新型癌症标记物的制作方法

文档序号:3544981阅读:256来源:国知局
专利名称:新型癌症标记物的制作方法
技术领域
本发明涉及一种用于癌症中基因启动子的超甲基化(hypermethylation)的新型标记物。更具体地说,本发明涉及一种测定在呼吸消化系统(aero-digestivesystem)内是否发生肿瘤,或者测定受试者对这种肿瘤进行治疗后是否复发的方法。本发明的方法包括测定一个或多个特定基因的启动子区域/序列中CpG位点的甲基化状态。本发明还涉及对这种甲基化的基因的使用和用来测定癌症的诊断试剂盒。
背景技术
在人类癌症中,受损的表观遗传学调节与基因突变同样普遍。这些机理在数量上和质量上发生了会导致选择性生长优势的基因表达变化,而这可能产生癌性转变的结果。在与转录失活有关的基因启动子内的异常超甲基化的CpG岛是癌症中最常见的表观遗传学变化(epigenetic change)。由于疾病的早期测定可能提高大多类型癌症的临床疗效结果,因此,对与癌症有关的异常的基因甲基化的确定反映了具有前景的新型生物标记物。对于呼吸消化系统中的癌症(包括结肠直肠癌)来说,开始的研究已经确定了异常甲基化的DNA在患者血液和粪中的存在。由于对高危腺瘤和低危时期癌瘤进行早期测定的潜在临床效应,已经存在于良性肿瘤中且仅少见于正常粘膜中高频率异常超甲基化的基因可能成为良好的候选诊断生物标记物。然而,通常现有的用于呼吸消化系统癌症的早期标记物的灵敏度和特异性依然很差,并且到目前为止,仅少量的实际被筛选用于甲基化的基因显示了理想较高的灵敏度和特异性。根据马勒等人(Muller et al.)和陈等人(Chen et al.)的报道,在VIM (波形蛋白)和SFRP2中发现了特异性超甲基化,并且最近在来自林德等人(Lind et al)的报道中提出ADAMTS1和CRABPl在结肠直肠肿瘤中具有高频率的癌症特异性超甲基化,而NR3C1的超甲基化频率却要低得多。林德等人还确定了 18种作为结肠直肠癌的潜在标记物的基因。在莫里等人(Mori et al.)的研究中,鉴于MAL的甲基化频率低(对应于仅6%的甲基化(2/34样品)),得出了林德等人所讨论的18种候选基因之一的T细胞分化蛋白MAL可能不是合适的用于呼吸消化道癌症的诊断生物标记物的结论。发明人对18种候选基因中的多个进行的进一步的分析也没有产生推动性的结果=NDRGl在所有被分析样品中未被甲基化;NR3C1虽然被甲基化,但是仅发生为非常低的频率,而且在随后的SDHA序列分析中不能证实该基因一致性,从而使其不适于作为癌症发展的标记物。总而言之,不存在有这种启示任何由林德等人所讨论的基因可以对目前的癌症检测技术做出改进。因此需要这样一组基因,其中的各个基因在癌症中被高频率且特异性地超甲基化。更具体地,需要这样一组基因该基因在非侵入技术(例如涉及使用粪便样品的技术),或在可以用在易于获得的样品材料(例如血液或粘液)上的技术中是有用的。这种基因组可以极大地改进对这些癌症进行早期检测的可能。最终的目标可以为开发对仅少数(例如两种或三种)高频率的基因标记物中的超甲基化作用进行测定的诊断测试。因此,需要确定其他的基因,在这些基因中,启动子区域内的CpG岛在癌症中以高频率被超甲基化。

发明内容
本发明建立在发明人对以下的实现由林德等人确定为潜在标记物的特定基因亚群具有在呼吸消化癌症中以非常高的频率被甲基化的CpG位点。因此,本发明的一个目的是提供一组用于癌症(例如呼吸消化系统中的癌症,特别是结肠癌和结肠直肠癌)的诊断标记物。该组标记物解决了用于癌症的大多数已知标记物中甲基化低特异性和低频率的问题。
因此,本发明的一方面涉及一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法,该方法包括以下步骤a)测定从所述受试者获得的样品中的至少一个基因内的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,其中,所述基因选自由以下所组成的组中CNRIP1,例如由恩萨姆博(ensembl)(基因组结构注释数据库)基因编号ENSG00000119865、恩垂兹(entrez)(美国国家生物技术信息中心提供的在线资源检索系统)编号25927所确定;SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;FBNl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定;SNCA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000145335、entrez 编号 6622 所确定;和INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。该方法还可以包括以下步骤b)与参照物比较甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态;和c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态高于参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则将所述受试者确定为可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发,如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于所述参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则将所述受试者确定为不太可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发。