Fc变体及其生成方法

Fc变体及其生成方法
【专利摘要】本文中描述了Fc变体及用于有效生成抗体和其它多聚体蛋白质复合物（在本文中统称为异多聚体蛋白质）的方法。异多聚体蛋白质可能能够特异性结合超过一个靶物。靶物可以是例如单一分子上的或位于不同分子上的不同表位。该方法组合了异多聚体蛋白质的有效高基因表达水平、适宜的装配、及容易的纯化。本发明还提供了使用这些异多聚体蛋白质的方法，及包含这些抗体的组合物、试剂盒和制品。
【专利说明】Fe变体及其生成方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年2月4日提交的、题为“Fe变体及其生成方法”的美国临时专利申请流水号61/439，750的优先权。
发明领域
[0003]本发明涉及Fe变体、其生成方法、及包含Fe变体的抗体和Fe融合物。
[0004]发明背景
[0005]IgG型的单克隆抗体含有两个相同的抗原结合臂和一个恒定域(Fe)。在它们的结合臂中具有不同特异性的抗体通常不天然存在，因此不得不借助化学工程(例如化学交联、等)、重组DNA和/或细胞融合技术来创建。[0006]双特异性抗体能同时结合两种不同抗原。这种特性能够开发对于常规单克隆抗体不可能的治疗策略。已经开发的一大组想象出来的双特异性抗体形式反映对这些分子的强烈兴趣。参加 Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., “Bispecific antibodiesthat mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus ofany strain, jTroc Natl Acad Sci USA (1991) 88 (11): 4723-4727及Fischer N and Leger0., “Biospecific Antibodies:Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies，”Pathobiology(2007)74:3-14。
[0007]另一类多特异性分子是重组融合蛋白。由免疫调节性蛋白质的胞外域和免疫球蛋白(Ig)的恒定(Fe)域组成的重组融合蛋白代表一类发展中的人治疗剂。免疫粘附素组合具有期望特异性的蛋白质序列的结合区与抗体的效应域。免疫粘附素具有两项对于它们作为治疗剂的潜力有重大意义的重要特性:靶特异性，和药动学稳定性(体内半衰期与抗体的相当)。免疫粘附素可作为拮抗剂用于抑制或阻断有害相互作用，或者可作为激动剂用于模拟或增强生理应答。参见Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al.，“A humanized, bispecificimmunoadhesin-antibody that retargets CD3+effectors to kill HlV—l—infectedcells, ”J Hematotherl995;4(5):439-446。
[0008]其它地方已经讨论了其它多特异性分子。例子包括但不限于:Fisher etal.,Pathobiology (2007) 74:3-14 (各种双特异性形式的综述)；2003年12月9日公告授予Feige等人的美国专利N0.6，660, 843 (肽体(peptibody) ) ；2002年I月10日公布的美国专利公开文本N0.2002-004587 (多特异性抗体)；2009年11月3日公告授予Wu等人的美国专利N0.7612181 (双重可变域形式)；美国专利N0.6，534，628 ;Nord Ket al.,Prot Eng (1995)8:601-608 ；Nord K et al.，Nat Biotech(1997) 15:772-777 ;及
Gronwall et al., Biotechnol Appl Biochem.(2008) Jun; 50 (Pt2):97-112 (Affibodies)；Martens et al., Clin Cancer Res (2006)，12:6144-6152 及 Jin et al., CancerRes (2008) 68 (I I):4360-4368 (单臂抗体);Bostrom et al.，Science (2009) 323:1610-1614(双重作用Fab，aka混合效价抗体)。本领域技术人员知道其它形式。
[0009]临床级材料的制造对于一般的抗体，尤其对于上文所述多特异性分子仍然是挑战。如上所述，有多种路径生成具有混合结合臂(即彼此不同的结合臂)的分子。这些方法均具有其缺点。
[0010]化学交联费力，因为可能仍需要自同二聚体和其它不想要的副产物纯化有关种类。另外，化学修饰步骤会改变蛋白质的完整性，如此导致较差的稳定性。如此，这种方法常常无效且会导致抗体活性损失。
[0011]细胞融合技术(即杂合杂交瘤)表达两种重链和两种轻链，它们随机装配导致产生10种抗体组合。期望的异多聚体抗体只是如此生成的抗体中的一小部分。期望异多聚体蛋白质的纯化显著降低生产产量并提高制造成本。
[0012]重组DNA技术已经用于生成不包含Fe域的各种异多聚体形式，例如单链Fv、双抗体、等。这种类型的抗体分子的主要缺点是缺乏Fe域和因此抗体触发效应器功能(例如补体活化、Fe受体结合等)的能力。如此，想要包含功能性Fe域的双特异性抗体。
[0013]重组DNA技术还已经用于生成“节入穴”双特异性抗体。参见美国专利申请20030078385 (Arathoon等人-Genentech)。这种策略的一项约束是两种亲本抗体的轻链必须相同以防止错配和形成不想要的和/或无活性的分子(由于在同一细胞中表达)。
[0014]另外，退火和纯化期间的限制性事件是氧化还原效率。氧化的异二聚体通常只占这个步骤后蛋白质的70-80% (BioAnalyzer和MS-T0F)。剩余20-30%的抗体是二聚体且缺乏共价连接(SEC-LLS)。这可以消除但显著影响总体产量。如此，仍然需要改进抗体生成，尤其是异二聚体的总体产量。本文中描述了可改进抗体、异二聚体诸如此类的总体产量的Fe变体以及用于生成它们的方法。本发明的这些和其它方面和优点根据对本文中提供的发明的描述会是明显 的。
[0015]发明概述
[0016]使用当前技术生成异多聚体蛋白质(例如多特异性抗体)具有一些缺点，包括生成产物混合物、产量降低和效应器功能降低/消除等等。如此，期望高效且高水平生成异多聚体蛋白质。
[0017]通过各种手段生成抗体分子一般得到较好理解。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)记载了一种用于重组生成免疫球蛋白的方法，其中同时自单一载体或自两个分开的载体(在单一细胞中)表达重和轻链。Wibbenmeyer等人(1999，Biochim BiophysActal430 (2): 191-202)及 Lee 和 KwakC2003, J.BiotechnologylOl: 189-198)记载了自使用在分开的大肠杆菌培养物中表达的质粒分开生成的重和轻链生成单克隆抗体。与抗体生成有关的各种其它技术记载于例如 Harlow, et al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)及 W02006028936。这些均仍存在缺点，诸如低产量、使用化学品、等。
[0018]本文中公开了在为改进异多聚体蛋白质生成中的总体产量提供基础的氨基酸残基处包含至少两处突变的Fe变体。
[0019]本发明提供一种简单且有效的生产工艺/方法，其容许经济地生成包含变体Fe多肽的异多聚体蛋白质(例如多特异性抗体)。
[0020]在第一个实施方案中，提供了变体异多聚体蛋白质，其包含野生型Fe多肽的Fe变体。在各种实施方案中，Fe变体在所述野生型Fe多肽的Fe区中包含至少一处、两处、三处、四处、五处、六处、七处、八处、九处或十处氨基酸修饰，导致与野生型Fe多肽相比展现降低的错配(例如节/节配对)、降低的头-尾形成或升高的总体产量的变体蛋白质。在一些实施方案中，优选的是Fe变体包含两处、三处或四处能够破坏同二聚体形成的氨基酸修饰，如本文中描述的。在一些实施方案中，Fe变体包含至少一条重链上残基241和243处用与野生型Fe多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸进行的替代。在一些实施方案中，至少一条重链上的突变选自F241R/F243S和F241R/F243S。在一些实施方案中，Fe变体进一步包含节-入-穴修饰(knob-1nto-hole modification) ?
