取滤液测
定酰化度。滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2. 0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉 淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 5，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约110L。取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6. 92kg)。(b)载铁反应根据琥珀酸蛋白三氯化铁按重量比I : O. 28，称取I. 93kg三氯化铁，并配制I. 85%三氯化铁溶液104L。将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的I. 85%三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 5，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌O. 5h,离心过滤。(C)精制滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至2. 0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 5，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调pH值至2. 0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. 5，使沉淀溶解，然后离心，滤液经I. 2 μ m陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2. 0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。(d)冷冻干燥将去离子水洗涤后的沉淀置冻于箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在_40°C时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在20Pa，以每小时升高3°C升温至至_20°C，保持约8小时；再以每小时升高4°C升温至30°C，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁
6.56kg，收率 95. 6%o实施例4(a)制备琥珀酸蛋白于500L反应釜中，加入约105kg水及7. Okg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. O使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入3. 5kg 丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在10. 0，丁二酸酐加完后继续搅拌O. 5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至3. 0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg 7jC，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. O,使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约115L。取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6. 83kg) ο(b)载铁反应根据琥珀酸蛋白三氯化铁按重量比I : O. 5，称取3. 42kg三氯化铁，并配制I. 85%三氯化铁溶液185L。将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85% 三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. 0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌O. 5h，离心过滤。(C)精制滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至3. 0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10. O,使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至3.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至
10.O,使沉淀溶解，然后离心，溶液经I. 2 μ m陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至3. O，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。(d)冷冻干燥将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在_40°C时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在20Pa，以每小时升高3°C升温至至_20°C，保持约8小时；再以每小时升高3°C升温至30°C，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁
6.05kg，收率 88. 6%o二、试验例试验例I实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁及中间体的质量及稳定性研究采用实施例1-4所制备的蛋白琥珀酸铁样品进行研究。(I)中间体琥珀酰蛋白的酰化度测定本发明所述方法分两步，关键中间体为琥珀酸蛋白，酰化度的检测是为了检查酰化的程度，酰化度高有利于载铁反应的进行和样品的粘度、溶液均一性。所以酰化度是控制中间体琥珀酸蛋白的一个重要指标，对最终产物琥珀酸蛋白铁的质量具有至关重要的影响。我们进行了酰化度测定的方法学研究，并建立了中间体质量控制指标(酰化度大于94% )。方法参照茚三酮测氨基酸含量的经典方法。茚三酮溶液与蛋白质共热，茚三酮与蛋白质中游离的氨基反应生成氨，氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，可通过测定570nm波长处的吸光度，测定游离氨基的含量。仪器UNICO UV-2102PC型紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司测定法及计算方法精密量取酪蛋白对照溶液和供试品溶液各2ml，分别置2个IOml试管,各加Iml显色剂,水浴15min,冷水中冷却至室温,各加40%乙醇5ml,然后分别用水定容至IOml量瓶，放置20min，在570nm波长处测定吸光度，同时做空白校正。计算公式酰化度(％)^X100%
CspxAp
式中Asp为琥珀酸蛋白供试品溶液的吸光度Ap为酪蛋白对照溶液的吸光度Csp为琥珀酸蛋白供试品溶液的浓度Cp为酪蛋白对照溶液的浓度结果琥珀酸蛋白酰化度的结果见表I。表I实施例1-4制备的中间体酰化度结果
权利要求
1.一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (a)在反应釜中加入酪蛋白和15倍重量的水，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在.9.O 10. O使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中按重量比酪蛋白丁二酸酐为I : 1-5 I称取丁二酸酐，分多次缓慢加入丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液控制pH值在9. O .10.O, 丁二酸酐加完后继续搅拌O. 5h，离心过滤，滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. O 4. 0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加15倍重量的水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节PH值在9. O 10. O,使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液； (b)将上述琥珀酸蛋白溶液置于反应爸中，琥珀酸蛋白三氯化铁按重量比I O. I -I I称取三氯化铁，配制I. 85%三氯化铁溶液，在搅拌下缓慢加入配制好的I.85%三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O 10. 0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌O. 5h，离心过滤，得蛋白琥珀酸铁的滤液； (c)将滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I.O 4.0，离心，用水洗沉淀.，再加水,用.4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9. O 10. 0，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. O 4. O,离心,用水洗沉淀,再加水,用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至.9.O 10. 0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经I. 2 μ m陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至I. O 4. O,使蛋白琥拍酸铁沉淀,离心分离,用去离子水洗漆沉淀； (d)将沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，沉淀在_40°C时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10 30Pa，以每小时升高2-4°C升温至_20°C，保持8小时；再以每小时升高2-5°C升温至30°C，保持约6小时，破除真空，出箱，得蛋白琥珀酸铁。
2.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(a)中所述的4mol/L氢氧化钠溶液调节PH值优选为9. 5。
3.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(a)中所述的酪蛋白丁二酸酐的重量比优选为2 I。
4.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(a)中所述的3mol/L盐酸溶液调节pH值优选为2.0。
5.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(b)中所述的琥珀酸蛋白三氯化铁的重量比优选为I : 0.28。
6.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(b)中所述的4mol/L氢氧化钠溶液调节PH值优选为9. 5。
7.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(c)中所述的3mol/L盐酸溶液调节pH值优选为2.0。
8.根据权利要求I所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法，步骤(c)中所述的4mol/L氢氧化钠溶液调节PH值优选为9. 5。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法所获得的蛋白琥珀酸铁在制备治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍导致的急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血和妊娠与哺乳期贫血。
10.一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-8任一项所述的方法获得的蛋白琥珀酸铁，该制剂为口服制剂。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其制备的蛋白琥珀酸铁具有酰化度高、载铁量大、溶解性好、质量稳定、杂质含量低和疗效显著等优点。
文档编号C07K14/435GK102838667SQ20121035852
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者曹龙祥, 董自波, 牛犇, 鲁亚洲, 邵建国 申请人:江苏济川制药有限公司