本发明的另一方面涉及一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法,该方法包括以下步骤a)测定来自受试者的样品内的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态b)构建得自健康人群样品的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态的百分位数图;c)基于健康人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态并基于患有癌症人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,构建ROC (受试者操作特性)曲线;d)从ROC曲线中选择所期望的灵敏度和特异性的结合;e)从百分位数图测定相应于所测定的或选择的特异性的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态;和f)如果样品中的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态等于或高于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则预测受试者可能患有癌症,并且如果样品中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则预测受试者不太可能患有癌症。 本发明还涉及用来测定癌症的诊断试剂盒,该诊断试剂盒含有一个或多个寡核苷酸引物或一组或多组寡核苷酸引物,它们中的每一个与选自以下的基因的核苷酸序列互补CNRIPl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定;SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;FBNl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定;SNCA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000145335、entrez 编号 6622 所确定;和INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。本发明还涉及本发明的标记物的应用。因此,本发明进一步涉及一个或多个选自由以下所组成的组中的基因在诊断分析中的应用CNRIPl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定;SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;FBNl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定;SNCA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000145335、entrez 编号 6622 所确定;和INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定;其中,对甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态进行评价,作为受试者是否发生了、正在发生或易于发生癌症、或受试者是否在癌症治疗后复发的指示物。此外,本发明涉及核酸序列在诊断分析中的应用,其中,所述核酸含有选自由以下所组成的组中的核酸序列A)由 SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. : 13、SEQ ID NO. : 14和SEQ ID NO. :16中的任意一个所定义的核酸序列;B)与所述A)中所定义的序列互补的核酸序列;C)所述A)或B)中所定义的核酸序列的子序列;D)与所述A)、B)或C)中所定义的序列至少75% —致的核酸序列其中,对甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态进行评价,作为受试者是否发生了、正在发生或易于发生癌症、或受试者是否在癌症治疗后复发的指示物。
本发明还提供了识别甲基化的核酸序列的抗体,所述核酸序列选自由以下所组成的组中A)由 SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. : 13、SEQ ID NO. : 14和SEQID NO. :16中的任意一个所定义的核酸序列;B)与所述A)中所定义的序列互补的核酸序列;C)所述A)或B)中所定义的核酸序列的子序列;D)与所述A)、B)或C)中所定义的序列至少75% —致的核酸序列。


图1表示了代表性的甲基化特异性聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应是由于对三种粘膜样品、三种腺瘤和三种癌瘤中的MAL进行分析而进行的。泳道(lane) U中的可见PCR广物说明了存在未被甲基化的等位基因,而泳道M中的PCR广物说明了存在被甲基化的等位基因。缩写A,腺瘤;C,癌瘤;N,正常粘膜;P0S,含有正常血液(针对未被甲基化样品的对照)以及体外被甲基化的DNA (针对甲基化的样品的对照)的阳性对照;NEG,阴性对照(含有水作为模板);U,用于未被甲基化的MSP产物的泳道;M,用于被甲基化的MSP产物的泳道。本图示出了两组凝胶板的拼接(merge),因为腺瘤在独立的凝胶上电泳。图2-4图2-4示出了对最初被甲基化的细胞系进行表观遗传药物(epigeneticdrug)处理之后的基因表达的上调。单独使用脱甲基5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷和与脱乙酰基酶抑制剂曲古抑菌素A结合使用进行处理后,在结肠癌细胞系中发现了上调的CNRIPUINA和SPG20的mRNA表达。这些组分别(以线性比例的方式)示出了在单独使用5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷(IuM和10uM)、曲古抑菌素A以及结合使用这两种药物(I μ M的5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷和O. 5 μ M的曲古抑菌素Α)对六份结肠癌细胞系(即,ΗΤ29、SW48、HCT15、SW480.RK0以及LS1034)进行处理之后,该六份结肠癌细胞系中的CNRIP1、INA以及SPG20的相对表达值。