专利名称：一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，属于基因工程蛋白质技术领域。
背景技术：
膜蛋白在生命活动中承担着重要的生物学功能，包括信号传导，物质运输和能量代谢的各个方面。由于膜蛋白特殊的结构和功能，它们成为了多种药物作用的主要靶点。虽然跨膜蛋白有着如此重要的生物学功能，但是由于其丰度低、疏水性强，具有微观不均一性，分离纯化天然膜蛋白并做结晶具有很大的难度。因此，利用基因工程方法表达重组膜蛋白仍然是研究膜蛋白的另一条有效的途径。大肠杆菌是膜蛋白表达尝试中最常用的表达宿主，通过对表达载体、宿主菌、培养基和表达条件的筛选，获得膜蛋白的成功表达是膜蛋白研究中极为关键的一步。然而，目前天然膜蛋白表达量低，纯化困难等，本发明利用基因工程的方法构建了重组菌，诱导的重组蛋白经镍离子亲和层析柱一步纯化等简易的技术可以得到纯度较高的重组蛋白，克服了天然膜蛋白面临的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a- Bm-MMgT,诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后经30mM、50mM浓度的咪唑水溶液洗掉未结合的蛋白，200mM浓度的咪唑水溶液洗脱重组目的蛋白，可以得到纯度较高的重组目的蛋白。为达到上述目的，本发明提供一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，包括以下步骤
(a)Bm-MMgT基因的合成；
(b)分别双酶切Bm-MMgT基因和载体，连接构建重组表达载体；
(c)转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白；
(d)纯化所得重组目的蛋白。优选地，其中所述步骤(a)具体包括
(1)设计上游引物F: 5 -CTGGAATTCATGGCTTCATTTC-3 (下划线为 EcoR I 位点)
下游引物 R: 5，-CAGCTCGAGTCATTCTAGATTTTCTAG-3，(下划线为通ο I 位点)；
(2)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为95°C预变性5min，95°C变性35s，52。。退火35s，72。。延伸40s，循环30次；最后72°C延伸5min，回收产物；
(3)以步骤(2)的回收产物为模板，用所设计引物F2和R第2次扩增目的片段，具体程序同上，最后回收产物，得到Bm-MMgT基因。优选地，其中所述步骤(b)具体包括
Bm-MMgT基因和/ ET-32a载体利用EcoR I和Xho I同时进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high进行连接30min并转化万.co/i TGl感受态细胞,挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT。优选地，其中所述步骤(C)具体包括
将重组好的表达载体转化至疋co7iBL21中，在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C, 220 rpm振荡培养至0D600=0. 5，加入终浓度为I mM的IPTG，37°C诱导表达5h，得到重组目的蛋白。优选地，其中所述步骤(d)具体包括
(1)将得到的可溶的重组目的蛋白通过O.45 μ m纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用浓度为20Mm、50mM、lOOmM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑水溶液进行洗涤；
(2)经洗涤条件的摸索(取IOml的上清液与2ml的镍离子亲和层析柱填料结合，室温孵育lh，以步骤(I)中所述的咪唑浓度进行洗脱，每个浓度洗涤20ml，其中上述上清液为所 述步骤(c)所得重组目的蛋白经超声(超声功率为60%，超声总时间为4s，停3s，超Is)破碎后，12000rpm离心后的上清液，用浓度为30mM、50mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱重组目的蛋白。优选地，其中所述方法在步骤(a)之前还包括
经家蚕蚕蛹cDNA文库筛选，筛选出一条家蚕膜镁转运蛋白(Bm-MMgT)，经TMHMM服务器(http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)对该蛋白进行跨膜分析,发现此蛋白是含有一个跨膜区的膜蛋白(是为了预测BmMMgT基因表达出的蛋白是一个一次跨膜蛋白)。本发明通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT，诱导表达得到大量重组目的蛋白，重组目的蛋白经镍离子亲和层析柱一步纯化等简易的技术可以得到纯度较高的重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础；膜蛋白的表达和纯化就本身而言是一个世界性的难题，此文用基因工程的手段成功表达了膜蛋白且以可溶性的形式存在，是目前研究膜蛋白的另一种途径；此外，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。
图I是本发明Bm-MMgT基因的PCR扩增回收结果图；M DNA Ladder Mix ；1 :二次PCR扩增条带；
图2是本发明pET-32a-Bm-MMgT重组表达载体的PCR和双酶切鉴定图M DNA LadderMix ；1 PCR的产物；2 :双酶切的产物；