[0021]在第二个实施方案中，提供了一种分离的核酸，其编码本文中描述的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。
[0022]在第三个实施方案中，提供了一种表达载体，其编码本文中描述的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体 。
[0023]在第四个实施方案中，提供了一种宿主细胞，其包含本文中描述的核酸分子或包含该核酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞为CHO细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌细胞。
[0024]在一个实施方案中，生成本文所述变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体的方法包括:
[0025](a)培养宿主细胞；并
[0026](b)自细胞培养物回收变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。
[0027]在一些实施方案中，所述回收包含裂解细胞。
[0028]在一些实施方案中，制备异多聚体蛋白质(包括包含具有第一异二聚化域的含第一 Fe多肽和具有第二异二聚化域的第二含Fe多肽的异多聚体蛋白质)的方法，其中第二异二聚化域与第一异二聚化域相互作用，且其中第一和第二含Fe多肽通过至少一个链间二硫键连接，该方法包括下述步骤:
[0029](a)提供纯化的具有第一异二聚化域的第一含Fe多肽；
[0030](b)提供纯化的具有第二异二聚化域的第二含Fe多肽；
[0031](c)组合第一和第二含Fe多肽；
[0032](d)将第一含铰链多肽与第二含铰链多肽重折叠；并
[0033](e)回收所述异多聚体蛋白质复合物。
[0034]在一些实施方案中，第一和第二含Fe多肽进一步包含便于含Fe多肽相对于彼此正确取向的突变。在一些实施方案中，突变包含至少一条重链上残基241和243处用与野生型Fe多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸进行的替代。
[0035]在一个实施方案中，提供了通过本文所述方法生成的异多聚体蛋白质。
[0036]要理解，本发明的方法可包括其它步骤，它们一般是对于启动和/或完成本文所述发明的方法涵盖的过程而言明显的例行步骤。例如，在一个实施方案中，本发明方法的步骤(a)之前有这样的步骤，其中将编码Fe变体多肽的核酸导入第一宿主细胞，并将编码第二含铰链多肽的核酸导入第二宿主细胞。在一个实施方案中，本发明方法进一步包含纯化对至少两种不同靶物具有结合特异性的异多聚体蛋白质的步骤。在一个实施方案中，在纯化异多聚体蛋白质的步骤之前不超过约10%、15%、20%或30%的分离的多肽以单体和/或重-轻链二聚体存在。在一个实施方案中，单体可以少于约30%的不想要的多肽污染物，该污染物需要在纯化异多聚体蛋白质之前除去。[0037]在一个实施方案中，第一和/或第二含Fe多肽是抗体重链。在又一个实施方案中，抗体重链与抗体轻链配对以提供重-轻链对。在一些实施方案中，重-轻链对共价连接。在另一个实施方案中，重-轻链对定义靶物结合臂。在一些实施方案中，靶物结合臂是相同的。在一些实施方案中，靶物结合臂各识别两种不同靶物。
[0038]在另一个实施方案中，第一和/或第二含Fe多肽包含可变重链域。在另一个实施方案中，第一和/或第二含Fe多肽包含受体结合域。在一些实施方案中，第一和/或第二含Fe多肽是基本上相同的(即异二聚化域可以是不同的，而异二聚化域以外的区域是相同的)。在一些实施方案中，第一和/或第二含Fe多肽是不同的。
[0039]在一些实施方案中，异多聚体蛋白质选自下组:抗体，双特异性抗体，多特异性抗体，单臂抗体，单特异性单价抗体，多特异性单价抗体，双特异性聚体(maxibody)，免疫粘附素，肽体(peptibody),双特异性肽体,单价肽体,亲合体(affibody)和受体融合蛋白。 [0040]在一些实施方案中，所述异多聚体蛋白质包含具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、或任何整数直至所有在正常情况下能够形成重链间二硫化物连接的半胱氨酸残基的铰链区。在一些实施方案中，将别的半胱氨酸引入铰链区中。
[0041]本发明的异多聚体蛋白质也可以是抗体片段，诸如例如Fe或Fe融合多肽，只要它包含免疫球蛋白的Fe区。Fe融合多肽一般包含融合至异源多肽序列(诸如抗原结合域)的Fe多肽(或其片段)，诸如融合至免疫球蛋白Fe多肽的受体胞外域(ECD)(例如融合至IgG2Fc的Flt受体E⑶)。例如，在一个实施方案中，Fe融合多肽包含VEGF结合域，其可以是VEGF受体，其包括fit、flk、等。本发明的异多聚体蛋白质一般包含重链恒定域和轻链恒定域。在一个实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质包含修饰(例如但不限于插入一个或多个氨基酸，例如为了形成二聚化序列诸如亮氨酸拉链)，用于形成重链间二聚化或多聚化。在这些实施方案的一些中，异多聚体蛋白质包含二聚化域(诸如亮氨酸拉链序列)，例如融合至重链片段的C端。在这些实施方案的一些中，异多聚体蛋白质包含二聚化域，其包含突变以提供“节入穴”二聚化域(如下文进一步定义的)。
[0042]在本发明的方法和异多聚体蛋白质的一些实施方案中，含Fe多肽包含至少一项特征，其促进含Fe多肽相对于彼此正确取向，同时改进第一和第二含Fe多肽的总体产量。此类特征改进通过本文中描述的发明的方法可获得的异多聚体蛋白质群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，第一含Fe多肽和第二含Fe多肽的Fe多肽在界面处相遇/相互作用。在其中第一和第二含Fe多肽的Fe多肽在界面处相遇的一些实施方案中，第二 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第一 Fe多肽的界面中的空腔中。在一个实施方案中，第一 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔，或者第二 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第一 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔且第二 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第二 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第一 Fe多肽的界面中的，其中空腔或隆起或二者已经分别引入第一和第二 Fe多肽的界面中。在其中第一和第二Fe多肽在界面处相遇的一些实施方案中，第一 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第二 Fe多肽的界面中的空腔中。在一个实施方案中，第二 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔，或者第一 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第二 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码空腔且第一 Fe多肽已经自模板/初始多肽改变以编码隆起，或二者兼之。在一个实施方案中，第一 Fe多肽的界面包含的隆起可放置在第二 Fe多肽的界面中的空腔中，其中隆起或空腔或二者已经分别引入第一和第二 Fe多肽的界面中。
[0043]在一个实施方案中，隆起和空腔各自包含天然存在氨基酸残基。在一个实施方案中，包含隆起的Fe多肽如下生成，即将来自模板/初始多肽的界面的初始残基用具有比初始残基更大的侧链体积的输入残基替换。在一个实施方案中，包含隆起的Fe多肽通过如下方法生成，其包括其中将编码来自所述多肽的界面的初始残基的核酸用编码具有比初始更大的侧链体积的输入残基的核酸替换的步骤。在一个实施方案中，初始残基为苏氨酸。在一个实施方案中，输入残基为精氨酸(R)。在一个实施方案中，输入残基为苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，输入残基为酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，输入残基为色氨酸(W)。在一个实施方案中，输入残基为R、F、Y或W。在一个实施方案中，通过替换模板/初始多肽中的两个或更多个残基来生成隆起。在一个实施方案中，包含隆起的Fe多肽包含将第366位苏氨酸用色氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat et al.(pp.688_696in Sequences ofproteins of immunological interest, 5th ed.，Vol.1(1991;NIH, Bethesda, MD))的EU编号方案。
[0044]在一些实施方案中，包含空腔的Fe多肽如下生成，即将模板/初始多肽的界面中的初始残基用具有比初始残基更小的侧链体积的输入残基替换。例如，包含空腔的Fe多肽可以通过如下方法生成，其包括其中将编码来自所述多肽的界面的初始残基的核酸用编码具有比初始更小的侧链体积的输入残基的核酸替换的步骤。在一个实施方案中，初始残基为苏氨酸。在一个实施方案中，初始残基为亮氨酸。在一个实施方案中，初始残基为酪氨酸。在一个实施方案中 ，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中,输入残基为丙氨酸(A)。在一个实施方案中，输入残基为丝氨酸(S)。在一个实施方案中，输入残基为苏氨酸(T)。在一个实施方案中，输入残基为缬氨酸(V)。可以通过替换模板/初始多肽的一个或多个初始残基来生成空腔。例如，在一个实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含替换两个或更多个选自下组的初始氨基酸:苏氨酸，亮氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含两个或更多个选自下组的输入残基:丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含替换两个或更多个选自下组的初始氨基酸:苏氨酸，亮氨酸和酪氨酸，且其中所述初始氨基酸用选自下组的输入残基替换:丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸。在一个实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含将第366位苏氨酸用丝氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在一个实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含将第368位亮氨酸用丙氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在一个实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含将第407位酪氨酸用缬氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在一个实施方案中，包含空腔的Fe多肽包含两个或更多个选自下组的氨基酸替换:T366S，L368A和Y407V，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。在这些抗体片段的一些实施方案中，包含隆起的Fe多肽包含将第366位苏氨酸用色氨酸替换，氨基酸编号方式依照Kabat等人，见上文的EU编号方案。
[0045]在一个实施方案中，第一 Fe多肽和/或第二 Fe多肽的界面已经突变以包含至少一条重链上残基241和243处用与野生型Fe多肽中存在的氨基酸不同的氨基酸进行的替代。在一些实施方案中，至少Fe多肽(例如一条重链)上的突变选自F241R/F243S和F241R/F243S。在一些实施方案中，Fe变体进一步包含节-入-穴修饰。
[0046]在各种实施方案中，第一和第二重链多肽的Fe多肽可以相同或不同，前提是它们能够二聚化以形成Fe区(如本文中定义的)。第一 Fe多肽一般连续连接至单一多肽中的一个或多个免疫球蛋白重链域，例如具有铰链、恒定和/或可变域序列。在一个实施方案中，第一 Fe多肽包含铰链序列的至少一部分(包括整个)、Ch2域的至少一部分(包括整个)和/或Ch3域的至少一部分(包括整个)。在一个实施方案中，第一 Fe多肽包含免疫球蛋白的铰链序列和Ch2和Ch3域。在一个实施方案中，第二 Fe多肽包含铰链序列的至少一部分(包括整个)、Ch2域的至少一部分(包括整个)和/或G3域的至少一部分(包括整个)。在一个实施方案中，第二 Fe多肽包含免疫球蛋白的铰链序列和Ch2和Ch3域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含第一和第二 Fe多肽，它们各自包含至少一个抗体恒定域的至少一部分。在一个实施方案中，抗体恒定域是Ch2和/或Ch3域。在本发明抗体包含恒定域的任何实施方案中，抗体恒定域可以来自任何免疫球蛋白类别，例如IgG。免疫球蛋白来源可以是任何合适物种来源(例如IgG可以是人IgG1)或合成形式。
[0047]在一个实施方案中，分别在本发明抗体的第一和第二靶物分子结合臂中的第一轻链多肽和第二轻链多肽包含不同/独特抗原结合决定簇(例如不同/独特可变域序列)。在一个实施方案中，分别在本发明抗体的第一和第二靶物分子结合臂中的第一轻链多肽和第二轻链多肽包含相同(即共同)抗原结合决定簇(例如相同可变域序列)。
[0048]本发明的方法能够以高同质性生成异多聚体分子。因而，本发明提供了方法，其中至少约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的多肽在包含第一重和轻链多肽对和第二重和轻链多肽对的复合物中。在一个实施方案中，本发明提供了方法，其中介于约60和99%、70和98%、75和97%、80和96%、85和96%、或90和95%之间的多肽在包含第一重和轻链多肽对和第二重和轻链多肽对的复合物中。
