提高腹水型单抗产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高腹水型单抗产量的方法，该方法在注射弗氏不完全佐剂6-10天后再次注射1次弗氏不完全佐剂，然后按常规接种杂交瘤细胞，得到的腹水型单抗的产量为12-16ml，比现有技术的制备方法产量高50-100%，且方法简易实用，无需增加其他设备。
【专利说明】提高腹水型单抗产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学和生物【技术领域】，特别是涉及一种提高腹水型单抗产量的方法。【背景技术】
[0002]目前单克隆抗体的制备方法主要是:杂交瘤细胞克隆化培养成功后，进行大规模的培养。具体的制备单克隆抗体的方法有:
[0003]1)体外培养法:首先将96孔培养板中的杂交瘤细胞稀释后移植到24孔板中，经培养后再扩大到小瓶或平皿中；如果采用更大量的培养，可选用滚瓶培养，经培养3-4天后，培养基中的免疫球蛋白可达10-100 μ g/mL。该方法的最大缺点是获得的单克隆抗体量少。
[0004]2)皮下接种法:取1× 1O6-1O7个杂交瘤细胞，皮下接种同系雌性小鼠，10-12天左右小鼠皮下会出现肿瘤，在肿瘤出现后可采用多次采血来获得单克隆抗体，血清中单克隆抗体含量可达1-lOmg/mL。由于采血量有限，所得单克隆抗体量仍较少。
[0005]3)腹腔接种法:先给正常同系小鼠腹腔注射0.5mL降植烷或弗氏不完全佐剂，一周后在经腹腔注射约1×1O6个杂交瘤细胞，经一周后小鼠腹腔会产生大量腹水，抗体含量可高于lmg/mL。
[0006]目前腹水型单抗的制备过程一般是提前一周用弗氏不完全佐剂0.5ml注射小鼠腹腔；注射佐剂一周后将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS或不完全培养基重悬后注射小鼠腹腔，一般7天后就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以处死小鼠采集腹水，也可以用注射器反复隔日抽采腹水。使用这种方法每只小鼠的产量一般只有6-8mL，产量相对较低。
【发明内容】
[0007]基于此，本发明的目的是提供一种提高腹水型单抗产量的方法。
[0008]具体的技术方案如下:
[0009]一种提高腹水型单抗产量的方法，包括如下步骤:
[0010](1)取8周龄±lBALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐剂；
[0011](2)间隔6-10天后再次经腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐剂；
[0012](3) 6-10天后每只小鼠接种约1 × 1O6个杂交瘤细胞(约0.5ml杂交瘤细胞悬液)，接种后7-10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水；
[0013](4)离心收集上清液，即得。
[0014]在其中一些实施例中，步骤(1)和步骤(2)中所述弗氏不完全佐剂的注射量为
0.35ml 。
[0015]在其中一些实施例中，步骤(2)中，间隔时间为7天。
[0016]在其中一些实施例中，步骤(3)中，每只小鼠收集的腹水产量为12_16mL。
[0017]本发明的优点:本发明分两次注射不完全佐剂，与一次注射相比腹水形成的阳性率及腹水的收获量均明显提高，在初次注射不完全佐剂的基础上再次注射可加强初次致敏的效果，并且能够促使杂交瘤细胞在腹腔中分散性生长阻止杂交瘤细胞的附着性生长从而抑制实体瘤的形成，从而有利于腹水型单抗的形成。
[0018]本发明提高腹水型单抗产量的方法简易实用，不需要增加额外的设备，使小鼠腹水产量明显提升50-100% (由6-8ml提升至12_16ml )，而且成本不高。
【具体实施方式】
[0019]本发明实施例中所使用的杂交瘤细胞悬液:
[0020]按常规方法制备得到杂交瘤细胞悬液，分泌抗体的阳性杂交瘤细胞复苏过程如下:
[0021]⑴从液氮罐中取出冻存管，置于37°C水浴中，快速搅拌融化；
[0022]⑵将细胞悬液转移至IOmL离心管中，加入适量RPM1-1640不完全培养液，1000r/min离心5min，弃培养液；
[0023]⑶轻弹击离心管底，并加入适量完全培养液后移入细胞培养瓶，37°C，5% C02培养箱内培养；
[0024]⑷待细胞布满培养瓶80%底面时，取细胞上清检测抗体活性。
[0025]本发明实施例中所使用的弗氏不完全佐剂购自Sigma。
[0026]以下通过实施例对本发明做进一步阐述。
[0027]实施例1
[0028]本实施例一种提高腹水型单抗产量的方法，包括如下步骤:
[0029](I)取8周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.35mL弗氏不完全佐剂；
[0030](2)间隔7天后再次经腹腔注入0.35mL弗氏不完全佐剂；
[0031](3) 7天后每只小鼠接种约IX IO6个杂交瘤细胞(约0.5ml杂交瘤细胞悬液)，接种后7-10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，每只小鼠腹水产量大于12mL ；
[0032](4)4°C，2000r/min离心10min，收集上清液，分装于无菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0033]实施例2
[0034]本实施例一种提高腹水型单抗产量的方法，包括如下步骤:
[0035](I)取8周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.4mL弗氏不完全佐剂；
[0036](2)间隔6天后再次经腹腔注入0.5mL弗氏不完全佐剂；
[0037](3) 6天后每只小鼠接种约IX IO6个杂交瘤细胞(约0.5ml杂交瘤细胞悬液)，接种后7-10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，每只小鼠腹水产量大于12mL ；
[0038](4)4°C，2000r/min离心10min，收集上清液，分装于无菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0039]实施例3
[0040]本实施例一种提高腹水型单抗产量的方法，包括如下步骤:
[0041](I)取8周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.6mL弗氏不完全佐剂；
[0042](2)间隔10天后再次经腹腔注入0.6mL弗氏不完全佐剂；[0043](3) 10天后每只小鼠接种约IX IO6个杂交瘤细胞(约0.5ml杂交瘤细胞悬液)，接种后7-10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，每只小鼠腹水产量大于12mL ；
[0044](4)4°C，2000r/min离心10min，收集上清液，分装于无菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0045]实施例4对比试验
[0046]本对比例一种腹水型单抗产量的方法，包括如下步骤:
[0047](1)取8周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.5mL弗氏不完全佐剂；
[0048](2) 6天后每只小鼠接种约1X 1O6个杂交瘤细胞(约0.5ml杂交瘤细胞悬液)，接种后7-10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，每只小鼠腹水产量为6_8mL ；
[0049](3)4°C，2000r/min离心10min，收集上清液，分装于无菌EP管，保存于-20°C冰箱。即得。
[0050]本实施例1-3所得腹水型单抗与实施例4所得腹水型单抗的性能比较如下:
[0051]
【权利要求】
1.一种提高腹水型单抗产量的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取8周龄土I天BALB/c雌性小鼠，腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐剂； (2)间隔6-10天后再次经腹腔注入0.3-0.6mL弗氏不完全佐剂； (3)6-10天后每只小鼠接种约0.8X 1O6-L 2X 1O6个杂交瘤细胞，接种后7-10天，观察小鼠生存状况，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水； (4)离心收集上清液，即得。
2.根据权利要求1所述的提高腹水型单抗产量的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述弗氏不完全佐剂的注射量为0.35ml。
3.根据权利要求1所述的提高腹水型单抗产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，间隔时间为7天。
4.根据权利要求1所述的提高腹水型单抗产量的方法，其特征在于，步骤(3)中，每只小鼠收集的腹水产量为12-16mL。
【文档编号】C07K16/00GK103897055SQ201210572740
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】万晓春, 吕卫东, 于广 申请人:深圳先进技术研究院