两种剂量(一种高,一种低)的5-氮杂-2’ -脱氧胞喃唳核苷在所有三个基因的相对表达值中产生类似的增大。这意味着,可以通过存在低剂量的5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷的情况下对它们进行培养来实现细胞系的脱甲基化,考虑到该药物的细胞毒性,这是有利的。对于CNRIPl和INA而言,相比于单独使用5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷和单独使用曲古抑菌素A进行处理,这两者的结合处理更加有效。结合处理还提高了 SPG20的表达,然而,可以通过单独使用5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷进行处理来达到类似的或者更高的再活化。如所预期的,单独使用脱乙酰基酶抑制剂曲古抑菌素A进行处理不会提高CNRIP、INA或者SPG20的基因表达。缩写AZA,5_氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷;TSA,曲古抑菌素A。图5示出了 MAL启动子在正常结肠粘膜样品和结肠直肠癌瘤中的甲基化状态。图中示出了甲基化特异性聚合酶链式反应的具有代表性的结果。泳道U中的可见PCR产物说明了存在未被甲基化的等位基因,而泳道M中的PCR广物说明了存在被甲基化的等位基因。N,正常粘膜;c,癌瘤;Pos,阳性对照(未被甲基化的反应来自正常血液的DNA;甲基化反应体外被甲基化的DNA) ;Neg,阴性对照(含有水作为模板);U,用于未被甲基化的MSP产物的泳道;M,用于被甲基化的MSP产物的泳道。图6示出了 MAL启动子中的位点特异性甲基化。对MAL启动子进行亚硫酸氢盐测序可以核实由甲基化特异性聚合酶链式反应所评价的甲基化状态。附图上部分是CpG位点经两个被分析的亚硫酸氢盐测序的片段(即,A (右侧的第-68至第+168)和B (左侧的第-427至第-85))成功扩增之后的示意图。转录起始位点由+1表示,垂直块表示单个CpG位点的位置。两个箭头说明了 MSP引物的位置。对于附图的下部分而言,实心圆表示被甲基化的CpG ;空心圆表示未被甲基化的CpG ;而具有斜杠的空心圆表示被部分甲基化的位点(除胸腺嘧啶之外,还存在大约20-80%的胞嘧啶)。位于所述附图下部分右侧的U、M和U/M的量列出了通过使用MSP分析所评价的各个细胞系的甲基化状态。缩写MSP,甲基化特异性PCR;s,正义;as,反义;U,未被甲基化的;M,被甲基化的;U/M,存在未被甲基化的和被甲基化的条带。 图7示出了 MAL启动子的“亚硫酸氢盐测序”。该图为结肠癌细胞系中的MAL启动子的代表性亚硫酸氢盐测序电泳图。所述亚硫酸氢盐测序电泳图覆盖了相对于转录起始位点的第+11至+15的CpG位点。CpG位点中的胞嘧啶由黑色箭头表示,而已经被转换为胸腺嘧啶的胞嘧啶被标有红色下划线。在此所示的MAL启动子测序电泳图来自未被甲基化的V9P细胞系和超甲基化的ALA和 HCTl16。图8示出了癌症细胞系和结肠直肠癌瘤中的MAL表达。在体外模型中,MAL的启动子超甲基化是与基因表达的减小或者丧失有关的。MAL定量基因表达被表不为两个MAL分析(检测各种剪切变体)的平均值与两个内源性对照(GUSB和ACTB )的平均值之间的比值。将该值乘以系数1000。以下示出了甲基化特异性聚合酶链式反应所评价的每个样品各自的甲基化状态。实心圆表不MAL启动子超甲基化,空心圆表不未被甲基化的MAL,而具有斜杠的空心圆表示存在未被甲基化的等位基因和被甲基化的等位基因。将结肠直肠癌瘤被未被甲基化的组(n=3)和被超甲基化的组(n=13),在此示出了中间表达式。在表I中能够找到个体细胞系来源的组织。图9示出在进行药物治疗之后MAL表达的上调。在单独使用脱甲基5-氮杂_2’_脱氧胞嘧啶核苷和与脱乙酰基酶抑制剂曲古抑菌素A结合使用进行处理之后,发现结肠癌细胞系中mRNA表达上调之后,MAL启动子甲基化减小。上方组表明在单独使用5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷、单独使用曲古抑菌素A、以及结合使用这两种药物进行治疗之后,两份结肠癌细胞系(HT29和HCT15)中的MAL的相对表达值(线性比例的方式)。下方组说明了相同样品的MAL的MAP结果。泳道U中的可见PCR产物说明了存在未被甲基化的等位基因,而泳道M中的PCR产物说明了存在被甲基化的等位基因。缩写AZA,5-氮杂-2’ -脱氧胞嘧啶核苷;TSA,曲古抑菌素A ;Pos,(未被甲基化的反应来自正常血液的DNA ;被甲基化的反应体外的被甲基化的DNA) ;Neg,阴性对照(含有水作为模板);U,用于未被甲基化的MSP产物的泳道;M,用于被甲基化的MSP产物的泳道。图10示出了结肠直肠癌瘤中的MAL表达。在肾小管(A)中发现了 MAL的阳性细胞质染色,而在心肌(B)中没有发现任何染色,这与早期的报告(马拉祖厄拉M等人,组织化学和细胞化学杂志 2003,51:665-674 (Marazuela M, et al J Histochem Cytochem2003,51:665-674))相符。结肠直肠癌瘤的上皮细胞为MAL阴性(C,D),而在正常结肠组织中,会在上皮细胞和结缔组织(E,F)中发现MAL的细胞质表达。所有图像均通过使用40X透镜(400X放大倍率)拍摄得到。下面,将对本发明进行更详细的描述。