[0049]在一个实施方案中，本发明的抗体选自下组:IgG，IgE，IgA，IgM和IgD。在一些实施方案中，本发明的抗体的铰链区优选为选自下组的免疫球蛋白的:IgG，IgA和IgD。例如，在一些实施方案中，抗体或抗体铰链区是IgG的，其在一些实施方案中是IgGl或IgG2 (例如IgG2a或IgG2b)。在一些实施方案中，本发明的抗体选自下组:IgG，IgA和IgD。在一个实施方案中，抗体是人、人源化、嵌合或非人(例如鼠)起源的。
[0050]本发明的异多聚体蛋白质一般能够结合(优选特异性地)抗原。此类抗原包括例如肿瘤抗原、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与(例如知道或怀疑在功能上有助于)组织发育或分化的相关的分子、细胞表面分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及脉管发生(vasculogenesis)的分子和与(例如知道或怀疑在功能上有助于)血管发生(angiogenesis)相关的分子。本发明的异多聚体蛋白质能够结合的抗原可以是上述范畴之一的子集的成员，其中所述范畴的其它子集包含具有不同特征(就感兴趣抗原而言)的其它分子/抗原。也可以认为感兴趣抗原属于两个或更多个范畴。在一个实施方案中，本发明提供了结合(优选特异性地)并非细胞表面分子的肿瘤抗原的异多聚体蛋白质。在一个实施方案中，肿瘤抗原是细胞表面分子，诸如受体多肽。在另一个例子中，在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合(优选特异性地)并非簇分化因子的肿瘤抗原。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质能够结合(优选特异性地)促分化因子，其在一些实施方案中不是例如CD3或CD4。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质是抗VEGF抗体。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质是选自下组的双特异性抗体:IL-1 a/IL-1β，IL-12/IL-18;IL-13/IL_9;IL-13/IL_4 ;IL-13/IL_5 ;IL-5/IL_4 ;IL_13/IL-1β ；IL-13/IL-25 ;IL_13/TARC ;IL_13/MDC ;IL_13/MEF ；IL-13/TGF-^ ;IL_13/LHR 激动剂；IL-12/TWEAK, IL-13/CL25 ;IL_13/SPRR2a ;IL_13/SPRR2b ；IL-13/ADAM8, IL-13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20 ;CD138/CD40 ;CD19/CD20 ；CD20/CD3 ；CD38/CD 138 ；CD38/CD20 ;CD38/CD40 ;CD40/CD20 ;CD-8/IL_6 ;CD20/BR3，TNF a /TGF- β , TNF a /IL-1 β ；TNFa /IL-2，TNF a /IL-3，TNF a /IL-4，TNF a /IL-5，TNF a /IL6,TNF a /IL8,TNF a /IL-9, TNF a /IL-10,TNF a /IL-ll,TNFa /IL-12, TNF a /IL-13, TNFa /IL-14, TNFa /IL-15,TNF a /IL-16, TNF a /IL-17，TNF a /IL-18，TNF a /IL-19，TNF a /IL-20，TNF a /IL-23，TNF a /IFN a , TNF a /CD4，TNF a /VEGF, TNF a /MIF, TNF a /ICAM-1, TNF a /PGE4, TNF a /PEG2, TNF a /RANK 配体，TNF a /Te38 ；TNF a /BAFF ；TNF a /CD22 ；TNF a /CTLA-4 ；TNF a /GPI30 ；TNFa /IL-12p40 ；VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, HER2/DR5, VEGF/IL-8，VEGF/MET, VEGFR/MET 受体，VEGFR/EGFR,HER2/CD64，HER2/CD3，HER2/CD16，HER2/HER3 ；EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R， TNFR1/IL-18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28,EGFR/CD64， CSPGs/RGM A ;CTLA_4/BTN02 ；IGF1/IGF2 ；IGFl/2/Erb2B ；MAG/RGM A ；NgR/RGMA；NogoA/RGM A；OMGp/RGM A;PDL-1/CTLA_4 ；和 RGMA/RGM B, ILlβ /IL18, NRP1/VEGFA,VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEGFA/ a 5 β 1，HER1/HER3-BU，和 CMV。在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合至少两种选自下组的靶物分子:α 5β 1，ALKl, ΒΜΡ9,IL-1 a，IL-1 β，TARC, MDC, MEF, TGF- β，LHR 激动剂，TWEAK, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM8,PED2, CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD-8, BR3, TNFa，TGF-β ， IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-8， IL-9， IL-10， IL-11， IL-12， IL-13, IL-14，IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-23, IL-25, IFNa ， MIF,ICAM-1，PGE4，PEG2, RANK 配体，Te38, BAFF, CTLA-4, GP130, IL_12p40，VEGF, VEGF-A, PDGF,HERl，HER2, HER3, HER3-BU，HER4, VEGF-C, VEGF-D, DR5, cMET, MET, MET 受体，VEGFR, EGFR,CD40L，TNFRl，IL-1R，IL-6R，IL-18R，EpCAM，MAPG，CSPGs，BTN02，IGFl，IGF2,IGF1/2,Erb2B,MAG, NgR, NogoA, NRP1, NRP2, OMGp, PDL-1, RGM A 和 RGM B0 在一些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白质结合 CD3 和至少一种选自 BLRl、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180 (RP105)、CR2、FcRHl、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-D0B、和 NAG14 的别的靶物分子。
[0051]本发明的方法中的第一和第二宿主细胞可以以任何允许表达和分离感兴趣多肽的设置来培养。例如，在一个实施方案中，本发明的方法中的第一宿主细胞和第二宿主细胞作为分开的细胞培养物来培养。在另一个实施方案中，本发明的方法中的第一宿主细胞和第二宿主细胞作为包含这两种宿主细胞的混合培养物来培养。
[0052]异多聚体蛋白质可以进行修饰以增强和/或添加别的期望特征。此类特征包括生物学功能诸如免疫效应器功能、期望的体内半衰期/清除、生物利用度、生物分布或其它药动学特征。此类修饰是本领域公知的且也可以凭经验确定，而且可以包括通过可以基于或不基于肽的模块进行的修饰。例如，抗体可以是糖基化的或无糖基化的，一般至少部分取决于宿主细胞的性质。优选地，本发明的抗体是无糖基化的。通过本发明的方法生成的无糖基化抗体可以随后糖基化，例如通过使用本发明公知的体外糖基化方法。如上文和本文所述，本发明的异多聚体蛋白质可以在原核细胞中生成，诸如例如大肠杆菌。大肠杆菌生成的异多聚体蛋白质一般是无糖基化且缺乏在正常情况下与在哺乳动物宿主细胞(例如CHO)生成的异多聚体蛋白质中找到的糖基化概况相关的生物学功能。
[0053]本发明还提供了免疫缀合物，其包含与异源模块缀合的本发明异多聚体蛋白质。任何异源模块会是合适的，只要它与抗体的缀合没有实质性降低期望的抗体功能和/或特征。例如，在一些实施方案中，免疫缀合物包含的异源模块是细胞毒剂。在一些实施方案中，所述细胞毒剂选自下组:放射性同位素，化疗剂和毒素。在一些实施方案中，所述毒素选自下组:加利车霉素(calichemicin),美登素(maytansine)和单端孢菌素(trichothene)。在一些实施方案中，免疫缀合物包含的异源模块是可检测标志物。在一些实施方案中，所述可检测标志物选自下组:放射性同位素，配体-受体对的成员，酶-底物对的成员和荧光共振能量转移对的成员。
[0054]在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含本发明异多聚体蛋白质和载体，载体在一些实施方案中是药学可接受的。[0055]在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含本文所述免疫缀合物和载体，载体在一些实施方案中是药学可接受的。
[0056]在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含一群本发明多特异性异多聚体蛋白质。正如对本领域技术人员会是明显的，一般此类组合物不会是完全(即100%)均质。然而，如本文中描述的，本发明的方法能够生成基本上同质的一群多特异性异多聚体蛋白质。例如，本发明提供了包含异多聚体蛋白质的组合物，其中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的所述异多聚体蛋白质是本文所述发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体、等)。
[0057]在另一个实施方案中，本发明提供了制品，其包括容器和其中装的组合物，其中该组合物包含本发明的异多聚体蛋白质(例如抗体)。在另一个实施方案中，本发明提供了制品，其包括容器和其中装的组合物，其中该组合物包含本文所述免疫缀合物。在一些实施方案中，这些制品进一步包含使用所述组合物的用法说明书。
[0058]在还有另一个实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的异多聚体蛋白质。在还有另一个实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其编码本文所述免疫缀合物。在一些实施方案中，核酸(即多核苷酸)是分离的。
[0059]在一个实施方案中，本发明提供了重组载体，其用于表达本发明的分子(例如抗体)。在另一个实施方案中，本发明提供了重组载体，其用于表达本发明的免疫缀合物。
[0060]本发明的方法中可以使用多种宿主细胞任一。此类细胞是本领域已知的(本文中描述了其中一些)，或者可以关于使用本领域已知的例行技术在本发明的方法中使用的合适性凭经验确定。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，大肠杆菌是脂蛋白缺陷(Λ?ρρ)菌株的。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型缺乏degP和prc基因且包含突变型spr基因。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。[0061]在一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或重组载体。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞，其在一些实施方案中是大肠杆菌。在本发明的方法中，本发明的宿主细胞可以进一步包含编码如下分子的多核苷酸或重组载体，该分子在宿主细胞中的表达提高异多聚体蛋白质的产量。例如，此类分子可以是伴侣蛋白。在一个实施方案中，所述分子是选自下组的原核多肽:DsbA，DsbC, DsbG和FkpA。在一些实施方案中，所述多核苷酸或重组载体编码DsbA和DsbC 二者。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞是内源蛋白酶活性缺陷的菌株的。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型为缺乏degP和prc基因且包含突变型spr基因的大肠杆菌菌株的。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型为Λ?ρρ。
[0062]本发明的异多聚体蛋白质在多种设置中找到多种用途。在一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是治疗性抗体。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是激动性抗体。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是拮抗性抗体。本发明的异多聚体蛋白质也可以是诊断性抗体。在还有另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是阻断性抗体。在另一个例子中，本发明的异多聚体蛋白质是中和性抗体。
[0063]在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗或延迟疾病的方法，所述方法包括将本发明的异多聚体蛋白质施用于所述受试者。在一个实施方案中，疾病是癌症。在另一个实施方案中，疾病与血管发生失调相关。在另一个实施方案中，疾病是免疫病症，诸如类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、等。[0064]在一个实施方案中，本发明提供了本发明的异多聚体蛋白质(例如抗体)在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症)的药物中的用途。