图3是本发明重组目的蛋白的表达图M :蛋白分子量标准；1 pET-32a(+)空载诱导对照；2 :pET-32a(+)-Bm-MMgT 未诱导对照；3 :pET_32a (+)-Bm-MMgT 诱导表达；
图4是本发明重组目的蛋白在上清、沉淀中的分布图；M :蛋白分子量标准；I pET-32a(+) -Bm-MMgT未诱导对照；2 :超声后的上清；3 :超声后的沉淀；
图5是本发明重组目的蛋白在不同浓度下咪唑水溶液的洗涤图。M :蛋白分子量标准；I 20mM ；2 50mM ；3 IOOmM ；4 150mM ；4 200mM ；5 300mM ；6 500mM ；
图6是本发明重组目的蛋白的纯化图；M :蛋白分子量标准；1 :原液；2 :穿透液；3 :纯化后的重组目的蛋白；
图7A是本发明重组目的蛋白的电泳图；图7B是本发明重组目的蛋白的Western blotting鉴定 图8是本发明重组目的蛋白的质谱鉴定图。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本发明提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。实施例I :引物设计
扩增Bm-MMgT目的基因，基因序列如SEQ ID NO. I所示，引物设计如下
F: 5’ -CTGGAATTCATGGCTTCATTTC-3，(下划线为 EcoR I 位点)
R: 5，-CAGCTCGAGTCATTCTAGATTTTCTAG-3，(下划线为通ο I 位点)
实施例2 pET-32a-Bm-MMgT重组表达载体的构建
(1)以家蚕蚕蛹cDNA(购自Fermentas公司)为模板，用实施例I所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为95°C预变性5min，95°C变性35s，52°C退火35s，72°C延伸40s，循环30次；最后72°C延伸5min ；
在50 μ L离心管中，加入下列组分
ddH2032. 5 μ L
TAQ Buffer5 μ L
2mM dNTPs5 μ L
FI. 5μ L
R1. 5μ L
cDNA3 μ L
TAQ Polymerase (2U/ μ L)1. 5 μ L
各组分混合均匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时割胶回收目的片段；
(2)以步骤(I)中回收产物为模板，用实施例I所设计引物F和R第2次扩增目的片段，具体程序同上；最后回收的片段如图I所示(说明BmMMgT基因片段已成功获得)；
(3)将第2次PCR割胶回收产物和pET-32a载体(购自Fermentas公司)利用EcoR I (购自Fermentas公司)和Xho I (购自Fermentas公司)同时进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high (购自Τ0Υ0Β0)进行室温连接30min，并转化到疋co7iTGl感受态细胞(购自Fermentas公司)中；挑取单菌落摇菌培养后利用质粒提取试剂盒(购自康为世纪生物科技公司)抽提质粒，用PCR和双酶切进行鉴定，挑选pET-32a-Bm-MMgT重组表达载体，将重组好的表达载体进行双酶切、PCR鉴定如图2所示，说明克隆成功，并送华大基因测序，其结果与预期相同。实施例3 :重组目的蛋白的表达
将实施例2重组好的表达载体转化至万.co7iBL21 (购自Fermentas公司)中得到重组菌，在含50 mg/mL氨节青霉素(上海恒远生物科技有限公司)的LB培养基(购自Oxoid公司)中37°C，220 rpm振荡培养至0D600 ^ O. 5，加入IPTG (终浓度I mM)，37°C诱导培养5h，取I. 5mL菌液12000rpm离心后，将沉淀加入50 μ L I X PBS重悬，然后取40 μ L，加入IOyL 5Χ上样缓冲液，于100°C煮lOmin，然后在12000rpm下离心5min得到重组目的蛋白样品，取15yL走12% SDS-PAGE，结果如图3示，表明利用上述方法成功表达了含有HIS标签的重组目的蛋白且表达量很高。将重组菌扩大培养，超声(超声的目的是为了让菌体破碎，释放出包裹在里面的蛋白)后分别取上清和沉淀制备蛋白样品，走12%SDS-PAGE，如图4所示，结果说明该重组目的蛋白是以可溶的形式存在于缓冲液中。
实施例4 :重组目的蛋白的纯化 后，与镍离子亲和层析柱(购自GE Healthcare)结合，用浓度为20mM、50mM、lOOmM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑水溶液进行洗涤，分别取不同浓度的咪唑水溶液的洗脱液加入10 μ L 5Χ上样缓冲液,于10(TC煮IOmin,然后在12000rpm下离心5min制备蛋白样品,走12%SDS-PAGE，结果如图5所示，说明20mM、50mM浓度的咪唑水溶液可以洗去几乎所有与镍柱未结合的蛋白，IOOmM浓度的咪唑水溶液就可以洗下重组目的蛋白；
(2)经洗涤条件的摸索，SDS-PAGE发现，用浓度为30mM、50mM的咪唑水溶液可以洗脱未结合在柱子上的杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液可以洗脱下所有的重组目的蛋白且纯度很高，纯化后的蛋白走12%SDS-PAGE，结果如图6所示(图6所选的洗脱杂蛋白的咪唑条件是以实施例3中的洗脱条件为基础的，图6表明重组目的蛋白可以通过镍离子亲和层析柱一步纯化可得到纯度较高的目的蛋白)。实施例5 :重组目的蛋白的鉴定
