根优选的启动子以及使用方法【专利摘要】本发明提供用于调节异源核苷酸序列在植物中表达的组合物和方法。组合物包含用于编码高粱(Sorghum?bicolor)RCc3的基因的启动子的新型核苷酸序列。提供了使用本文所公开的启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。所述方法包括用可操作地连接到本发明所述启动子中之一的核苷酸序列转化植物或植物细胞。【专利说明】根优选的启动子以及使用方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及植物中基因表达的调节。【
背景技术：
】[0002]异源DNA序列在植物宿主中的表达有赖于存在有效连接的在该植物宿主中发挥作用的启动子。启动子序列的选择将决定在生物体中何时和何处表达异源DNA序列。需要在特定组织或者器官中表达的情况下，可以使用组织优选启动子。需要应答于刺激而表达基因的情况下，诱导型启动子是首选的调节元件。相比之下，在需要在植物的细胞中持续表达的情况下，采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包括位于核心启动子序列上游和/或下游的另外调节序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中不同水平的表达。[0003]常常需要在植物的特定组织或器官中表达DNA序列。例如，可以通过遗传操纵植物的基因组以包含可操作地连接到异源病原体抗性基因的组织优选启动子，从而在所需植物组织中产生病原体抗性蛋白质，实现植物对土源和空气源病原体感染的抗性增加。[0004]或者，可能需要抑制植物组织内天然DNA序列的表达以实现所需的表型。在这个情况中，可以如下实现这种抑制:将植物转化以使其包含可操作地连接到反义核苷酸序列的组织优选启动子，从而该反义序列的表达产生了干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。[0005]到目前为止，尽管根对植物发育重要，但尚未充分研究植物根中基因表达的调节。在某种程度上这归因于缺少易得的根特异性生物化学功能，可对其基因进行克隆、研究和操纵。通过使用基因工程技术遗传地改变植物并且因此产生具有有用性状的植物，这要求多种启动子可获得。启动子的积累将允许研究人员设计出能够按所需水平和细胞场所表达的重组DNA分子。因此，组织优选启动子的集合将允许新性状在所需组织中表达。[0006]因此，需要分离和表征组织优选的(特别是根优选的)启动子以进行植物的遗传操纵，所述启动子可以充当以组织优选方式表达目的异源核苷酸序列的调节区。【
发明内容】[0007]提供了用于调节目的异源核苷酸序列在植物或植物细胞中表达的组合物和方法。组合物包含引发转录的启动子的新型核苷酸序列。本发明的实施例包括在SEQIDNO:1中示出的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列包含以专利保藏号NRRLB-50462所保藏的质粒的植物启动子序列或其互补序列，包含SEQIDNO:1的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录，和包含下述序列的核苷酸序列，所述序列与SEQIDN0:1中示出的序列具有至少85%序列同一性，其中所述序列在植物细胞中引发转录。[0008]提供了一种用于在植物或植物细胞中表达异源核苷酸序列的方法。该方法包括向植物或植物细胞内引入表达盒，所述表达盒包含可操作地连接到本发明的启动子之一的目的异源核苷酸序列。以此方式，启动子序列可用于控制可操作连接的异源核苷酸序列的表达。在具体方法中，目的异源核苷酸序列以根优选方式表达。[0009]还提供了一种在植物中以根优选方式表达目的核苷酸序列的方法。该方法包括向植物细胞内引入表达盒，该表达盒包含可操作地连接到目的异源核苷酸序列的本发明启动子。[0010]目的核苷酸序列的表达可以提供对植物表型的修饰。这种修饰包括就数量、相对分布等而言调节内源产物的产生，或外源表达产物的产生以便在植物中提供新功能或产物。在具体方法和组合物中，目的异源核苷酸序列包括赋予除草剂抗性、病原体抗性、昆虫抗性和/或改变的盐、寒冷或干旱耐受性的基因产物。[0011]提供了表达盒，其包含可操作地连接到目的异源核苷酸序列的本发明启动子序列。还另外提供了转化的植物细胞、植物组织、种子和植物。【具体实施方式】[0012]本发明涉及针对植物启动子的组合物和方法以及它们的应用方法。所述组合物包含与稻中RCc3具有强烈相似性的高粱(Sorghumbicolor)基因的启动子区的核苷酸序列，所述启动子区据报道以根特异性方式表达(XuY,etal.(1995)PlantMol.Biol.27:237-248(XuY等人，1995年，《植物分子生物学》，第27卷，第237-248页)。所述组合物还包含DNA构建体，所述DNA构建体包含与目的异源核苷酸序列可操作连接的高粱RCc3基因的启动子区的核苷酸序列。因此，给予SEQIDNO:1中示出的启动子标识名称“Sb-RCc3启动子”。具体地讲，本发明提供了包含SEQIDNO:1中示出的核苷酸序列的分离核酸分子，和2011年I月25日以专利保藏号NRRLB-50462保藏于细菌宿主中的植物启动子序列，以及其片段、变体和互补序列。[0013]包含本发明的植物启动子核苷酸序列的质粒于2011年I月25日作为美国伊利诺伊州皮奥里亚市北大学路1815号(邮编61604)(1815N.UniversityStreet,Peoria,IL,61604)的美国国家农业应用研究中心农业研究菌种保藏中心的专利保藏物保藏，并且被赋予专利保藏号NRRLB-50462。这份保藏物将按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款维持。这份保藏物仅仅为了本领域技术人员的方便而制作，并且并非承认按照美国法典第35篇第112条(35U.S.C.§112)要求保藏。一旦专利授权，该保藏物将不可撤回地和无限制或者无条件地可供公众获取。但是，应当理解，保藏物的可获取性不构成许可在损害政府法令所授予的专利权的情况下实施本发明。[0014]本发明的Sb_RCc3启动子序列包括允许在植物中引发转录的核苷酸构建体。在具体的实施例中，Sb-RCc3启动子序列允许以组织优选、更具体地讲以根优选方式引发转录。本发明的这种构建体包括与植物发育调节相关的受调节的转录起始区域。因此，本发明的组合物包括DNA构建体，所述构建体包含与Sb-RCc3启动子序列可操作连接的目的核苷酸序列。在SEQIDNO:1中示出了Sb-RCc3启动子区的序列。[0015]本发明的组合物包括天然Sb_RCc3启动子的核苷酸序列及其片段和变体。在具体实施例中，本发明的启动子序列可用于以组织优选、尤其根优选方式表达目的序列。另外本发明的核苷酸序列可用于构建用于目的植物中后续表达异源核苷酸序列的表达载体或用作分离其他Sb-RCc3样启动子的探针。[0016]本发明涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。“分离的”或者“纯化的”核酸分子或者其生物活性部分，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或者培养基，或者当用化学法合成时基本上不含化学前体或者其他化学物质。“分离”的核酸不含在衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸5’和3’端的序列)(最佳地是蛋白质编码序列)。例如，在各个实施例中，分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在衍生该核酸的细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子的旁侧的核苷酸序列。本发明的Sb-RCc3启动子序列可以从它们各自的转录起始位点旁侧的5’非翻译区分离。[0017]所公开的启动子核苷酸序列的片段和变体也为本发明所涵盖。具体地讲，SEQIDNO:1的Sb-RCc3启动子序列的片段和变体可用于本发明的DNA构建体中。如本文所用，术语“片段”是指核酸序列的一部分。Sb-RCc3启动子序列的片段可以保留引发转录的生物活性，更具体而言，以根优选的方式驱动转录。或者，可用作杂交探针的核苷酸序列片段可以不必保留生物活性。Sb-RCc3基因的启动子区的核苷酸序列的片段可以范围从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，并且对于该基因的启动子区最多至本发明的全长核苷酸序列。[0018]Sb-RCc3启动子的生物活性部分可以通过分离本发明的Sb_RCc3启动子序列的一部分并评估该部分的启动子活性来制备。作为Sb-RCc3启动子核苷酸序列的片段，核酸分子包含至少约16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1550、1600、1650或1700个核苷酸或者最多至本文所公开的全长Sb-RCc3启动子序列中存在的核苷酸数目(例如，对于SEQIDNO:1为1710个核苷酸)。[0019]如本文所用，术语“变体”表示基本上类似的序列。对于核苷酸序列,可以使用公知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如用本文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。[0020]对于核苷酸序列，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，“天然”核苷酸序列包括天然存在的核苷酸序列。对于核苷酸序列，天然存在的变体可以使用公知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术进行鉴定。变体核苷酸序列还包括合成方式衍生的核苷酸序列，如那些例如采用定点诱变产生的核苷酸序列。一般来讲，本发明的特定核苷酸序列的变体将与这种特定核苷酸序列具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序和参数确定。本发明的核苷酸序列的生物活性变体与该序列可以相差少至I至15个核酸残基，少至I至10个(例如6至10个)、少至5个、少至4、3、2或甚至I个核酸残基。[0021]变体核苷酸序列还涵盖从诱变和诱重组方法(如DNA改组)衍生的序列。利用这样的方法，可以操纵Sb-RCc3核苷酸序列以产生新的Sb-RCc3启动子。