[0065]在一个实施方案中，本发明提供了本发明的核酸在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症)的药物中的用途。
[0066]在一个实施方案中，本发明提供了本发明的表达载体在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症)的药物中的用途。
[0067]在一个实施方案中，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症)的药物中的用途。
[0068]在一个实施方案中，本发明提供了本发明的制品在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症)的药物中的用途。
[0069]在一个实施方案中，本发明提供了本发明的试剂盒在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫(诸如自身免疫)病症和/或血管发生相关病症)的药物中的用途。
[0070]根据下面的详细描述，本发明的其它目的、特征和优点会变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实施例虽然指出本发明的优选实施方案，但是仅仅作为例示给出，因为根据此详细描述，本发明的范围和精神内的各种改变和修饰对本领域技术人员会变得明显。[0071]附图简述
[0072]图1A图示完全氧化的半抗体。未显示“节”或“穴”或其它异二聚化域。此图中描绘的半抗体是IgGl同种型。本领域技术人员会领会，其它免疫球蛋白同种型可作为具有对应链间键和链内键的半抗体来设想。在完整抗体中，铰链半胱氨酸会形成链间二硫键。
[0073]图1B图示全长双特异性抗体。没有描绘铰链区中的重链间二硫键。
[0074]图2A和B图示分别编码节和穴半抗体的质粒。
[0075]图3图示使用分开改造和表达的半抗体生成异多聚体蛋白质，例如双特异性抗体。生成的BsAb通常具有两条不同的重链，各自与其关联轻链配对。在这种方法中，每种半抗体的每条轻链不必相同。
[0076]图4A是使用分开改造和表达的半抗体生成双特异性抗体的流程图。在这种方法中，使用氧化还原化学。
[0077]图4B显示考马斯染色的凝胶。在还原性和非还原性条件下通过SDS-PAGE分析两种半抗体。在非还原性条件下每种半抗体的主要级分是75kD轻链-重链对。在还原性条件(例如用DTT处理)下，每条链作为分开的条带可见。
[0078]图4C显示有和无ImM N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理下半抗体的ES1-TOF质谱术结果。在用NEM处理时没有观察到半抗体的质量变化，指示所有半胱氨酸被完全氧化。氧化型铰链半胱氨酸在所描绘的氨基酸序列中作为环状二硫化物呈现。半抗体的预期质量为72，548道尔顿，这是通过质谱术观察到的，指示没有共价加合物。
[0079]图4D显示抗EGFR/抗c_met双特异性抗体生成的羧甲基(CM)层析图、SDS-PAGE凝胶的照片和去卷积质量。CM层析生成单峰，其随后通过SDS-PAGE来分析。凝胶上的主要条带是全长(即完整)双特异性抗体。在75kD范围处还能看到次要条带。随后通过质谱术分析主要条带，并指示唯一可检测到的完整抗体产物符合抗EGFR/抗c-met双特异性抗体的理论丽。
[0080]图5是使用分开改造和表达的半抗体大规模生成双特异性抗体的流程图。
[0081]图6是节-入-穴Fe异二聚体的图示。在min1-Z域肽存在下使异二聚体结晶(未显示)。使min1-Z肽结合至Ch2-Ch3界面，并推测帮助稳定Fe的CH2区。节和穴结构与两个Ch3域接触，而且与无糖基化野生型IgG1Fc没有显著差异。
[0082]图7是Fe晶体结构分析提示的头-尾配对的图示。该配对可能是氧化还原无效的部分原因。Fe的头-尾配对引起一部分抗体逃脱铰链二硫化物配对。虽然是二聚体，但是它们真正身份的不确定性要求清除它们。这影响退火过程的总体产量/效率，而且仍然是平台改进的靶。
[0083]图8A-D显示不同Fe变体的二聚体含量。Fe的凝胶过滤分析显示不同的二聚化含量。节突变体展现与节和穴二者的野生型形式相比减少的非共价同二聚化。
[0084]图9显示节-节Fe之间的接触区域。小图A显示疏水性接触。节-节Fe同二聚体作为卡通画着色，其中链A为浅色阴影，链B为深色阴影。链A的CH2域中的疏水性残基 Y349、L368、K370、F405 和 Y407 与链 B 的 CH3 域中的残基 F241、F243、V262、和 V264 联合。P395和P396创建两个CH2域之间的疏水性口袋。小图B显示亲水性接触。节-节Fe同二聚体作为卡通画着色，其中链A为浅色阴影，链B为深色阴影。链A的CH2域中的残基T350、K370、和 D399 与链 B 的 CH3 域中的残基 S239、V240、R301、和 Κ334 联合。Ν389、Υ391和Κ392形成两个CH2域之间的相互作用。
[0085]图10是柱形图，显示二硫化物形成，产生正确节-入-穴异二聚体的比率。当将半抗体初始混合在一起时，在时间零看到低水平的同二聚体。随着还原型谷胱甘肽开始还原铰链二硫化物，同二聚体开始消失。随着时间过程前行，谷胱甘肽开始氧化过程，而且看到完整IgG形成的增多。
[0086]图11是来自使用固定化配体进行的实验的一系列表面等离振子共振(SPR)谱曲线。使分析物在配体上通过，并监测同二聚化。在6.25ηΜ、12.5ηΜ、25ηΜ、50ηΜ、100ηΜ和200ηΜ测试分析物浓度。配体是:(A)节野生型，(B)穴野生型，(C)节F241R/F243S，(D)节F241S/F243R，和(E)穴F241S/F243R。y轴显示响应单位，而x周是时间(秒)。
[0087]缩写
[0088]ADCC=抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
[0089]API=抗病原体免疫粘附素
[0090]BPI=杀菌/通透性提高蛋白
[0091]Clq=补体因子Iq
[0092]⑶=分化簇
[0093]⑶C=补体依赖性细胞毒性
[0094]CHl或ChI=重链第一恒定域
[0095]CH2或Ch2=重链第二恒定域
[0096]CH3或Ch3=重链第三恒定域
[0097]CH4或Ch4=重链第四恒定域
[0098]CL或Cl=轻链恒定域
[0099]CTLA=细胞毒性T淋巴细胞相关分子
[0100]Fc=可结晶片段
[0101]Fe Y R=IgG的Fe部分的受体伽马
[0102]HIV=人免疫缺陷病毒
[0103]ICAM=细胞间粘附分子
[0104]BsAb=双特异性抗体
[0105]BsDb=双特异性双抗体
[0106]dsFv= 二硫化物稳定化Fv
[0107]Fc=抗体的恒定片段
[0108]Fd=抗体的 VH+CH1
[0109]FcR=Fc 受体
[0110]Fv=抗体的可变片段
[0111]IgG=免疫球蛋白G
[0112]mAb=单克隆抗体
[0113]PBL=外周血淋巴细胞
[0114]ScDb=单链双抗体[0115]scFv=单链 Fv
[0116](scFv)2=scFv_scFv 串联物
[0117]Tandab=串联双抗体
[0118]VH或Vh=抗体的重链可变域
[0119]VL或Vf抗体的可变域轻链
[0120]发明详述
[0121]现在会通过提述来详细描述本发明，只使用下面的定义和实施例。通过述及明确收录本文中述及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物内公开的所有序列。
[0122]除非本文中另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的含义。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York(1994)及 Hale&Marham, THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)给技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但是描述了优选方法和材料。数值范围包括限定范围的数值。除非另有说明，核酸从左到右以5’至3’方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基方向书写。对于本领域的定义和术语，特别地，实施者可见Sambrook et al.，1989及Ausubel FM et al.，1993。要理解，本发明不限于描述的特定方法、方案、和试剂，因为这些可以变化。
[0123]数值范围包括限定范围的数值。
[0124]除非另有说明，核酸从左到右以5’至3’方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基方向书写。
[0125]本文中提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，这可以通过述及完整说明书而得到。因而，紧接着的下文定义的术语更加完整地通过述及完整说明书来定义。
[0126]1.定义
[0127]“异多聚体”、“异多聚体复合物”、或“异多聚体蛋白质”指至少包含第一含Fe多肽和第二含Fe多肽的分子，其中第二含Fe多肽在氨基酸序列方面与第一含Fe多肽相差至少一个氨基酸残基。异多聚体可包含由第一和第二含Fe多肽形成的“异二聚体”，或者可形成更高等级的三级结构，其中存在除第一和第二含Fe多肽外的多肽。异多聚体的多肽可通过非肽、共价键(例如二硫键)和/或非共价相互作用(例如氢键、离子键、范德华力、和/或疏水性相互作用)彼此相互作用。
[0128]如本文中使用的，“异多聚化域”指对生物学分子的改变或添加，从而促进异多聚体形成及阻碍同多聚体形成。任何较之同二聚体对形成异二聚体具有强偏好的异二聚化域在本发明的范围内。例示性例子包括但不限于例如美国专利申请20030078385 (Arathoon
等人-Genentech ;描述节入穴)；W02007147901 (Kjaergaard等人- Novo Nordisk ;描述
离子相互作用);W02009089004 (Kannan等人-Amgen ;描述静电转向效应(electrostaticsteering effect));美国临时专利申请 61/243, 105 (Christensen 等人-Genentech ;描述卷曲螺旋)。还可参见例如 Pack, P.&Plueckthun, A., Biochemistry31，1579-1584 (1992)，其描述亮氨酸拉链或Pack et al.,Bio/Technologyll, 1271-1277 (1993)，其描述螺旋-转角-螺旋基序。短语“异多聚化域”和“异二聚化域”在本文中可互换使用。
[0129]术语“抗体”在本文中以最广义使用，指任何包含两条重链和两条轻链的免疫球蛋白(Ig)分子，及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要它们展现期望的生物学活性(例如表位结合活性)。抗体的例子包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，如本文中描述的。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
[0130]作为述及的框架，如本文中使用的，抗体会指免疫球蛋白G(IgG)的结构。然而，本领域技术人员会理解/认识到任何免疫球蛋白类别的抗体均可用于本文所述创造性方法。为清楚起见，IgG分子含有一对相同的重链(HC)和一对相同的轻链(LC)。每条LC具有一个可变域(\)和一个恒定域(C)而每条HC具有一个可变(Vh)和三个恒定域(CH1、CH2、和Ch3)。ChI和(^2域通过铰链区连接。这种结构是本领域公知的。见图1B。 [0131]如本文中使用的，“半抗体”指联合的一条免疫球蛋白重链和一条免疫球蛋白轻链。图1A中描绘了一种例示性半抗体。本领域技术人员会容易地领会半抗体也可具有由单个可变域组成的抗原结合域。
[0132]术语“大抗体(maxibody) ”指包含融合的scFv和Fe多肽的融合蛋白。见W02009089004的图8a。双特异性大抗体见W02009089004的图2。
[0133]人IgG Fe区的术语“Ch2结构域”通常依照EU编号系统自IgG的大约残基231延伸至大约340。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测该碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton, Molec.1mmunol.22:161-206 (1985)。
[0134]术语“Ch3结构域”包含Fe区中Ch2结构域C-端的一段残基(即依照EU编号系统自IgG的大约氨基酸残基341至大约氨基酸残基447)。
[0135]如本文中使用的，术语“Fe区”一般指包含免疫球蛋白重链C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体可获得的。Fe区可包含天然或变异Fe序列。虽然免疫球蛋白重链的Fe序列的边界可以变化，但是人IgG重链Fe序列通常定义为自Fe序列大约位置Cys226处的氨基酸残基或自大约位置Pro230至羧基端的区段。除非本文另有规定，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。免疫球蛋白的Fe序列一般包含两个恒定域，即Ch2域和Ch3域，且任选包含Ch4域。“Fe多肽”在本文中表示构成Fe区的多肽之一，例如单体Fe。Fe多肽可以自任何合适的免疫球蛋白获得，诸如IgG1^ IgG2、IgG3、或IgG4亚型,IgA, IgE, IgD或IgM。Fe区包含两条H链的、通过二硫化物保持在一起的羧基端部分。抗体的效应器功能由Fe区中的序列决定；这个区也是在某些类型的细胞上找到的Fe受体(FcR)识别的部分。在一些实施方案中，Fe多肽包含部分或整个野生型铰链序列(一般在它的N端)。在一些实施方案中，Fe多肽不包含功能性或野生型铰链序列。
[0136]“功能性Fe区”拥有天然序列Fe区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括Clq结合；CDC ;Fc受体结合；ADCC ;吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fe区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。
[0137]“天然序列Fe区”包含与在自然界中找到的Fe区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在变体。