具体实施例方式定义除非另有说明,本文使用的所有技术术语和科技术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常知晓的意思。虽然在实践中或对本发明进行的测试中可以使用于本文所描述类似或等价的任意的方法或材料,但是在此描述的优选的方法和材料。为了本发明的目的,对以下术语进行定义表观遗传学(Epigentics)甲基化是一种表观遗传学变化,它被定义为不基于序列发生的通过细胞分裂而继承的。甲基化本文中的“超甲基化”仅指高于参照物甲基化的甲基化。参照物甲基化是来自健康受试者样品或正常组织中基因的甲基化。因此,甲基化的基因(而该基因在正常组织中未被甲基化)将被归类为超甲基化。“甲基化状态”是在至少一种核酸序列中一个或多个CpG位点内存在或不存在甲基修饰的度量。应该理解的是,优选在多份具体的目标基因中对一个或多个CpG位点的甲基化状态进行测定。“甲基化水平”表达了在一份或多份目标基因或核酸序列中甲基化的量。该甲基化水平可以被计算为目标基因或核酸序列中甲基化的绝对度量。此外,“相对甲基化水平”可以被测定为相对于存在的DNA总量的甲基化的DNA的量,或被测定为相对于基因或核酸序列总份数的目标基因或核酸序列甲基化的份数。另外,“甲基化水平”可以被测定为在感兴趣DNA段(DNA stretch )内的甲基化的CpG位点的百分数。术语甲基化水平还包括了这样的情况其中,在例如启动子区域内的一个或多个CpG位点被甲基化,但是甲基化的量低于扩增阈值(amplificationthreshoId)。因此,甲基 化水平可以是在感兴趣基因中甲基化的量的估计值。本发明不以任何方式受到用来测量根据本发明的基因的甲基化状态或甲基化水平的特定的类型的分析的限制。在一种事实方式中,如果感兴趣基因的甲基化水平为15%_100%,例如50%_100%,更优选为60-100%,更优选为70-100%,更优选为80%-100%,更优选为90%_100%。因此,本发明的一种实施方式中,根据本发明的基因的甲基化水平为80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。CpG“CpG位点”是DNA区域,其中,沿线性碱基序列长度方向上,胞嘧啶核苷酸紧接着鸟嘌呤核苷酸产生。“CpG”表示的是被磷酸酯间隔开的胞嘧啶和鸟嘌呤,所述磷酸酯在DNA中将这两个核苷酸连接在一起。“CpG”这一符号用来将紧邻鸟嘌呤的胞嘧啶与鸟嘌呤进行碱基配对的胞嘧啶进行区分。CpG岛可以被定义为至少200个碱基对的DNA连续视窗,其中,G :C含量至少为50%,且观察到的超过预期频率的CpG率的比例超过O. 6。然而,还可以以更严格的定义对它们进行定义500个碱基对的视窗(window),其中G C含量至少为55%,并且观察到的超过预期的CpG率至少为O. 65。启动子区域或序列“启动子区域或序列”包括了从给定基因的转录起始位点向上游延长IOOObp的连续核酸序列,和从转录起始位点向下游延长300个碱基对的连续核酸序列。在这种序列表中,上游序列以小写字母表示而下游序列以大写字母表示。在序列的3’部分中,小写字母表示内含子序列。转录起始位点本发明涉及的“转录起始位点”是描述转录发生的点。转录可以在基因内的一个或多个位点中发生,并且一个基因可以具有多个转录起始位点,它们中的一些可以对特定细胞类型或组织内的转录具有特异性。核酸序列的甲基化基因是DNA中起到产生并对多肽链进行调控的区域。基因包括编码部分和非编码部分,包括内含子、外显子、启动子、起始子(initiator)、增强子、终止子、微RNA和其他调控元件。本文使用的“基因”表示的基因的至少一部分。因此,例如说,“基因”可以被认为是为了本发明目的的启动子。所以,在本发明的一种实施方式中,一组基因中的至少一个成员含有整个基因的非编码部分。在一种具体的实施方式中,基因的非编码部分为启动子。在另一种实施方式中,在全组基因中的所有成员含有基因的非编码部分,例如但不限于,内含子。在另一种具体实施方式
中,基因成员的非编码部分为启动子。在本发明的另一种实施方式中,一组基因中的至少一个成员含有基因的编码部分。在另一种实施方式中,全组基因的所有成员含有基因的编码部分。术语“核酸序列”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸的聚合物。“子序列”指的是整个序列中的任意部分。因此,子序列指的是较长的核酸序列(例如,多核苷酸)中氨基酸或核酸的连续序列。术语“序列一致性”指的是在两个相同长度的核酸序列之间的同源性程度的定性度量。如果这两个待比较序列长度不同,则必须将它们对齐以产生最佳的可能匹配,以允许插入间隔,或可选择地在多肽序列或核苷酸序列的端部进行切断。这种序列一致性可以按
权利要求
1.一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法,该方法包括以下步骤 a)测定从所述受试者获得的样品中的至少一个基因内的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,其中,所述基因选自由以下所组成的组中 CNRIPl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定; FBNl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定; SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。
2.根据权利要求1所述的方法,该方法还包括以下步骤 b)与参照物比较甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态;和 c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态高于参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则将所述受试者确定为可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发,如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于所述参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则将所述受试者确定为不太可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发。