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751(Stemmer,1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747至10751页)；Stemmer(1994)Nature370:389-391(Stemmer,1994年，《自然》，第370卷，第389至391页)；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15:436-438(Crameri等人，1997年,《自然生物技术》,第15卷,第436至438页；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336至347页；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》,第94卷，第4504至4509页)；Cramerietal.(1998)Nature391:288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288至291页)；以及美国专利N0.5，605，793和N0.5，837，458。[0022]本发明的核苷酸序列可以用来分离来自其他生物、尤其其他植物、更具体而言其他单子叶植物的相应序列。以此方式,诸如PCR、杂交等之类的方法可以用来基于这类序列与本文所述序列的序列同源性鉴别这类序列。本发明涵盖基于其与本文示出的完整Sb-RCc3序列或者与其片段的序列同一性而分离的序列。[0023]在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以便从提取自任何目的植物的基因组DNA中扩增出相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，并且公开于以下文献中:Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆实验指南》)，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)，下文称“Sambrook”。另参见Innisetal.,eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NewYork)(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案:方法和应用指导》，学术出版社，纽约);InnisandGelfand,eds.(1995)PCRStrategies(AcademicPress,NewYork)(Innis和Gelfand编辑，1995年，《PCR策略》，学术出版社，纽约)；以及InnisandGelfand,eds.(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress,NewYork)(Innis和Gelfand编辑，1999年，《PCR方法手册》，学术出版社，纽约)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。[0024]在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的一组克隆的基因组DNA片段中存在的其他相应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以用可检测基团(例如32P)或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，可以通过标记基于本发明Sb-RCc3启动子序列的合成性寡核苷酸来制备杂交用探针。制备杂交用探针和构建基因组文库的方法是本领域公知的，并且在Sambrook中有公开。[0025]例如，本文公开的完整Sb_RCc3启动子序列，或其一个或多个部分，可以用作能够与相应Sb-RCc3启动子序列和信使RNA特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括在Sb-RCc3启动子序列中独特的并且长度为至少约10个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。这类探针可以用来从选定的植物通过PCR扩增相应的Sb-RCc3启动子序列。这项技术可以用于来从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬斑或菌落；参见例如，Sambrook)ο[0026]这类序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶标序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，最佳地长度小于500个核苷酸。[0027]通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或者其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30°C，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60°C的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37°C用30%至35%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50°C至55°C于IX至2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在370C于40%至45%甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中杂交和在55°C至60°C于0.5X至IXSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS中在37°C杂交，并在0.1XSSC中在60至65°C持续至少30分钟时间的最终洗涤。杂交的持续时间通常少于约24小时，一般约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。[0028]特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm(热熔点)可以根据MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的以下方程逼近:Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。TmS50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和PH下)。Tm因每1%错配下降约rc;因此，可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90%同一性的序列，则可以将Tm降低10°C。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和PH下的Tm低约5°C。然而，极严格条件可以利用比T1Jg1、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比T1Jg11、12、13、14、15或20°C的杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致^低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2(Elsevier,NewYork)(Tijssen,1993,《生物化学和分子生物学实验技术一核酸探针杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔出版社，纽约)；以及Ausubeletal.,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandffiley-1nterscience,NewYork)(Ausubel等人编辑，1995年，《分子生物学实验手册》，第2章，GreenePublishingandffiley-1nterscience出版社，纽约)。另参见“Sambrook”。[0029]因此，本发明涵盖具有根优选启动子活性并且在严格条件下与本文所公开的Sb-RCc3启动子序列或与其片段杂交的分离序列。[0030]如下术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系:(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(C)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“实质上相同”。[0031](a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或者基因序列的区段或者完整的cDNA或者基因序列。[0032](b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两条序列。通常，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸，任选可为30、40、50、100个或者更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。[0033]将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定，。此类数学算法的非限制性例子是MyersandMiller(1988)CAB10S4:ll-17(Myers和Miller,1988年，《生物信息学》，第4卷，第11-17页)的算法；Smithetal.(1981)Adv.Appl.Math.2:482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》,第2卷，第482页)的局部比对算法；NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453(Needleman和Wunsch,1970年，《分子生物学杂志》,第48卷,第443-453页)的全局比对算法；PearsonandLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-2448(Pearson和Lipman,1988年，《美国国家科学院院刊》第85卷，第2444-2448页)的搜索局部比对方法；KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264(Karlin和Altschul,1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页)的算法，其在KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877(Karlin和Altschul,1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。