[0138]“变异Fe区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替代)而与天然序列Fe区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fe区具有与天然序列Fe区或与亲本多肽的Fe区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fe区中或在亲本多肽的Fe区中具有约I处至约10处氨基酸替代，优选约I处至约5处氨基酸替代。变异Fe区在本文中将优选与天然序列Fe区和/或亲本多肽的Fe区拥有至少约80%的同源性，且最优选至少约90%的同源性，更优选至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同源性。
[0139]如本文中使用的，“Fe成分”指Fe区的铰链区、Ch2结构域或CH3结构域。
[0140]在某些实施方案中，含Fe多肽包含IgG Fe区，优选自野生型人IgG Fe区衍生的。“野生型”人IgG Fe表示氨基酸序列天然存在于人群内。当然，正如Fe序列在个体间可略微变化，可以对野生型序列进行一处或多处改变且仍然保留在本发明的范围内。例如，Fe区可含有与本发明无关的别的改变，诸如糖基化位点中的突变或包括非天然氨基酸。在与节(knob)、穴(hole)或节/穴联合使用时，“野生型”意指只引入节、穴或节/穴突变但在其它方面包含人群内天然存在序列的蛋白质序列。
[0141]术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别 为VH和VL) —般具有类似的结构,其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman和C0.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano 等,J.1mmunol.150:880-887 (1993) ；Clarkson等，Nature352:624-628 (1991)。
[0142]如本文中使用的，术语“Fab”指抗体的抗原结合片段。如上所述，可使用木瓜蛋白酶消化完整抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(即“Fab”片段)和一个残余的“Fe”片段(即Fe区，见上文)。Fab片段由完整L链及H链的可变域(Vh)和重链第一恒定域(ChI)组成。
[0143]如本文中使用的，短语“抗原结合臂”、“靶物分子结合臂”、“靶物结合臂”及其变化形式指本发明的异多聚体蛋白质中有能力特异性结合感兴趣靶物的组成部分。一般且优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列，例如免疫球蛋白轻和重链CDR和/或可变域序列的复合物。
[0144]“靶物”或“靶物分子”指异多聚体蛋白质的结合臂识别的模块。例如，如果异多聚体蛋白质是抗体，那么靶物可以是单一分子上的或不同分子上的表位，或病原体或肿瘤细胞，这取决于上下文。类似地，如果异多聚体蛋白质是受体-Fe融合蛋白，那么靶物会是受体的关联结合配偶。本领域技术人员会领会，靶物由靶物结合臂的结合特异性决定，而且不同革巴物结合臂可识别不同祀物。祀物优选以高于IuM Kd (依照Scatchard分析)的亲和力结合本发明的异多聚体蛋白质。靶物分子的例子包括但不限于血清可溶性蛋白质和/或其受体，诸如细胞因子和/或细胞因子受体、粘附素、生长因子和/或其受体、激素、病毒颗粒(例如RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感、丙型肝炎病毒)、微生物(例如细菌细胞蛋白质、真菌细胞)、粘附素、CD蛋白和其受体。
[0145]“完整”或“全长”抗体的一个例子是包含抗原结合臂以及Q和至少重链恒定域ChU Ch2、和Ch3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。
[0146]如本文中使用的，术语“偶联”指彼此连接第一和第二含Fe多肽，例如形成共价键必需的步骤。此类步骤包括还原、退火和/或氧化第一和第二含Fe多肽的铰链区中的半胱氨酸残基以形成链间二硫键。偶联可以通过化学交联或使用氧化还原系统来实现。参见例如 Humphreys et al.，J.1mmunol.Methods (1998) 217:1-10 及 Zhu et al., CancerLett.， (1994)86:127-134。 [0147]术语“多特异性抗体”以最广义使用，具备涵盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于包含重链可变域(Vh)和轻链可变域(')的抗体，其中Vh'单元具有多表位特异性，具有两个或更多个\和Vh域的抗体，其中每个Vh'单元结合不同表位，具有两个或更多个单一可变域的抗体，其中每个单一可变域结合不同表位，全长抗体，抗体片段诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体,共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶物上的两种或更多种不同表位的能力。“单特异性”指只结合一种表位的能力。依照一个实施方案，多特异性抗体是以5 μ M至0.001ρΜ、3 μ M 至 0.0OlpM, I μ M 至 0.001ρΜ、0.5 μ M 至 0.0OlpM、或 0.1 μ M 至 0.0OlpM 的亲和力结合每种表位的IgG抗体。图1B中提供了双特异性的一种例示性图示。
[0148]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F (ab，)2、和Fv片段；双抗体(Db);串联双抗体(taDb)，线性抗体(例如美国专利 N0.5，641，870 ；Zapata et al., Protein Eng.8 (10): 1057-1062 (1995));单臂抗体，单可变域抗体，微型抗体(minibodies),单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体(例如包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb_CH3和(scFV)4_Fc)。
[0149]表述“单域抗体”(SdAb )或“单可变域(SVD )抗体”一般指其中单一可变域(Vh或')能赋予抗原结合的抗体。换言之，单一可变域不需要与另一可变域相互作用来识别靶抗原。单域抗体由每个抗原结合臂上的单一单体可变抗体域(Vh或')组成。单域抗体的例子包括那些自驼类(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如铰口鲨)衍生的和那些通过重组方法自人和小鼠抗体衍生的(Ward et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley and Flajnik, Dev Comp Immunol(2006)30:43-56;Muyldermans et al., Trend Biochem Sci(2001)26:230-235;Holtet al., Trends Biotechnol(2003):21:484-490;W02005/035572;W003/035694;Davies andRiechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290; W000/29004; W002/051870 )。单可变域抗体可以存在于具有其它可变区或可变域的抗原结合臂(例如同或异多聚体)中，在这种情况中它不是单域抗体。
[0150]如本文所述，术语“节-入-穴”或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起(节)引入一条多肽并将空腔(穴)引入另一条多肽中，在体外或在体内将两条多肽配对在一起的技术。例如，已经在抗体的Fe:Fe结合界面、CL:ChI界面或VH/\界面中引入 KnH (例如 US2007/0178552, W096/027011, W098/050431and Zhu et al.(1997) ProteinScience6:781-788)。这在制造多特异性抗体期间驱动两条不同重链配对在一起中尤其有用。例如，在它们的Fe区中具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fe区的单一可变域，或进一步包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。KnH技术还可用于将两个不同受体胞外域配对在一起或包含不同靶物识别序列的任何其它多肽序列(例如包括亲和抗体(affibody)、肽体(peptibody)和其它Fe融合物) 。
[0151]“Fv”由紧密、非共价联合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结果散发出六个高变环(H和L链各3个环)，其贡献出供抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单一可变域(或只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管常常处于比完整结合位点要低的亲和力。
[0152]“单链Fv”，也缩写成“sFv”或“scFv”，指包含连接成单一多肽链的Vh和\抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含Vh和Vlj域之间的多肽接头,其使得sFv能够形成抗原结合所期望的结构。关于sFv的综述,参见Pluckthun, The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlagj NewYork, pp.269-315(1994);Malmborg et al.，J.1mmunol.Methodsl83:7-13，1995。
[0153]术语“双抗体”指通过在Vh和\域之间用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见前一段)制备的小型抗体片段，短接头使得实现V域的链间而非链内配对，导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的Vh和\域存在于不同多肽链上。双抗体更完整地描述于例如EP404，097 ；W093/11161 ;及 Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。
[0154]术语“单臂抗体”指包含下述的抗体:(I)通过肽键连接至包含Ch2域、Ch3域或Ch2-Ch3域的多肽的可变域和(2)第二 Ch2、Ch3或CH2_CH3域，其中可变域没有通过肽键连接至包含第二 Ch2、Ch3或Ch2-Ch3域的多肽。在一个实施方案中，单臂抗体包含3条多肽:(I)包含可变域(例如Vh)、Ch1、Ch2和Ch3的第一多肽，(2)包含可变域(例如\)和Q域的第二多肽，和(3)包含Ch2和Ch3域的第三多肽。在另一个实施方案中，单臂抗体具有部分铰链区，其含有两个半胱氨酸残基，它们形成连接恒定重链的二硫键。在一个实施方案中，单臂抗体的可变域形成抗原结合区。在另一个实施方案中，单臂抗体的可变域是单一可变域，其中每个单一可变域是一个抗原结合区。在一个实施方案中，单臂抗体是单可变域抗体。
[0155]本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生的或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，前提是它们展现期望的生物学活性(美国专利N0.4，816，567 ;及Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括灵长类化(primatized)抗体，其包含自非人灵长类(例如旧世界猴、猿、等)衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
[0156]非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Joneset al., Nature321:522-525 (1986) ；Riechmann et al., Nature332:323-329 (1988);Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0157]“肽体”指随机生成肽与Fe域的融合物。参见2003年12月9日公告授予Feige等人的美国专利N0.6，660，843(通过述及完整收录)。它们包括连接至N端、C端、氨基酸侧链、或超过一个这些位点的一个或多个肽。肽体技术使之能够设计掺有靶向一种或多种配体或受体、肿瘤归巢肽、膜运输肽、等等的肽的治疗剂。肽体技术已经证明可用于设计多种此类分子，包括线性的和二硫化物约束的肽、“串联肽多聚体”(即单链Fe域上超过一个肽)。参见例如美国专利N0.6，660，843 ；2003年10月16日公布的美国专利申请N0.2003/0195156(对应于2002年11月21日公布的W002/092620) ;2003年9月18日公布的美国专利申请N0.2003/0176352 (对应于 2003 年 4 月 17 日公布的 TO03/031589) ；1999 年 10 月 22 日公布的美国流水号09/422，838 (对应于2000年5月4日公布的W000/24770) ；2003年12月11日公布的美国专利申请N0.2003/0229023 ;2003年7月17日公布的W003/057134 ;2003年12月25日公布的美国专利申请N0.2003/0236193(对应于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989);2003年9月18日提交的美国流水号10/666,480 (对应于2004年4月I日公布的W004/026329)，通过述及将每一篇完整收入本文。