3.一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法,该方法包括以下步骤 a)测定来自受试者的样品内的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态; b)构建得自健康人群样品的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态的百分位数图; c)基于健康人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态并基于患有癌症人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,构建ROC (受试者操作特性)曲线; d)从ROC曲线中选择所期望的灵敏度和特异性的结合; e)从百分位数图测定相应于所测定的或所选择的特异性的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态;和 f)如果样品中的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态等于或高于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则预测受试者可能患有癌症,并且如果样品中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,则预测受试者不太可能或没有患有癌症。
4.根据前述任意一项权利要求所述的方法,其中,至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态得到测定。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述至少一种附加标记物选自由以下所组成的组中CNRIP1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;FBN1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定;SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定;MAL,例如由ensembl基因编号ENSG00000172005所确定。
6.根据权利要求4所述的方法,该方法包括测定CNRIP1的甲基化水平、甲基化的CpG 位点的数量或CpG位点的甲基化状态,联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基 化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,所述一种附加标记物选自由以下所组成的 组中SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;FBN1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定;SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。
7.根据权利要求4所述的方法,该方法包括测定SPG20的甲基化水平、甲基化的CpG位 点的数量或CpG位点的甲基化状态,联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化 的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,所述一种附加标记物选自由以下所组成的组 中CNRIP1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; FBN1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定;SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。
8.根据权利要求4所述的方法,该方法包括测定FBN1的甲基化水平、甲基化的CpG位 点的数量或CpG位点的甲基化状态,联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化 的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,所述一种附加标记物选自由以下所组成的组 中CNRIP1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。
9.根据权利要求4所述的方法,该方法包括测定SNCA的甲基化水平、甲基化的CpG位 点的数量或CpG位点的甲基化状态,联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化 的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,所述一种附加标记物选自由以下所组成的组 中CNRIP1,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定;FBN1,例如由ensembl基因编号ENSG00000166147、entrez编号2200所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。