[0034]这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类程序包括但不限于:PC/Gene程序(可获自Intelligenetics公司，加利福尼亚州山景城(MountainView,California))中的CLUSTAL;GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage版本10(可获自美国加利福尼亚州圣地亚哥的9685斯克兰顿路(9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA)的AccelrysInc.)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的序列比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述:Higginsetal.(1988)，(Gene)，73:237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；Higginsetal.(1989)，CAB10S5:151-153(Higgins等人，1989年，《生物信息学》，第5卷，第151-153页)；Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》,第16卷，第10881-10890页);Huangetal.(1992)CAB10S8:155-65(Huang等人，1992年，《生物信息学》，第8卷，第155-165页)；以及Pearsonetal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可以使用PAMl20加权残基表(weightresiduetable)、空位长度罚分12和空位罚分LAltschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215:卷，第403页)的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分(score)=100、字长(wordlength)=12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分=50、字长=3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所描述采用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。或者，PS1-BLAST(在BLAST2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、GappedBLAST、PS1-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见美国国家生物技术信息中心的网站。还可以以手动方式通过检查来进行比对。[0035]除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值:核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一'丨生和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BL0SUM62评分矩阵。所谓“等同程序”意指任何序列比较程序，所述程序对于所考虑的任何两个序列，与GAP版本10所产生的相应比对结果相比时，产生具有相同核苷酸残基或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分数的比对结果。[0036]GAP使用NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453(Needleman和Wunsch,1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0-200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。[0037]GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子:品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将相应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的评分矩阵为BL0SUM62(参见HenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。[0038](C)在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时这两条序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予I分，非保守置换给予O分，则保守置换给予O至I之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(加利福尼亚州山景城(MountainView,California)的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。[0039](d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中与参比序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两个序列。通过以下方式计算这种百分数:确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。[0040](e)术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指某多核苷酸与参考序列相比包含具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%序列同一'丨生的序列,所述百分比是用所述比对程序之一采用标准参数得到。[0041]核苷酸序列基本上相同的另一种指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和PH下的Tm低约5°C。但是，严格条件涵盖在比Tm低约1°C至约20°C的范围内的温度，取决于本文另外限定的所需严格性程度。[0042]如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。[0043]本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。植物物种的例子包括玉米(Zeamays);芸苔属物种(Brassicasp.)(例如，欧洲菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)),特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种;苜猜(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare)、粟(如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(PanicummiIiaceum)、谷子(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(CamelliasinensiS)、香蕉(Musaspp.)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石植(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、撤揽(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、杏树(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘鹿(Saccharumspp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。[0044]蔬菜包括番爺(Lycopersiconesculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利马豆(PhaseolusIimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜胃$(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱樓(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙(Narcissusspp.)、矮牵牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)>一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。[0045]可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinustaeda)、湿地松(Pinuselliotii)、西黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和福射松(Pinusradiata);花方萁松(Pseudotsugamenziesii);西铁杉(Tsugacanadensis);北美云杉(Piceaglauca);红杉(Sequoiasempervirens);揪树(truefirs)如银揪(Abiesamabilis)和胶揪(Abiesbalsamea);以及雪松如西方红雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜猜、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。