[0158]“亲和抗体(affibody) ”指使用通过肽键连接至Fe区的蛋白质,其中该蛋白质用作支架来提供靶分子的结合表面。该蛋白质常常是天然发生蛋白质，诸如葡萄球菌蛋白A或IgG结合B域、或自其衍生的Z蛋白(参见Nilsson et al (1987), Prot Engl, 107-133及美国专利N0.5，143，844)或其片段或衍生物。例如，可以自对靶分子具有改变的结合亲和力的Z蛋白变体创建亲和抗体，其中通过随机诱变突变Z蛋白的一个区段以创建能够结合靶分子的变体文库。亲和抗体的例子包括美国专利N0.6，534，628，Nord K et al, ProtEng8:601-608(1995)及 Nord K et al, Nat Biotechl5:772-777(1997).Biotechnol ApplBiochem.2008Jun;50(Pt2):97_112。
[0159]在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的分子。在结构上，免疫粘附素包括氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即与抗体的恒定区相比是“异源的”)、具有期望结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合物。例示性的粘附素序列包括包含受体或配体中与目的蛋白质结合的那部分的连续氨基酸序列。粘附素序列还可以是与目的蛋白质结合但不是受体或配体序列的序列(例如肽体(肽体y)中的粘附素序列)。此类多肽序列可通过多种方法来选择或鉴定，包括噬菌体展示技术和高通量分拣方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以自任何免疫球蛋白获得，诸如IgGU IgG2、IgG3、或 IgG4 亚型、IgA (包括 IgAl 和 IgA2)、IgE、IgD、或 IgM。
[0160]如本文中使用的，“复合物”或“复合的”指经由不是肽键的键和/或力(例如范德华、疏水、亲水力)彼此相互作用的两个或更多个分子的联合。在一个实施方案中，复合物是异多聚体。应当理解，如本文中使用的，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括如下的复合物，其具有缀合至蛋白质复合物中蛋白质的非蛋白质实体(例如包括但不限于化学分子,诸如毒素或检测剂)。
[0161]结合感兴趣抗原的本发明异多聚体蛋白质指以足够亲和力结合靶物使得异多聚体蛋白质可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向蛋白质或表达靶物的细胞或组织，且与其它蛋白质没有显著交叉相互作用的异多聚体蛋白质。在此类实施方案中，异多聚体蛋白质结合“非靶”蛋白质的程度会小于抗体对其特定靶蛋白的结合的约10%，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA测定的。关于异多聚体蛋白质对靶分子的结合，术语“特异性结合(特定多肽或特定多肽靶上的表位)”或“特异性结合至(特定多肽或特定多肽靶上的表位)”或“对(特定多肽或特定多肽靶上的表位)特异性的”表示结合可测量地不同于非特异性相互作用(例如，非特异性结合可以是结合牛血清清蛋白或酪蛋白)。特异性结合可以例如通过测定分子的结合，与对照分子的结合比较来测量。例如，特异性结合可以通过与类似靶物的对照分子(例如过量的未标记靶物)竞争来测定。在这种情况中，如果经标记靶物对探针的结合受到过量未标记靶物竞争性抑制，那么指示特异性结合。如本文中使用的，术语“特异性结合(特定多肽或特定多肽靶物上的表位)”或“特异性结合至(特定多肽或特定多肽靶物上的表位)”或“对(特定多肽或特定多肽靶物上的表位)特异性的”可以例如由对靶物具有至少约200nM、或者至少约150nM、或者至少约ΙΟΟηΜ、或者至少约60nM、或者至少约50nM、或者至少约40nM、或者至少约30nM、或者至少约20nM、或者至少约ΙΟηΜ、或者至少约8nM、或者至少约6nM、或者至少约4nM、或者至少约2nM、或者至少约InM、或更大的Kd的分子展现。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指如下的结合，其中异多聚体蛋白质结合特定多肽或特定多肽上的表位且没有实质性结合任何其它多肽或多肽表位。[0162]“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、InM、或更强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。
[0163]在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过表面等离振子共振测定法使用 BIAcore?-2000 或 BIAcore?-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)于 25°C使用固定化靶物(例如抗原)CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’ - (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠PH4.8将抗原稀释至5 μ g/ml (约0.2 μ Μ)，然后以5 μ I/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25°C以约25 μ I/分钟的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS (PBST)中两倍连续稀释的Fab (例如0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore? Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(km)和解离速率(kj。平衡解离常数“心以比率匕^/^^计算。参见例如Chenet al., J Mol Biol293:865-881 (1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25°C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。
[0164]关于本发明异多聚体蛋白质(诸如抗体、片段、或其衍生物)的“有生物学活性的”和“生物学活性”和“生物学特征”指具有结合生物学分子的能力，除非另有说明。
[0165]在用于描述各种异多聚体多肽时，“分离的”表示已经与/自表达它的细胞或细胞培养物分开和/或回收的异多聚体。其天然环境的污染性成分指将会干扰异多聚体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将异多聚体纯化至(I)根据Lowry法的测定，蛋白质重量超过95%且最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
[0166]本发明的异多聚体一般纯化至基本上均质。短语“基本上均质的”、“基本上均质的形式”和“基本上均质”用于指示产物基本上没有源自不想要的多肽组合(例如同多聚体)的副产物。
[0167]在纯度方面的表述，基本上均质表示副产物的量不超过10%、9%、8%、7%、6%、4%、3%、2%或1% (以重量计)或少于1% (以重量计)。在一个实施方案中，副产物低于5%。
[0168]“生物学分子”指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、及其组合。在一个实施方案中，生物学分子在自然界中存在。
[0169]如本文中使用的，“连接”表示第一和第二氨基酸序列之间的直接肽键连接或涉及第三氨基酸序列(即与第一和第二氨基酸序列成键且在第一和第二氨基酸序列之间的肽)的连接。例如，与一条氨基酸序列的C末端且与另一条氨基酸序列的N末端成键的接头肽。
[0170]如本文中使用的，“接头”表示长度为两个或更多个氨基酸的氨基酸序列。接头可以由中性极性或非极性氨基酸组成。接头的长度可以是例如2-100个氨基酸，诸如长度为2-50氨基酸，例如长度为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸。接头可以是“可切割的”，例如通过自切割、或酶促或化学切割。氨基酸序列中的切割位点和切割此类位点的酶和化学品是本领域公知的，而且本文中也有描述。
[0171]如本文中使用的，“栓系(tether) ”表示连接两个其它氨基酸序列的氨基酸接头。如本文中描述的，栓系可连接免疫球蛋白重链可变域的N端与免疫球蛋白轻链恒定域的C端。在特定实施方案中，栓系的长度为约15-50个氨基酸，例如长度为20-26个氨基酸(例如长度为20、21、22、23、24、25、或26个氨基酸)。栓系可以是“可切割的”，例如通过自切割、或酶促或化学切割，使用本领域的标准方法和试剂。
[0172]对“接头”或“栓系”的酶促切割可涉及使用内肽酶，诸如例如LyS-C、ASp-N、Arg-C、V8、Glu-C、糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子Xa、TEV (烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶)、肠激酶、HRV C3 (人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶、以及枯草杆菌蛋白酶样蛋白质原转化酶(例如弗林蛋白酶(PCI)、PC2、或PC3)或N-精氨酸二元(dibasic)转化酶。化学切割可涉及使用例如羟胺、N-氯琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、或
溴化氰。
[0173]如本文中使用的，“Lys-C内肽酶切割位点”指能在C端侧被Lys-C内肽酶切割的氨基酸序列中的赖氨酸残基。Lys-C内肽酶在赖氨酸残基的C端侧切割。
[0174]“离液剂”表示通过干扰稳定化分子内相互作用(例如氢键、范德华力、或疏水效应)破坏蛋白质(例如抗体)三维结构的水溶性物质。例示性离液剂包括但不限于脲、胍-HC1、高氯酸锂、组氨酸、和精氨酸。
[0175]“温和去污剂”表示通过干扰稳定化分子内相互作用(例如氢键、范德华力、或疏水效应)破坏蛋白质(例如抗体)三维结构，但不会永久破坏蛋白质结构从而引起生物学活性丧失(即不使蛋白质变性)的水溶性物质。例示性温和去污剂包括但不限于Tween (例如Tween_20)、Triton (例如 Triton X-100)、NP_40 (壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、和十二烷基硫酸钠(SDS)。
[0176]抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
[0177]“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合至某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fe受体(FcR)的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒剂杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(臂)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe y R1、Fc Y RII和Fe Y RIIIο Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.1mmunol.9:457-92 (1991)第 464 页表 3 总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利N0.5，500, 362或5，821，337中所记载的。可用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:652-656(1998)中所披露的。
[0178]“Fe受体”或“FcR”描述结合抗体Fe区的受体。优选的FcR是人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR ( Y受体)，包括Fe Y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括Fe Y RIIA (“活化受体”)和Fe Y RIIB (“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体Fe Y RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fe Y RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(Ι--Μ)(参见综述 M.Daeron, Annu.Rev.1mmunol.15:203-234 (1997))。FcR 的综述参见 Ravetch 和Kinet,Annu.Rev.1mmunol.9:457-492 (1991) ；Capel 等，Immunomethods4:25-34 (1994)；de Haas 等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41 (1995)。术语 “FcR” 在本文中涵盖其它 FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer 等，J.1mmunol.117:587 (1976)及 Kim 等，J.1mmunol.24:249 (1994))。
[0179]“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达Fe Y RIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源例如血液分离。
[0180]“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行⑶C测定法,例如如Gazzano-Santoro et al., J.1mmunol.Methods202:163 (1996)中所记载的。 [0181]术语“治疗有效量”指抗体、抗体片段或衍生物在受试者中治疗疾病或病症的量。在肿瘤(例如癌性肿瘤)的情况中，治疗有效量的抗体或抗体片段(例如多特异性抗体或抗体片段)可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据抗体或抗体片段可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
