专利名称：一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺。
背景技术：
南极磷奸(Euphausia superba)又名大磷奸或南极大磷奸,是一种生活在南冰洋的南极洲水域的磷虾。南极磷虾资源丰富，据估计最高有数亿吨之巨可捕量，是世界现有渔业产量的I倍以上，具有巨大的开发和利用潜力。世界主要渔业国家为日本和波兰。产品在日本主要用作为料理，而世界上其他地方则作为动物饲料及鱼饵。在世界海洋渔业资源普遍衰退的背景下，南极磷虾资源日益受到世界各国关注。
据报道，南极磷虾中含有丰富的磷脂成分，磷脂中富含被称为“抗脂肪肝因子”的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，缩写PC，又称卵磷脂)，其对脂肪肝、脂肪代谢障碍、动脉硬化症、皮肤病以脑血管、心血管等微血管疾病有效；还能防止高血压、治疗皮肤干癣。磷脂酰胆碱可直接作为注射剂使用，更是脂肪输液的乳化剂。磷脂酰胆碱也可用来作为脂质体，如一些毒性较强的药物如抗癌药物顺钼的包被载体，能使抗癌药物顺利通过以磷脂作为构成成份的细胞膜。我国治疗肝病的珍贵药物“肝得健”即是以磷脂酰胆碱为主要成分。 此外，磷脂酰胆碱在高级涂料，高级化妆品、农药、杀虫剂、纺织品、石油制品(如橡胶)、电子工业等方面也具有不同的优良用途。
我国南极磷虾现已进入探捕阶段，约I 2年后开始大量捕捞，届时面临的主要问题是南极磷虾的深加工利用。国外对南极磷虾的加工主要是制备南极磷虾虾油，其中磷脂含量约占40%，磷脂酰胆碱是虾油磷脂的主要成分，虾油有可能成为最佳的磷脂酰胆碱加工的原料，生产南极磷虾虾油，生产南极磷虾磷脂酰胆碱，均需要定性定量检测PC的含量。检测过程中需要南极磷虾PC的标准品标定。制备南极磷虾PC标准品是未来南极磷虾深加工产品检测的关键。PC标准品本身也是一种产品。发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，步骤如下
(I)取干南极磷虾(含水量为8% 10%) IOOg,加入500 600ml的正己烷，20 35°C下搅拌提取3次，每次提取lh，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并提取液(约 1350 1700ml)，在 30 45。。，-O. 07 -O. 09Mpa 下旋转蒸发，得虾油(约 4. 5 5. 5g)；
(2)向步骤(I)所得的虾油中加入5 7倍(指质量体积倍数，即Ig物料加入5 7ml液体，下同)的丙酮，20 35°C下搅拌提取6次，每次提取O. 5h，提取液过滤，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液(约135 210ml )，在30 40°C，-O. 07 -O. 09Mpa 下旋转蒸发，得含磷脂的油状样品液；
(3)层析柱的制备称取65 75g娃胶，110 120°C下活化6 IOh ；向娃胶中加入3倍氯仿(质量体积倍数)，搅拌成浆状；采用湿法装柱法将硅胶装入到3 X 30cm2层析柱中，静置，使硅胶充分沉降至体积稳定不变；
(4)取步骤(2)所得含磷脂的油状样品液I. 5 3ml，缓缓加入到层析柱内，用氯仿甲醇=1 :1 2 (体积比)洗脱液洗脱，流速为2 3ml/min,按每份100 300ml收集洗脱液；
(5)将收集的各份洗脱液浓缩，薄层层析定性鉴定各份洗脱液组分，将具单一磷脂酰胆碱组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得磷脂酰胆碱标准品(约8 12mg)，经HPLC检测，磷脂酰胆碱的纯度> 98%。
所述南极磷虾磷脂酰胆碱(PC)的薄层层析定性检测方法为
薄层层析使用GF254硅胶薄层板，展开剂为氯仿甲醇水:乙胺=14 6 0. 6 5(V VV V),展距为6cm，取各洗脱液的浓缩液点样，展毕后晾干，放入溴百里酚蓝染液缸中染色12秒；取出后晾干，将干燥后的薄层板放在薄层扫描仪上观察PC的Rf值为O. 37。
所述南极磷虾磷脂酰胆碱(PC)的HPLC定量检测方法为