10.根据权利要求4所述的方法,该方法包括测定INA的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,所述一种附加标记物选自由以下所组成的组中 CNRIPl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定; FBNl,例如由ensembl基因编号ENSG00000166147、entrez编号2200所确定;和 SNCA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000145335、entrez 编号 6622 所确定。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,通过亚硫酸氢盐测序、定量和/或定性的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)、焦磷酸测序、DNA印迹法、基因组限制性酶切扫描法(RLGS)、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、SNUPE、COBRA、质谱,通过使用甲基特异性限制酶,通过测量所述基因的表达水平或它们的结合来对甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点甲基化状态进行测定。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述甲基特异性聚合酶链式反应包括使用能够与这样的核酸序列杂交的核酸引物该核酸序列包括2个CPG位点和不在CpG位点内的胞嘧啶残基。
13.根据前述任意一项所述的方法,其中,所述癌症选自由以下所组成的组中结肠直肠肿瘤、肺肿瘤(包括小细胞肺癌和/或非小细胞性肺癌)、食道肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤、肝肿瘤、胆囊和/或胆管的肿瘤、小肠肿瘤和大肠肿瘤。
14.根据前述任意一项所述的方法,其中,样品得自血液、粪便、尿液、胸水、胆汁、支气管液、口腔洗出液、组织活检、腹水、脓、脑脊髓液、抽出物、滤泡液、组织或粘液。
15.根据前述任意一项所述的方法,该方法包括测定核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态,所述核酸序列包括选自由以下所组成的组中的序列A)由SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. :13,SEQ ID NO. :14 和SEQ ID NO. : 16中的任意一个所定义的核酸序列; B)与所述A)中所定义的序列互补的核酸序列; C)所述A)或B)中所定义的核酸序列的子序列; D)与所述A)、B)或C)中所定义的序列至少75%—致的核酸序列。
16.一种用来测定癌症的诊断试剂盒,该试剂盒含有一个或多个寡核苷酸引物或者一组或多组寡核苷酸引物,所述寡核苷酸引物中的每一个与选自以下的基因的核苷酸序列互补 CNRIPl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定; SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定; FBNl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定; SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。
17.—个或多个选自由以下所组成的组中的基因在诊断分析中的应用 CNRIPl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定;SPG20,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定; FBNl,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定; SNCA,例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定;和 INA,例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定; 其中,对甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态进行评价,作为受试者是否发生了、正在发生或易于发生癌症、或受试者是否在癌症治疗后复发的指示物。
18.核酸序列在诊断分析中的应用,其中,所述核酸含有选自由以下所组成的组中的核酸序列A)由SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. :13,SEQ ID NO. : 14 和SEQ ID NO. :16中的任意一个所定义的核酸序列; B)与所述A)中所定义的序列互补的核酸序列; C)所述A)或B)中所定义的核酸序列的子序列; D)与所述A)、A)或C)中所定义的序列至少75%—致的核酸序列; 其中,对甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态进行评价,作为受试者是否发生了、正在发生或易于发生癌症、或受试者是否在癌症治疗后复发的指示物。
19.一种识别甲基化的核酸序列的抗体,所述核酸序列选自由以下所组成的组中A)由SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. :13,SEQ ID NO. :14 和SEQ ID NO. :16中的任意一个所定义的核酸序列; B)与所述A)中所定义的序列互补的核酸序列; C)所述A)或B)中所定义的核酸序列的子序列; D)与所述A)、B)或C)中所定义的序列至少75%—致的核酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种新型癌症标记物。更具体地说,本发明涉及一种确定在呼吸消化系统内是否发生肿瘤,或者对所述肿瘤进行治疗后受试者是否复发的方法。本方法包括测定选自由CNRIP1、SPG20、FBN1、SNCA和INA所组成的组中一个或多个的基因的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态。本方法还涉及用来测定呼吸消化道中的肿瘤的诊断试剂盒。
文档编号C07K16/00GK103014155SQ201210495659
公开日2013年4月3日 申请日期2008年2月21日 优先权日2007年2月21日
发明者罗尔夫·I.·舍特海姆, 朗希尔德·A.·洛特, 古罗·E.·林德, 泰耶·C.·阿尔奎斯特 申请人:奥斯陆大学医院Hf
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