[0046]其他的目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。[0047]由本发明的Sb_RCc3启动子表达的异源编码序列可以用于改变植物的表型。表型的各种变化是值得关注的，包括调苄基因在植物根中的表达、改变植物对病原体或昆虫的防御机制、提高植物在植物中对除草剂的耐受性、改变根发育以应对环境胁迫、调节植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱的响应等。这些结果可以通过表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来获得。在具体的实施例中，目的异源核苷酸序列是在该植物或植物部分中增加其表达水平的内源植物序列。或者，这些结果可以通过引起植物中一种或者多种内源基因产物、尤其酶、转运蛋白或者辅因子的表达降低或者通过影响植物中营养物摄取来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。[0048]本发明的目的核苷酸序列的大体类别包括(例如)涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及持家的那些基因(如热休克蛋白)。更具体的转基因类另Ij(例如)包括编码农艺学、昆虫抗性、抗病、除草剂抗性、环境胁迫抗性(对寒冷、盐、干旱等的耐受性改变)的重要性状的基因。应认识到，目的任何基因可以与本发明的启动子可操作地连接并在植物中表达。[0049]昆虫抗性基因可以编码针对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫例如是根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。这类基因包括(例如)苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利N0.5，366,892;5，747,450;5，736,514;5，723，756;5，593,881;和Geiseretal.(1986)Gene48:109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页));等。[0050]编码抗病性性状的基因包括解毒基因，例如对伏马菌素解毒的那些基因(美国专利N0.5，792，931);无毒力(avr)和抗病性(R)基因(Jonesetal.(1994)Science266:789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页);Martinetal.(1993)Science262:1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；以及Mindrinosetal.(1994)Cell78:1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷,第1089页)；等。[0051]除草剂抗性性状可以包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因);编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，例如草胺膦或basta(例如bar基因);草甘磷(如，EPSPS基因和GAT基因；参见(例如)美国专利公开N0.20040082770和W003/092360)或本领域已知的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptll基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。[0052]草甘磷抗性由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予。参见(例如)Shah等人的美国专利N0.4，940，835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利N0.5，627，061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利N0.6，248，876B1;6，040，497;5，804，425;5，633，435;5，145，783；4，971，908;5，312，910;5，188，642;4，940，835;5，866，775;6，225，114B1;6，130，366；5，310,667;4，535，060;4，769，061;5，633，448;5，510,471；Re.36，449；RE37,287E；和5，491，288;以及国际公开W097/04103;TO97/04114;TO00/66746;TO01/66704;W000/66747和W000/66748，将这些专利为此目的以引用的方式并入本文。也向植物赋予草甘磷抗性，所述植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，如美国专利N0.5，776，760和N0.5，463，175中更充分地描述，将这两个专利为此目的以引用的方式并入本文。另外，可以通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因向植物赋予草甘磷抗性。参见(例如)美国专利7，714，188和7，462，481。[0053]外源产物包括植物酶和植物产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些酶和产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。[0054]其他适用基因及其相关表型的例子包括编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因或者赋予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量改善的基因；以及提供针对胁迫的抗性的基因，所述胁迫例如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的脱水、有毒金属或者痕量元素等。[0055]如上所述，与本文所公开的Sb_RCc3启动子可操作地连接的异源核苷酸序列可以是针对靶向基因的反义序列。因此，本文所公开的启动子序列可以可操作地连接到反义DNA序列，以降低或抑制植物根中天然蛋白的表达。[0056]“RNAi”指用于降低基因的表达的一系列相关技术(参见例如美国专利N0.6，506，559)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录物，以及“共抑制”或者“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义RNA转录物(美国专利N0.5，231，020，以引用方式并入本文)。这种技术依赖于使用能导致积累这样的双链RNA的构建体，该双链RNA中的一条链与要沉默的靶标基因互补。所述实施例的Sb-RCc3启动子可以用来驱动将会产生RNA干扰的构建体(包括microRNA和siRNA)的表达。[0057]如本文所用，术语“启动子”或“转录起始区”意指DNA调节区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II以在特定编码序列的适当转录起始位点处引发RNA合成的TATA框。启动子可以另外包含通常位于TATA框的上游(5’)的其他识别序列，称为上游启动子元件，它们影响转录引发速率。应认识到，在鉴定到本文所公开的启动子区的核苷酸序列的情况下，分离和鉴定在本文所鉴定的特定启动子区上游的5’非翻译区中的更多调节元件属于本领域的技术范围内。另外，可以提供嵌合启动子。这种嵌合体包括该启动子序列的部分与异源转录调节区的片段和/或变体融合。因此，本文所公开的启动子区可包含上游调节元件，如那些负责编码序列的组织表达和时序表达的调节元件，增强子等等。以相同的方式，可以鉴定、分离使得在所需组织(如根)中表达成为可能的启动子元件，并将其与其他核心启动子一起使用以赋予根优选的表达。在本发明的这个方面，“核心启动子”意指无启动子元件的启动子。[0058]在本发明的情形中，术语“调节元件”也指通常但不总是位于结构基因的编码序列的上游(5’)的DNA序列，其包括通过提供为使转录在特定位点引发而需要的RNA聚合酶和/或其他因子的识别来控制编码区的表达的序列。提供RNA聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点处引发的调节元件的例子，是启动子元件。启动子元件包含负责引发转录的核心启动子元件以及修饰基因表达的其他调节元件(如在本专利申请其他地方所讨论)。应理解，位于编码区序列的内含子内或者编码区序列3’的核苷酸序列也可有助于目的编码区的表达的调节。合适的内含子的例子包括但不限于玉蜀黍IVS6内含子，或者玉蜀黍肌动蛋白内含子。调节元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3’)的元件，或者位于被转录的区域内的元件，或者同时以上两种情况。在本发明的背景下，转录后调节元件可以包括在转录引发之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏物和mRNA稳定性决定因子。[0059]可以将本发明的调节元件或其变体或片段与异源调节元件或启动子可操作地连接，以调控异源调节元件的活性。这种调控包括增强或抑制异源调节元件的转录活性、调控转录后事件、或者增强或抑制异源调节元件的转录活性并调控转录后事件。例如，可以将本发明的一个或多个调节元件或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启动子或其片段可操作地连接，以调控这种启动子在植物细胞中的所需组织内的活性。[0060]与目的异源核苷酸序列可操作地连接到时，本发明的调节序列或其变体或片段可以驱动所述异源核苷酸序列在表达这个构建体的植物的根(或根部分)中的根优选性表达。术语“根优选的”表示异源核苷酸序列的表达在根或根部分最为丰富，所述根部分包括(例如)根冠、顶端分生组织、原表皮、基本分生组织、原形成层、内皮、皮质、脉管皮质、表皮等等。虽然异源核苷酸序列的某种表达水平可以在其他植物组织类型中发生，但表达在根或根部分(包括初生根、侧根和不定根)中最丰富地发生。