[0182]“降低或抑制”指引起优选20%或更多、更优选50%或更多、且最优选75%、85%、90%、95%、或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管发生性病症中血管的大小或数目。
[0183]术语“癌(症)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、及各种类型的头和颈癌。“早期癌症”指非侵入性的或转移性的，或者归为O期、I期、或II期癌症的癌症。术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言，非转移性癌症指作为O期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
[0184]“变应性或炎性病症”在本文中指源自个体免疫系统过度激活的疾病或病症。例示性的变应性或炎性病症包括但不限于哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、多发性硬化、全身性狼疮、全身性红斑狼疮、湿疹、器官移植、年龄相关黄斑变性、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、嗜曙红细胞性食管炎、与炎症有关的自身免疫病。
[0185]“自身免疫病”在本文中指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或者由此产生的疾患。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎和幼发型类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente),变形性关节炎,慢性原发性多关节炎，反应性关节炎，和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，X连锁的高IgM综合征，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical) MS、原发性进行性MS (PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting) MS (RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化(sclerosis disseminata)和共济失调性(ataxic)硬化,炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病，自身免疫介导的胃肠病，结肠炎诸如溃瘍性结肠炎(ulcerativecolitis, colitis ulcerosa)、微观(microscopic)结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，和自身免疫性炎性肠病)，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎)，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎， 整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学病症，类风湿性脊椎炎,突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN (膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急进性GN，变应性疾患，变应性反应，湿疫包括变应性或特应性湿疫，哮喘诸如支气管哮喘(asthma bronchiale, bronchialasthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE) (systemic lupuserythematosus, systemic lupus erythematodes)诸如皮肤 SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)，幼发型(I型)糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎病包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎)，微观(microscopic)多动脉炎，CNS血管炎，坏死性、皮肤性或超敏感性血管炎，系统性坏死性血管炎，和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)),颞动脉炎,再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血,戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血,溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(perniciousanemia, anemia perniciosa),阿狄森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征诸如那些败血症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet或Behcet)病,卡斯尔曼氏(Castleman)综合征,古德帕斯丘氏(Goodpasture )综合征,雷诺氏(Reynaud)综合征,斯耶格伦氏(Sjogren )综合征,史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，视神经脊髓炎，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合征(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综合征,僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(变应性encephalomyelitis, encephalomyelitis变应性a)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(0MS)，和感觉神经病，多灶性运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎，梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barr6)综合征，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病),特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬化，肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病 (AIED)，自身免疫性听觉丧失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(0MS)，多软骨炎诸如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病，糖尿病肾病，德雷斯勒氏(Dressier)综合征，斑秀，CREST综合征(|丐质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，利什曼病，锥虫病(kypanosomiasis),血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum etdiutinum),胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏(Alzheimer)病，细小病毒感染，风疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans),甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，硅沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症，无精子发生(aspermiogenese),自身免疫性溶血,伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmiaphacoanaphyIactica),变应性小肠炎(enteritis变应性a),麻风节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica),哈-里二氏(Hamman-Rich)病,感觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica),性腺功能减退,局限性回肠炎(ileitis区alis),白细胞减少症,传染性单核细胞增多症,横贯性(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica),肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa),胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精虫抗体的不育症，非恶性胸腺瘤，白癜风，SCID和爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，寄生虫病诸如利什曼虫，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周围神经病，自身免疫性多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(A0IH)，全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita, EBA),血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症:胶原病、风湿病、神经病学疾病、 缺血再灌注紊乱、血压应答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障碍、毛细管扩张(antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎性成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眼窝的炎性病症，粒细胞输血相关综合 征，细胞因子诱发的中毒，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬变，糖尿病性视网 膜病，糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。
[0186]术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起对细胞的 破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、 Bi212、Ra223、P32、和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤（methotrexate)、阿霉素 (adriamycin)、长春花生物碱类（vinca alkaloids)(长春新碱（vincristine)、长春碱 (vinblastine)、依托泊苷（etoposide))、多柔比星（doxorubicin)、美法仑（melphalan)、 丝裂霉素（mitomycin) C、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、柔红霉素（daunorubicin)或其它嵌 入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或 动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及本文中披露的各种抗肿瘤药、抗癌药、和 化疗剂。本文中记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
[0187]“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂 类（alkylating agents),诸如塞替派（thiotepa)和 CYTOXAN? 环磷酰胺 (cyclophosphamide);磺酸焼基酯类（alkyl sulfonates),诸如白消安（busulfan)、英丙 舒凡（improsulfan)和哌泊舒凡（piposulfan);氮丙卩定类（aziridines)，诸如苯佐替派 (匕61120(16口3)、卡波醌（031'1309110116)、美妥替派（1116加代(16口3)和乌瑞替派（1^6(16口3);乙撑亚 胺类（ethylenimines)和甲基蜜胺类（methylamelamines)，包括六甲蜜胺（altretamine)、 三乙撑蜜胺（tri ethyl enemelamine)、三乙撑憐酉先胺（tri ethyl enephosphoramide)、三乙撑 硫代憐酸胺（triethylenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺（trimethylolomelamine)； 番蒸枝内酯类（acetogenins)(尤其是布拉他辛（bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone))； 6 -9—四氢大麻酌?（tetrahydrocannabinol)(屈大麻酌?（dronabinol)， MARINOL? ); 0 -拉帕醒（lapachone);拉帕醇（lapachol);秋水仙素类（colchicines); 白桦脂酸（betulinic acid);喜树碱（camptothecin)(包括合成类似物托泊替康 (topotecanX HYCAMTIN? )、CPT-11 (伊立替康（irinotecan)，CAMPTOSAR?