采用美国(waters)HPLC 仪，2489 紫外光检测器，S印ax HP-silica (4. 6 X 250mm 5um)色谱柱，以甲醇作流动相，流速lml/min，柱温35°C，检测波长206nm，进样量10ul，PC 出峰时间为6 7分钟，检测纯度98% 98. 9%ο
本发明首先用正己烷从干的南极磷虾中提取出虾油，经丙酮提取除杂质，采用硅胶柱层析分离纯化南极磷虾PC标准品，经高压液相分析检测，PC纯度> 98%。
本发明制备了南极磷虾磷脂酰胆碱标准品，为未来南极磷虾深加工产品的检测做出了贡献。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例I制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品
步骤为
(I)干南极磷虾100g，加入正己烷600ml，20°C下搅拌提取3次，每次lh，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液(1700ml )，在30°C，-O. OSMpa下旋转蒸发除去正己烧，得奸油5. 5g。
(2)向上述制备的虾油中加入丙酮30ml，25°C下搅拌提取6次，每次提取O. 5h，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液(180ml)，滤液在30°C，-O. 08Mpa下旋转蒸发除去丙酮，得含磷脂的油状样品液4ml。
(3)称取硅胶(200 300目)65g，110°C活化6h，向硅胶中加入195ml氯仿搅拌成浆状，采用湿法装柱法将硅胶装入到层析柱(3 X 30cm2)中，静置，使硅胶充分沉降至硅胶体积稳定不变。
(4)取步骤(2)制备的样品液I. 5ml，缓缓加入层析柱内，用氯仿甲醇=1 1 (体积比)洗脱液洗脱，流速为2. 5ml/min，按每份IOOml收集洗脱液，浓缩。薄层层析定性鉴定洗脱液组分，将具有单一 PC组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得PC标准品8mg，经HPLC检测，PC纯度为98%。
南极磷虾磷脂酰胆碱(PC)的薄层层析定性检测方法为
薄层层析使用GF254硅胶薄层板，展开剂为氯仿甲醇水乙胺=14 6 0. 6 5(V VV V),展距为6cm，取各洗脱液的浓缩液点样，展毕后晾干，放入溴百里酚蓝染液缸中染色12秒；取出后晾干，将干燥后的薄层板放在薄层扫描仪上观察PC的Rf值为O. 37。
南极磷虾磷脂酰胆碱(PC)的HPLC定量检测方法为
采用美国(waters)HPLC仪。，2489 紫外光检测器，S印ax HP-silica (4. 6 X 250mm 5um)色谱柱，以甲醇作流动相，流速lml/min，柱温35°C，检测波长206nm，进样量10ul，PC 出峰时间为6 7分钟，检测纯度98% 98. 9%ο
实施例2制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品
步骤为
(I)干南极磷奸IOOg,加入正己烧500ml, 25 °C下搅拌提取3次,每次Ih,每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液(1350ml )，在45°C，-O. 07Mpa下旋转蒸发除去正己烧，得Φ下油4. 5g。
(2)向制备的虾油中加入丙酮22. 5ml，20°C下搅拌提取6次，每次提取O. 5h，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液(135ml)，滤液在40°C，-O. 07Mpa下旋转蒸发除去丙酮，得含磷脂的油状样品液4ml。
(3)称取硅胶(200 300目)68g，115°C活化8h，向硅胶中加入204ml氯仿搅拌成浆状，采用湿法装柱法将硅胶装入到层析柱(3 X 30cm2)中，静置，使硅胶充分沉降至硅胶体积稳定不变。
(4)取步骤(2)制备的样品液2ml，缓缓加入层析柱内，用氯仿甲醇=1 1. 5洗脱液洗脱，流速为2ml/min，按每份300ml收集洗脱液，浓缩，薄层层析定性鉴定洗脱液组分。 将具有单一 PC组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得PC标准品10mg，经HPLC检测，PC纯度为 98. 5%ο