[0061]“异源核苷酸序列”是不与本发明的启动子序列一起天然存在的序列。虽然这个核苷酸序列对于启动子序列是异源的，但它对于植物宿主可以是同源的、或天然的、或异源的、或外来的。[0062]可以修饰本发明的分离启动子序列以提供所述异源核苷酸序列的一系列表达水平。因此，可以利用小于完整的启动子区，并且驱动目的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可以按不同方式缺失启动子序列的部分，改变mRNA的表达水平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的)负调节元件，则因启动子的缺失，可以降低mRNA表达水平，或者可以增加表达。通常，分离的启动子序列的至少约20个核苷酸将用于驱动核苷酸序列的表达。[0063]应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本发明的启动子区组合使用。增强子是起到增加启动子区的表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。一些增强子还已知用来改变正常的启动子表达模式，例如通过造成启动子被组成型表达而改变正常的启动子表达模式，若没有该增强子，则该启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中被表达。[0064]本发明的分离启动子序列的修饰可以提供该异源核苷酸序列的一系列的表达。因此，可以将它们修饰成弱启动子或者强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达意在指以约1/10，000个转录物至约1/100，000个转录物至约1/500，000个转录物的水平表达。相反，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1，000个转录物的水平驱动编码序列的表达。[0065]已经认识到，本发明的启动子可以与它们的天然Sb-RCc3编码序列一起使用以增加或减少表达，从而导致转化植物的表型的变化。这种表型变化可能进一步影响已转化植物的组织中金属离子水平的增加或减少。[0066]本发明中公开的核苷酸序列及其变体和片段可以用于任何植物的遗传操纵。与待控制其表达以实现所需表型反应的异源核苷酸序列可操作地连接时，Sb-RCc3启动子序列可用于这个方面。术语“可操作地连接”意指该异源核苷酸序列的转录和翻译处于该启动子序列的影响下。以此方式，可以将本发明的启动子的核苷酸序列与目的异源核苷酸序列一起在表达盒中提供，以便在目的植物中、更具体地在植物的根中表达。[0067]这种表达盒将包含转录起始区，所述转录起始区包含与该异源核苷酸序列可操作连接的本发明的启动子核苷酸序列之一或其变体或片段。这种表达盒可以配有多个限制位点用于插入该核苷酸序列以便处于调节区的转录调节之下。表达盒可以另外含有选择标记基因以及3’终止区。[0068]表达盒可以按5’-3’转录方向包括转录起始区(即本发明的启动子或其变体或片段)、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、翻译终止区并任选包括在宿主生物体中有功能的转录终止区。各实施例的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞而言或者彼此之间可以是天然的/同功的。或者，各实施例的调节区和/或多核苷酸对于宿主细胞或者彼此之间可以是异源的。如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与衍生这种多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/相似的物种，则一者或者两者基本上从它们的原始形式和/或基因座修饰而获得，或者该启动子不是用于可操作连接的多核苷酸的天然启动子。[0069]虽然可能优选的是使用本发明的启动子表达异源核苷酸序列，但也可以表达天然序列。这种构建体将改变Sb-RCc3蛋白在植物或植物细胞中的表达水平。因此，改变植物或植物细胞的表型。[0070]终止区可以是对转录起始区而言是天然的，可以对可操作连接的目的DNA序列而言是天然的，可以对植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一来源(即对于该启动子、被表达的DNA序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒,如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cel164:671-674(Proudfoot,1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页);Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261_1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroeetal.(1990)Gene91:151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903(Balias等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。[0071]包含本发明的序列的表达盒还可以含有待共转化入该生物体中的基因的至少一条另外核苷酸序列。或者，所述另外序列可以在另一表达盒上提供。[0072]在适当情况下，可以优化其表达待处于本发明的根优选启动子序列控制下的核苷酸序列和任何另外的核苷酸序列，以便在转化的植物中增加表达。也即，可使用植物优选的密码子来合成这些核苷酸序列以改进表达。有关宿主优选密码子用法的讨论，参见例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11(Campbell和Gowri,1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物优选性基因的方法。参见(例如)美国专利N0.5，380，831、5，436，391，以及Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477至498页)，上述文献以引用的方式并入本文。[0073]已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列:编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类充分表征的可能有害于基因表达的序列。可以将异源核苷酸序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。[0074]表达盒可以另外含有5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括:微RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Steinetal.(1989)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA86:6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第6126至6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allisonetal.(1986)Virologyl54:9-20(Allison等人，1986年，《病毒学》，第154卷，第9-20页));MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejaketal.(1991)Nature353:90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导序列(Joblingetal.(1987)Nature325:622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622至625页));烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallieetal.(1989)MolecularBiologyofRNA,pages237_256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物学》，第237-256页))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommeletal.(1991)Virology81:382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382至385页))。还可参见Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiology84:965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。也可以采用已知增强mRNA稳定性的方法，例如内含子，如玉蜀黍遍在蛋白内含子(ChristensenandQuail(1996)TransgenicRes.5:213-218(Christensen和Quail,1996年，《转基因研究》，第5卷，第213至218页);Christensenetal.(1992)PlantMolecularBiologyl8:675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))或者玉蜀黍AdhI内含子(Kyozukaetal.(1991)Mol.Gen.Genet.228:40-48(Kyozuka等人，1991年,《分子遗传学与普通遗传学》,第228卷,第40-48页);Kyozukaetal.(1990)Maydica35:353-357(Kyozuka等人，1990年，((Maydica)),第35卷，第353-357页))等。[0075]在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。为此目的，可能涉及到体外诱变、引物修复、限制、复性、再置换，例如转换和颠换。[0076]可以在表达盒中包含报告基因或者选择性标记基因。本领域已知的合适报告基因的例子可以见于(例如)以下文献:Jeffersonetal.