由于重组目的蛋白带有HIS标签，所以用HIS的抗体(二抗用辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，上海江莱生物科技有限公司)作为一抗鉴定重组目的蛋白，如图7A、图7B所示，结果表明重组目的蛋白已成功表达。重组目的蛋白经挖点打质谱鉴定如图8所示，图8中显示的肽指纹图谱与NCBI数据库比对，结果表明所表达的未知重组目的蛋白确定为家蚕膜镁转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a_ Bm_MMgT，诱导表达得到大量重组目的蛋白，重组目的蛋白经镍离子亲和层析柱一步纯化等简易的技术可以得到纯度较高的重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础；此外，该方法还解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。以上所述，仅为本发明的实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做若干的改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
权利要求
1.一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤 (a)Bm-MMgT基因的合成； (b)分别双酶切Bm-MMgT基因和载体，连接构建重组表达载体； (c)转化表达菌，培养，诱导表达重组目的蛋白； (d)纯化所得重组目的蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)具体包括 (1)设计上游引物F:5’ -CTGGAATTCATGGCTTCATTTC-3’，其中下划线为EcoR I位点； 下游引物 R: 5 ’ -CAGCTCGAGTCATTCTAGATTTTCTAG-3 ’，其中下划线为 ZAo I 位点； (2)以家蚕蚕蛹cDNA为模板，用所设计引物F和R扩增特异性片段，具体程序为95°C预变性5min，95°C变性35s，52。。退火35s，72。。延伸40s，循环30次；最后72°C延伸5min，回收产物； (3)以步骤(2)的回收产物为模板，用所设计引物F2和R第2次扩增目的片段，具体程序同上，最后回收产物，得到Bm-MMgT基因。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括 Bm-MMgT基因和/ ET-32a载体利用EcoR I和Xho I同时进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high进行连接30min并转化万.co/i TGl感受态细胞,挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT通过质粒提取试剂盒提取。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)具体包括 将重组好的表达载体转化至疋coli BL21中，在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C，220 rpm振荡培养至0D600=0. 5，加入终浓度为I mM的IPTG，37°C诱导表达5h，得到重组目的蛋白。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)具体包括 (1)将得到的可溶的重组目的蛋白通过O.45 μ m纤维素膜过滤后，与镍离子亲和层析柱结合，用咪唑水溶液进行洗涤； (2)经洗涤条件的摸索，用浓度为30mM、50mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱重组目的蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中咪唑水溶液的浓度为20Mm、50mM、lOOmM、150mM、200mM、300mM、500mM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中洗涤条件的摸索的具体操作为取IOml的上清液与2ml的镍离子亲和层析柱填料结合，室温孵育lh，以所述步骤⑴中所述咪唑水溶液的浓度进行洗脱，每个浓度洗涤20ml ;其中上述上清液为所述步骤(c)所得重组目的蛋白经超声破碎后，12000rpm,室温离心后的上清液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中超声功率为60%，超声总时间为4s。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(a)之前还包括 经家蚕蚕蛹cDNA文库筛选，筛选出一条家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT，经TMHMM服务器http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM对该蛋白进行跨膜分析,得知此蛋白是含有一个跨膜区的膜蛋白。·
全文摘要
本发明涉及一种家蚕膜镁转运蛋白Bm-MMgT的表达纯化方法。通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a-Bm-MMgT，诱导表达得到大量重组目的蛋白，重组目的蛋白经镍离子亲和层析柱一步纯化等简易的技术可以得到纯度较高的重组目的蛋白，为以后研究其三维结构和生物学功能奠定了极其重要的基础，该还方法解决了天然膜蛋白表达量低、难纯化的问题。
文档编号C07K1/36GK102943088SQ20121040700
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者张耀洲, 田凤鸣, 李 杰, 陈剑清, 舒特俊 申请人:天津耀宇生物技术有限公司