实施例3制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品
步骤为
(I)干南极磷奸IOOg,加入正己烧550ml, 35 °C下搅拌提取3次,每次Ih,每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液(1500ml )，在35°C，-O. 09Mpa下旋转蒸发除去正己烧，得奸油5g。
(2)向制备的虾油中加入丙酮35ml，35°C下搅拌提取6次，每次提取O. 5h，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并三次的提取液(210ml)，滤液在40°C，-O. 09Mpa下旋转蒸发除去丙酮，得含磷脂的油状样品液4ml。
(3)称取硅胶(200 300目)75g，120°C活化10h，向硅胶中加入225ml氯仿搅拌成浆状，采用湿法装柱法将硅胶装入到层析柱(3 X 30cm2)中，静置，使硅胶充分沉淀至体积稳定不变。
(4)取步骤(2)制备的样品液3ml，缓缓加入层析柱内，用氯仿甲醇=1 :2洗脱液洗脱。流速为3ml/min每份200ml，收集洗脱液，浓缩，薄层层析定性鉴定洗脱液组分。将具有单一 PC组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，得PC标准品12mg。经HPLC检测，PC纯度为 98. 9%。
权利要求
1.一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，其特征在于步骤如下(1)取干南极磷虾100g，加入500 600ml的正己烷，20 35°C下搅拌提取3次，每次提取lh，每提取一次，过滤将干南极磷虾滤出；合并提取液，在30 45°C，-O. 07 -O. 09Mpa 下旋转蒸发，得虾油；(2)向步骤(I)所得的虾油中加入5 7倍的丙酮，20 35°C下搅拌提取6次，每次提取O. 5h，提取液过滤，每提取一次，过滤得滤液和滤渣；合并6次的滤液，在30 40 °C, -O. 07 -O. 09Mpa下旋转蒸发,得含磷脂的油状样品液；(3)层析柱的制备称取65 75g娃胶，110 120°C下活化6 IOh；向娃胶中加入3 倍氯仿，搅拌成浆状；采用湿法装柱法将硅胶装入到3 X 30cm2层析柱中，静置，使硅胶充分沉降至体积稳定不变；(4)取步骤(2)所得含磷脂的油状样品液I.5 3ml，缓缓加入到层析柱内，用氯仿甲醇=1 :1 2洗脱液洗脱，流速为2 3ml/min，按每份100 300ml收集洗脱液；(5)将收集的各份洗脱液浓缩，薄层层析定性鉴定各份洗脱液组分，将具单一磷脂酰胆碱组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，即得磷脂酰胆碱标准品。
2.根据权利要求I所述的一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，其特征在于 所述硅胶为200 300目的硅胶。
全文摘要
本发明公开了一种制备南极磷虾磷脂酰胆碱标准品的工艺，步骤如下(1)取干南极磷虾，加入正己烷，搅拌提取3次，合并提取液，旋转蒸发，得虾油；(2)向虾油中加入丙酮，搅拌提取6次，合并滤液，旋转蒸发，得含磷脂的油状样品液；(3)制备层析柱；(4)取步骤(2)所得含磷脂的油状样品液1.5～3ml，缓缓加入到层析柱内，用氯仿-甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液；(5)将收集的各份洗脱液浓缩，薄层层析定性鉴定各份洗脱液组分，将具单一磷脂酰胆碱组分的浓缩液合并，蒸发除去溶剂，即得磷脂酰胆碱标准品，经高压液相分析检测，PC纯度≥98%。本发明制备了南极磷虾磷脂酰胆碱标准品，为未来南极磷虾深加工产品的检测做出了贡献。
文档编号C07F9/10GK102911201SQ20121041093
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者魏山山, 刘代成 申请人:山东师范大学