(1991)inPlantMolecularBiologyManual,ed.Gelvinetal.(KluwerAcademicPublishers),pp.1-33(Jefferson等人，1991年，引自《植物分子生物学手册》，Gelvin等人编辑，克吕维尔学术出版社，第1-33页);DeWetetal.(1987)Mol.Cell.Biol.7:725-737(Deffet等人，1987年，《分子细胞生物学》，第7卷，第725-737页);Goffetal.(1990)EMBOJ.9:2517_2522(Goff等人，1990年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第9卷，第2517至2522页);Kainetal.(1995)BioTechniquesl9:650-655(Kain等人，1995年，《生物技术》，第19卷,第650-655页)；和Chiuetal.(1996)CurrentBiology6:325-330(Chiu等人，1996年，《当代生物学》，第6卷，第325-330页)。[0077]用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或者除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的例子包括但不限于:编码针对以下物质的抗性的基因:氯霉素(HerreraEstrellaetal.(1983)EMBOJ.2:987-992(HerreraEstrella等人，1983年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第2卷，第987-992页))；甲氨喋呤(HerreraEstrellaetal.(1983)Nature303:209-213(HerreraEstrella等人，1983年，《自然》，第303卷，第209-213页))；Meijeretal.(1991)PlantMol.Biol.16:807-820(Meijer等人，1991年，《植物分子生物学》，第16卷，第807-820页));潮霉素(Waldronetal.(1985)PlantMol.Biol.5:103_108(Waldron等人，1985年，《植物分子生物学》，第5卷，第103-108页)；和Zhijianetal.(1995)PlantSciencel08:219-227(Zhijian等人，1995年，《植物科学》，第108卷，第219-227页));链霉素(Jonesetal.(1987)Mol.Gen.Genet.210:86-91(Jones等人，1987年，《分子遗传学与普通遗传学》，第210卷，第86-91页))；壮观霉素(Bretagne-Sagnardetal.(1996)TransgenicRes.5:131-137(Bretagne-Sagnard等人，1996年，《转基因研究》，第5卷，第131-137页))；博来霉素(Hilleetal.(1990)PlantMol.Biol.7:171-176(Hille等人，1990年，《植物分子生物学》，第7卷，第171-176页))；横酸胺(Guerineauetal.(1990)PlantMol.Biol.15:127-136(Guerineau等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第127-136页))；溴苯腈(Stalkeretal.(1988)Science242:419-423(Stalker等人，1988年，《科学》，第242卷，第419-423页))；草甘膦(Shawetal.(1986)Science233:478-481(Shaw等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页);以及美国专利申请N0.10/004，357和10/427,692);膦丝菌素(DeBlocketal.(1987)EMBOJ.6:2513-2518(DeBlock等人，1987年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第6卷，第2513-2518页))。[0078]可以在回收转基因事件中发挥作用但在最终产物中可能不需要的其他基因将包括但不限于诸如以下例子:GUS(β-葡糖醒酸酶；Jefferson(1987)PlantMol.Biol.Rep.5:387(Jefferson,1987年，《植物分子生物学报道》，第5卷，第387页))、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfieetal.(1994)Science263:802(Chalfie等人，1994年，《科学》，第263卷，第802页))、萤光素酶(Riggsetal.(1987)NucleicAcidsRes.15(19):8115(Riggs等人，1987年，《核酸研究》,第15卷,第19期,第8115页)以及Luehrsenetal.(1992)MethodsEnzymol.216:397-414(Luehrsen等人，1992年，《酶学方法》，第216卷，第397-414页))，以及编码花青素生产的玉蜀黍基因(Ludwigetal.(1990)Science247:449(Ludwig等人，1990年，《科学》，第247卷，第449页))。[0079]包含与目的核苷酸序列可操作连接的本发明Sb_RCc3启动子的表达盒可以用来转化任何植物。以此方式，可以获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。[0080]本发明的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物中。“引入”意在指以多核苷酸或者多肽序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或者多肽呈送到植物。本发明的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。[0081]“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。[0082]转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可以根据转化所指向的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)变动。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法包括:微量注射法(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4:320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》,第83卷,第5602至5606页))、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化法(Townsendetal.,U.S.PatentNos.5,563,055(Townsend等人，美国专利N0.5，563，055)和Zhaoetal.，5，981，840(Zhao等人，美国专利N0.5，981，840))、直接基因转移法(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3:2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见(例如)美国专利N0.4，945，050;5，879，918;5，886，244;5，932，782；Tomesetal.(1995)inPlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin)(Tomes等人，1995年，《植物细胞、组织和器官培养:基本方法》，Gamborg和Phillips编辑,斯普林格出版社,柏林)；McCabeetal.(1988)Biotechnology6:923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))和Lecl转化(W000/28058)。还可参见Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页);Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87:671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6:923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；FinerandMcMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P:175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8:736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Kleinetal.(1988)Biotechnology6:559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利N0.5，240，855、N0.5，322，783和N0.5，324，646;Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91:440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Frommetal.(1990)Biotechnology8:833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas_VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311:763-764(Hooykaas-VanSlogteren等人，1984年，《自然(伦敦)》，第311卷，第763-764页);美国专利N0.5，736，369(谷类)；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWetetal.(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues,ed.Chapmanetal.(Longman，NewYork)，pp.197-209(DeWet等人，1985年，《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉);Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9:415_418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；D’Halluinetal.(1992)PlantCell4:1495-1505(D，Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔);Lietal.(1993)PlantCellReportsl2:250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75:407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；0sjodaetal.(1996)NatureBiotechnologyl4:745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化玉蜀黍);所有这些文献和专利均以引用方式并入本文。[0083]在具体的实施例中，可以使用多种瞬时转化方法，向植物提供包含本发明启动子序列的DNA构建体。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体系统以及以阻止DNA后续释放的方式沉淀多核苷酸。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用聚乙基亚胺(PEI;Sigma#P3143)涂覆的粒子。[0084]在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内部。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见(例如)美国专利N0.5，889，191,5,889,190,5,866,785,5，589，367、5，316，931和Portaetal.(1996)MolecularBiotechnology5:209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页);将这些专利以引用方式并入本文。[0085]用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见(例如)W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，将这些文献均以引用方式并入本文。简单而言，可以在转移盒中包含本发明的多核苷酸，所述转移盒旁侧分布有两个不相同的重组位点。将转移盒引入其基因组中稳定掺入靶位点的植物中，其中所述靶位点旁侧分布有两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。目的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。[0086]转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如McCormicketal.(1986)PlantCellReports5:81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》,第5卷，第81-84页)。然后可以培育这些植株，用相同的转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供使得本发明的核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)稳定掺入其基因组中的转化种子(也称为“转基因种子”)。[0087]本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。举例说，“一个要素”是指一个或多个要素。[0088]在本说明书通篇范围内，词语“包含”及其语法变体将理解为表示包括所称的要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组。[0089]以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。[0090]实骀[0091]实例1:Sb_RCc3某闵的鉴定[0092]通过搜索从优良自交系BTX623获得的表达谱数据，鉴定到Sb_RCc3基因。在6叶营养阶段和开花末期(正好在花粉散播之前)对温室培育的植物组织从每一个主要器官取样。还收集来自繁殖器官的组织。对每个样品取三个平行样，其中每个平行样由9个植株组成。从平行样的每一个中分离RNA，进行逆转录，并且使用SolexaDNA测序技术(亿明达(Illumina))进行测序。将序列“标签”与公开可用的基因序列比对以鉴定基因。比较每一份样品中的表达鉴定出具有根优选表达的基因。[0093]实例2:Sb~RCc3启动子的PCR分离[0094]一旦鉴定出基因，则通过针对编码区5’序列搜索公开可用的基因组数据，获得5’旁侧序列。对于Sb-RCc3而言，鉴定大约1710bp的上游序列。将NotI限制核酸内切酶识别位点添加至序列的5’端，并且将BamHl识别位点添加至序列的3’端，以方便将DNA在化学合成表达载体时连接到该表达载体内。分析序列的基序显示距序列3’端大约108bp的推定TATA框以及距3’端大约83bp的推定转录起始位点。[0095]实例3:转基因玉蜀黍植物中的表达分析[0096]使用农杆菌方案产生稳定转化的植株(在实例4中详述)以允许表征启动子活性，包括由启动子指导的表达模式和表达水平。将Sb-RCc3启动子(SEQIDN0:1)可操作地连接到B-葡糖苷酸酶(CTS)基因(缩写为Sb-RCc3:⑶S)或杀昆虫基因(缩写为Sb-RCc3:1Gl)。另外将所述启动子可操作地连接到Adhl内含子(内含子I)和IGl基因(缩写为Sb-RCc3(Adhl内含子I):1G1)，目的是潜在地增加表达，因为已证实在谷类植物细胞中，转基因的表达因一些5’近端内含子的存在而增强(参见Callisetal.(1987)GenesandDevelopmentl:1183-1200(Callis等人，1987年，《基因与发育》，第I卷，第1183-1200页)；Kyozukaetal.(1990)Maydica35:353-357(Kyozuka等人，1990年，《Maydica》,第35卷，第353-357页))。⑶S基因的使用允许通过针对⑶S酶活性的组织化学染色组织观察由启动子指导的表达模式。[0097]再生出二十六个⑶S事件并且在温室条件下培育，直至它们达到范围从V4至V6的生长期。由植株上的围绕叶(collaredleaves)数目确定营养生长期。因此,V6期的植株具有6片完全围绕的叶子。从处于这个时期的每个植株采集叶和根组织样品。然后允许各植株生长至Rl早期，这是正好在花粉散播之前的时间，此时收集花丝、茎杆以及穗组织。最终，当植株开始散播花粉时收集花粉。[0098]来自Sb_RCc3:⑶S的结果显示Sb_RCc3启动子在玉蜀黍根中驱动表达。在根的成熟区中(主要在皮质中)检测到表达。在根尖中，在伸长区中检测到表达，但在分生组织中或在根冠中检测不到表达。在叶、穗或花丝组织中检测不到表达。在花粉中也检测不到表达。茎杆未显示表达；然而，在大约半数事件中，在外皮的脉管中检测到表达。相对于根中的表达水平，该表达不够强。[0099]表1:Sb-RCc3:⑶S的玉蜀黍表汰结果1[0101]I组织化学染色数据按O至3标度表示，以充分表征的玉蜀黍Ub1-1启动子作为参考点。Ub1-1启动子是几乎所有玉蜀黍组织中的强组成型启动子。[0102]在温室中评估表达Sb_RCc3:1Gl的二十四种转基因玉蜀黍植物和表达Sb-RCc3:ADH内含子:IG1的15种植物。对根(包括根尖和成熟组织一起)和叶材料的定量ELISA显示表达仅在具有两种载体的根中发生。这支持使用GUS作出的观察结果。为了增加表达，包含ADH内含子。然而，使用Sb-RCc3的表达比没有ADH内含子的情况下好约2.7倍。Sb-RCc3:1Gl相对于公知的玉蜀黍遍在蛋白启动子的表达要低约2倍。[0103]表2:Sb~RCc3和IGl的玉蜀黍表汰结果1[0105]I组织化学染色数据按O至3标度表示，以充分表征的玉蜀黍Ub1-1启动子作为参考点。Ub1-1启动子是几乎所有玉蜀黍组织中的强组成型启动子。[0106]实例4:使用农杆菌介导转化法的转基因植物转化和再生[0107]对于农杆菌介导的用各实施例的Sb_RCc3启动子序列转化玉蜀黍，利用Zhao的方法(美国专利N0.5，981，840(下文中为‘840专利)和PCT专利公布W098/32326;将所述专利的内容以引用方式并入本文)。[0108]将农杆菌在800培养基主平板上培育并且于28°C在黑暗下培养3天，并且此后在4°C保存最多一个月。将农杆菌的工作平板在810培养基平板上培育并且于28°C在黑暗中孵育一至两天。[0109]简而言之，从新鲜的无菌玉米穗中剖取胚并且将其保持在561Q培养基中直至收集到全部所需胚。随后使胚与从工作平板制备的农杆菌悬液接触，其中所述农杆菌包含具有各实施例的启动子序列的质粒。将胚与农杆菌在562P平板上共同培养，如按‘840专利方案，胚在平板板上按轴朝下放置。[0110]在562P培养基上一个星期之后，将胚转移至5630培养基。按2个星期的间隔在新鲜的5630培养基上对胚进行继代培养并且在相同条件下继续孵育。在选择6至8星期之后，愈伤组织事件开始出现。[0111]在愈伤组织达到合适尺寸之后，将愈伤组织在再生(288W)培养基上培养并且保持在黑暗下2至3个星期以引发植物再生。在体细胞胚成熟后，将发育良好的体细胞胚转移到培养基用于萌发(272V)并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将正在发育的小植株转移到管中的无激素272V培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的盘插入孔(相当于2.5〃英寸盆)，并且在生长室培育I星期，随后在温室培育另外I至2个星期，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并培育至成熟。[0112]农杆菌介导的转基因S蜀黍植物的转化和再生所使用的培养基:[0113]561Q培养基包含4.0g/LN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0mL/LEriksson维生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、68.5g/L鹿糖、36.0g/葡萄糖、1.5mg/L2，4-D和0.69g/LL-脯氨酸(用KOH调节至pH5.2后以去离子水定容);2.0g/LGelrite?(用去离子水定容后加入)；及8.5mg/L硝酸银(将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。[0114]800培养基包含50.0mL/L母液A和850mL去离子水，并且用去离子水减去100mL/L后定容，此后加入9.0g植物琼脂。在灭菌和冷却之后，加入50.0mL/LBA母液B，连同5.0g葡萄糖和2.0mL的50mg/mL壮观霉素的母液。母液A包含60.0gK2HPO4和20.0g磷酸二氢钠，其溶解于950mL水中，用KOH调节至pH7.0，并且用去离子水定容为1.0L。母液B包含20.0gNH4Cl'6.0gMgSO4.7H20、3.0g氯化钾、0.2gCaCl2和0.05gFeS04.7H20，全部均用去离子水定容、灭菌并且冷却。[0115]810培养基包含5.0g酵母提取物(Difco)、10.0g蛋白胨(Difco)、5.0g氯化钠，其溶解于去离子水中，并且在调节pH至6.8之后定容。随后加入15.0g细菌琼脂，将溶液灭菌并冷却，并且加入1.0mL的50mg/mL壮观霉素母液。[0116]562P培养基包含4.0g/LN6基础盐(SIGMAC-1416)、LOmL/LEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L2,4-D(用KOH调至pH5.8后以去离子水定容)；3.0g/LGelrite?(用去离子水定容后加入)；以及0.85mg/L硝酸银和1.0mL的IOOmM乙酰丁香酮母液(均在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。[0117]5630培养基包含4.0g/LN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0mL/LEriksson维生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、30.0g/L蔗糖、1.5mg/L2,4_D、0.69gL-脯氨酸和0.5gMES缓冲液(用KOH调至pH5.8后以去离子水定容)。然后，加入6.0g/LUltrapure?琼脂-琼脂(EM科学公司(EMScience))并且将培养基灭菌并冷却。随后，加入0.85mg/L硝酸银、3.0mL的lmg/mL双丙氨磷母液和2.0mL的50mg/mL羧节青霉素母液。[0118]288W包含4.3g/LMS盐(GIBC011117-074)、5.0mL/LMS维生素母液(0.1OOg烟酸、0.02g/L盐酸硫胺素、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精炼去离子水定容)(MurashigeandSkoog(1962)Physiol.Plant.15:473(Murashige和Skoog,1962年，《植物生理学》，第15卷,第473页))、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素和60g/L鹿糖,其在调至ρΗ5.6之后用精炼去离子水定容。之后，加入6.0g/L的Ultrapure?琼脂-琼脂(EM科学公司(EMScience))并且将培养基灭菌和冷却。随后，加入1.0mL/L的0.1mM脱落酸、1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙氨膦,连同2.0mL的50mg/mL羧节青霉素母液。[0119]无激素培养基(272V)包含4.3g/LMS盐(GIBC011117-074),5.0mL/LMS维生素母液(0.100g/L烟酸、0.02g/L盐酸硫胺素、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.lg/L肌醇和40.0g/L鹿糖(调节pH至5.6后用精制去离子水定容)；以及6g/L细菌琼脂(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却到60°C。[0120]实例5=RCc3启动子的缺失分析[0121]使用天然在启动子中以下位置处存在(3’至5’方向读取)的限制性核酸内切酶切割位点，可以将1710bpRCc3启动子分成5个300至400bp的区域=BAMHI(0),BglII(232),BspMI(545)、StuI(941)、NheI(1354)和NotI(1710)。这提供了生成四个5’启动子截短物的机会。植物中测试这些截短物可以提供对该启动子的表达和根优选性中起重要作用的启动子区域认识。[0122]用Not1-NheI限制性核酸内切酶消化RCc3启动子导致产生1354bp启动子片段，称为TR1。用NotI和StuI消化得到了941bp启动子片段，而用NotI和BspMI消化得到了545bp片段，分别称为TR2和TR3。用NotI和BglII切割启动子得到了232bp的启动子片段，称为TR4。将这些片段中的每一个纯化并且连接到表达盒内，这导致每个启动子片段可操作地连接到B-葡糖苷酸酶(CTS)基因。[0123]对于每个截短物，再生出二十五个转基因玉蜀黍事件并且在温室条件下培育。对叶和根材料取样以进行组织化学⑶S染色分析时，植物发育至V6/7期。随后将这些植物培育至R1-R2期并且对茎杆、穗和花粉取样。结果显示各截短物均不影响叶、茎杆和花粉中的表达。在这些组织的任何一者中检测不到GUS表达(表3)。另外也对围绕茎杆的外皮组织检查表达，并且检测不到任何表达(数据未示出)。除用232bp启动子片段转化的I个植株之外,在穗中也检测不到表达。[0124]根中的表达并未不利地受截短物影响(表3)。总体保留整体表达模式，但包括分生组织区和部分伸长区的根尖中的表达水平随着启动子截短而降低。包含推定TATA框的232bp启动子片段未呈现任何根表达。[0125]可以在RCc3启动子中鉴定到多个基序，例如R00TM0TIFTAP0X1(ATATT)(数据未示出)。然而，启动子的截短表明RCc3启动子具有提供功能性冗余的序列，或者用于表达和根优选的关键序列位于BspM1-BamHl片段上。根优选表达维持至BspMI裂解位点，但在将启动子截短至BglII裂解位点时，使得启动子无功能。[0126]表3:缺失分析结果【权利要求】1.一种分离的核酸分子，其包含选自下列的核苷酸序列:a)包含SEQIDNO:1中示出的序列或其互补序列的核苷酸序列；b)包含以专利保藏号NRRLB-50462保藏的质粒的植物启动子序列或其互补序列的核苷酸序列；以及c)包含SEQIDNO:1中示出的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录。2.表达盒，其包含根据权利要求1所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接到目的异源核苷酸序列。3.一种载体,包含权利要求2所述的表达盒。4.植物细胞,其包含权利要求2所述的表达盒。5.根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述表达盒稳定整合到所述植物细胞的基因组中。6.根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。7.根据权利要求6所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。8.根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。9.一种植物,其包含权利要求2所述的表达盒。10.根据权利要求9所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。11.根据权利要求10所述的植物，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。12.根据权利要求9所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。13.根据权利要求9所述的植物，其中所述表达盒稳定掺入到所述植物的基因组中。14.根据权利要求13所述的植物的转基因种子，其中所述种子包含所述表达盒。15.根据权利要求9所述的植物，其中所述目的异源核苷酸序列包含赋予对除草剂、盐、寒冷、干旱、病原体或者昆虫的抗性的基因产物。16.—种在植物或植物细胞中表达核苷酸序列的方法，所述方法包括将包含可操作地连接到目的异源核苷酸序列的表达盒引入所述植物或植物细胞中，其中所述启动子包含选自以下的核苷酸序列:a)包含SEQIDNO:1中示出的序列的核苷酸序列；b)包含命名为专利保藏号NRRLB-50462的质粒的植物启动子序列的核苷酸序列；以及c)包含SEQIDΝΟ:1中示出的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物中引发转录。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述目的异源核苷酸序列包含赋予对除草剂、盐、寒冷、干旱、病原体或昆虫的抗性的基因产物。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述目的异源核苷酸序列以根优选方式表达。19.一种在植物中以根优选方式表达核苷酸序列的方法,所述方法包括将表达盒引入到植物细胞中并从所述植物细胞再生出植物，所述植物使所述表达盒稳定掺入其基因组中，所述表达盒包含可操作地连接到目的异源核苷酸序列的启动子，其中所述启动子包含选自以下的核苷酸序列:a)包含SEQIDNO:1中示出的序列的核苷酸序列；b)包含以专利保藏号NRRLB-50462保藏的质粒的所述植物启动子序列的核苷酸序列；以及c)包含SEQIDNO:1中示出的序列的至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物根细胞中引发转录。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述目的异源核苷酸序列的表达改变所述植物的表型。【文档编号】C07K14/415GK103476934SQ201280008988【公开日】2013年12月25日申请日期:2012年2月13日优先权日:2011年2月15日【发明者】S.迪恩,B.彼得森-伯奇申请人:先锋国际良种公司