)、乙酰喜树碱、东莨菪亭（scopoletin)和9_氨基喜树碱）；苔藓抑素（biyostatin)； callystatin ;CC_1065 (包括其阿多来新（adozelesin)、卡折来新（carzelesin)和比折 来新（bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin);鬼臼酸（podophyllinic acid);替尼泊苷（teniposide);隐藻素类（cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素 8);多拉司他汀(dolastatin) ；duoc臂ycin (包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1);艾 植塞洛素（eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海绵抑素（spongistatin);氮 芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥（chlorambucil)、萘氮芥（chlornaphazine)、 胆磷酰胺（cholophosphamide)、雌莫司汀（estramustine)、异环磷酰胺（ifosfamide)、双 氯乙基甲胺（mechlorethamine)、盐酸氧氮芥（mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法仑（melphalan)、新氮芥（novembichin)、苯芥胆留醇（phenesterine)、泼尼莫司 汀（prednimustine)、曲憐胺（trofosfamide)、尿啼卩定氮芥（uracil mustard)；亚硝服 类（nitrosoureas)，诸如卡莫司汀（c臂ustine)、氯脲菌素（chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司汀（nimustine)和雷莫司汀（ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素 Y I (参见例如 Agnew，Chem.1ntl.Ed.Engl.33:183-186 (1994));蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素 C (cactinomycin)、 carabicin、洋红霉素(c臂inomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素 D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN?客柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔
比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcel 1mycin )、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素 C、霉酷酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potf iromycin)、呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如甲氨噪呤(methotrexate)和5_氟尿啼卩定(5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨噪呤(methotrexate)、蝶酉先三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；P票呤类似物，诸如氟达拉滨(fIudarabine)、6-巯基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鸟_呤(thioguanine)；啼卩定类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(c臂ofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(6110(3；^313；!_116)、氟尿苷(:[101111^(1；!_116);雄激素类，诸如卡鲁睾酮(031118七61'0116)、丙酸屈他 雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(tri1stane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醒内酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 P定(eniIuraciI)；安口丫 P定(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate)；地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone);elfornithine ;依禾[|醋韦安(elliptiniumacetate);依托格鲁(etoglucid) ；epothilone ;硝酸镓；轻脲(hydroxyurea);香燕多糖(lentinan);氯尼达明(1nidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol) ;二胺硝卩丫唳(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet)；批柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1soxantrone) ；2~ 乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴餅(procarbazine) ; PSK? 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺方定错(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone) ;2，2，，2，，-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、抚孢菌素(verrucarin) A、杆孢菌素(roridin)A 和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine) ( ELDISINE? ，
FILDESIN? );达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴焼(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids)，例如TAXOL? 帕利他赛(pacIitaxeI) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANE?不含克列莫佛(CremophOT)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他赛(American Ph 臂 aceutical Partners, Schaumbergj IL)和 TAXOTERE? 多西他赛
(doxetaxel) (Rhone -Poulenc Rorerj Antony, France);苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) ( GEMZAR? )； 6_ 硫鸟 _ 呤(thioguanine);巯基票呤(mercaptopurine);甲氨噪呤(methotrexate)；钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin)；长春碱(vinblastine) ( VELB AN? )；钼(platinum)；依托泊苷(etoposide) (VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine) ( ONCOVIN? );奥沙利钼(oxaliplatin);亚叶酸(leucovorin);长春瑞
滨(vinorelbine) ( NAVELBINE? );能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道
诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic
acid);卡培他滨(capecitabine) ( XELODA? );任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍
生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利钼(EL0XATIN?)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
[0188]该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX?他莫昔芬)、EVISTA?雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON?托瑞米芬(toremifene);抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如LUPRON?和ELIGARD?醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE? 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN? 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR?伏罗唑(vorozole)、FEMARA? 来曲唑(Ietrozole)和'ARIMIDEX?阿那曲唑(anastrozole)。另外,化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(Clodronate)(例如 B0NEF0S'? 或 0STAC? )、DIDR0CAL? 依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、Z0META? 唑来膦酸 / 唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX? 阿伦膦酸盐(alendronate)、AREDIA? 帕米膦酸盐(pamidronate)、SKEL.1D? 替鲁膦酸盐(tiludronate)或ACTONEL? 利塞膦酸盐(risedronate);以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3_ 二氧戍环核苷胞嘧唳类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如THERATOPE?疫
苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN?疫苗、LEUVECTIN?疫苗和VAJQD?.疫苗；LURTOTECAN?.拓扑异构酶 I 抑制剂；ABARELIX?: rmRH ; Iapatinibditosylate (ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。 [0189]“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(例如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烧类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞,例如DNA烧化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5_ 氟尿喃唳(5-fIuorouracil)和 ara_C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer)),Mendelsohn 和 Israel 编，第 I 章，题为 “Cell cycle regulation, oncogenes, andantieioplastic drugs，，，Murakaini 等人，WB Saunders, Philadelphia, 1995,尤其是第13页。紫杉烧类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(IAXO rERE?, Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇
(TAXOL?, Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋
白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
[0190]如本文中使用的，“抗癌疗法”指减轻或抑制受试者中的癌症的治疗。抗癌疗法的例子包括细胞毒性放疗以及对受试者施用治疗有效量的细胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂、癌症疫苗、血管发生抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、止吐剂、抗体或抗体片段、或止痛剂。
[0191]术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如 Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy，，，Biochemical Society Transactions,14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)和 Stella et al., “Prodrugs:AChemical Approach to Targeted Drug Delivery，，，Directed Drug Delivery, Borchardtet al., ed., pp.247-267，Humana Press (1985)。前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
[0192]术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一种细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);表皮生长因子(EGF);肝生长因子；成纤维细胞生长因子(FGF);促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β ;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，诸如NGF-β ;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β ;胰岛素样生长因子-1和-1I ;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductive factor);干扰素,诸如干扰素_ α、-β和-y ;集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)和粒细胞CSF (G-CSF);白介素(IL)，诸如 IL-U IL-1 a、IL-1 β、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7、IL-8, IL-9, IL-10, IL-1UIL-12、IL-18 ;肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β ;及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
[0193]“细胞因子拮抗剂”表示部分或完全阻断、抑制、或中和至少一种细胞因子的生物学活性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可通过抑制细胞因子表达和/或分泌或通过结合细胞因子或细胞因子受体来抑制细胞因子活性。细胞因子拮抗剂包括结合细胞因子或细胞因子受体的抗体、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂任选缀合或融合至细胞毒剂。例示性TNF拮抗剂是依那西普(etanercept, ENBREL? )、英夫利昔单抗(infliximab, REMICADE ⑧)、和阿达木单抗(adalimumab, HUMI RA? )?
[0194]如本文中使用的，术语“免疫抑制剂”指起抑制或掩盖所治疗受试者的免疫系统作用的物质。这包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。免疫抑制剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见美国专利N0.4，665，077)；霉酌.酸酯(mycophenolate mofetil)诸如 CELLCE丨〕?;硫唑嘌呤(azathioprine)
(IMURAN?, AZASAN*?,/6-疏基嘿呤；漠隐亭(bromocryptine);达那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone);戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利N0.4，120, 649中所记载的)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A ;类固醇类，诸如皮质类固醇和糖皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)诸如PEDIAPRED'? (泼尼松龙磷酸钠)或ORAPRED? (泼尼松龙磷酸钠口服液)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、和地塞米松(dexamethasone);甲氨蝶呤(methotrexate) (口服或皮下)(RHEUMATREX?,TREXALL?);轻氯喹(hydroxycloroquine) / 氯喹(chloroquine)；柳氮石黄吡 P定(sulfasalazine);来氟米特(Ieflunomide);细胞因子或细胞因子受体拮抗剂,包括抗干扰素-Υ、-β或-α抗体,抗肿瘤坏死因子-α抗体(英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab)),抗TNF-α免疫粘附素(ENBREL?,依那西普(etanercept)),抗肿瘤坏死因子-β抗体，抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗⑶I Ia和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或泛(pan)T抗体,或单克隆抗⑶3或抗⑶4/⑶4a抗体；包含LFA-3结合域的可溶性肽(W090/08187);链激酶；TGF-β ；链道酶；来自宿主的RNA或DNA ；FK506 ;RS_61443 ;脱氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin) ;T细胞受体(Cohen et al.,美国专利N0.5，114，721) ;T细胞受体片段(Offner et al.Science251:430-432(1991);W090/11294;Ianeway, Nature341:482(1989)
;W091/01133) ;T 细胞受体抗体(ΕΡ340，109)，诸如 Τ10Β9 ;环磷酰胺(CYTOXAN?);氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE?);血浆交换；或静脉内免疫球蛋白(IVlG)。这些可以单独或彼此组合使用，特别是类固醇和另一种免疫抑制剂的组合或此类组合继以维持剂量的非类固醇剂以降低对类固醇的需要。
[0195]“止痛剂”指起抑制或遏制受试者中的疼痛的作用的药物。例示性止痛剂包括非类固醇抗炎药(NSAID),包括布洛芬(ibuprofen, MOTRIN? )、萘普生(naproxen,
NAPROSYN?)、乙酰水杨酸、却甲新(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、和托美
汀(tolmetin)，包 括它们的盐和衍生物，以及用于减轻可能发生的刺痛的各种其它药疗，包括抗惊厥剂(gabapentin、phenyloin、卡马西平(carbamazepine))或三环抗抑郁剂。具体例子包括醋胺酹、阿司匹林、阿米替林(amitriptyline, ELAVIL?)、卡马西平(carbamazepine, TEGRETOL? )、phenyltoin (DILANTIN?)、gabapentin(NEURONTIN? )、(E)-N-香草基-8-甲基-6-noneamid ( CAPSAICIN? ),或神经阻断剂。
[0196]“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构、模拟或提升天然存在皮质类固醇的效果的数种合成或天然存在物质中的任一种。合成皮质类固醇的例子包括泼尼松、泼尼松龙(包括甲泼尼龙)、地塞米松、曲安西龙、和倍他米松。
[0197]如本文中使用的，“癌症疫苗”指在受试者中刺激针对癌症的免疫应答的组合物。癌症疫苗通常由癌症相关材料或细胞(抗原)的来源(对受试者可以是自体的(来自自己)或同种异体的(来自他人))以及用于进一步刺激和强化针对抗原的免疫应答的其它成分(例如佐剂)组成。癌症疫苗可导致刺激受试者的免疫系统生成针对一种或数种特定抗原的抗体，和/或生成杀伤T细胞以攻击具有那些抗原的癌症细胞。
[0198]如本文中使用的，“细胞毒性放疗”指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的放射疗法。放射疗法可包括例如外线束辐照或使用经过放射性标记的药剂(诸如抗体)的疗法。该术语意图包括使用放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P'和Lu的放射性同位素)。
[0199]“受试者”指脊椎动物，诸如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于家畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬和马)、灵长类、小鼠、和大鼠。[0200]除非上下文另外指明，术语“第一”多肽和“第二”多肽及其变化形式仅仅是一般标识符，不要理解为标示本发明抗体的特定或具体多肽或成分。[0201]除非另有说明，实施例中提到的商品化试剂依照制造商的用法说明书来使用。下面的实施例中及贯穿说明书以ATCC登录号标示的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA)0 除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准规程，诸如上文及下面的教科书中描述的那些:Sambrook et al., supra;Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NYj 1989);Inniset al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(AcademicPress, Inc., NYj 1990);Harlow et al.，Antibodies: A Laboratory Manual (Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor， 1988);Gait，Oligonucleotide Synthesis(IRL Press，Oxford,1984);Freshneyj Animal Cell Culture,1987;Coligan et al.，CurrentProtocols in Immunology, 1991。
[0202]贯穿本说明书和权利要求书，用词“包含”或其变化形式会理解为暗示包括所述整数或整数群但不排除任何其它整数或整数群。
[0203]I1.异多聚体蛋白质的构建
[0204]典型地，本文所述异多聚体蛋白质会包含抗体Fe区的显著部分。
[0205]异多聚化域
[0206]异多聚体蛋白质包含异多聚化域。为了生成基本上同质的异二聚体分子群体，异二聚化域必须具有超过同二聚体形成异二聚体的强偏爱。虽然本文中例示的异多聚体蛋白质利用节入穴技术来便于异多聚化，但是本领域技术人员会领会可用于本发明的其它异多聚化域。
[0207]节入穴
[0208]作为生成多特异性抗体的方法，节入穴的使用是本领域公知的。参见美国专利N0.5，731，168 (1998 年 3 月 24 日公告，转让给 Genentech)、PCT 公开 N0.W02009089004(2009年7月16日公布，转让给Amgen)、和美国专利公开N0.20090182127 (2009年7月16 日公布,转让给 Novo Nordisk Α/S)。还可参见 Marvin and Zhu, Acta PharmacologicaSincia (2005) 26 (6): 649-658 及 Kontermann (2005) Acta Pharacol.Sin., 26:1-9。本文提供了简要讨论。
[0209]“隆起”指至少一个氨基酸侧链自第一多肽的界面凸出并因此可放置在邻近界面(即第二多肽的界面)的补偿空腔中，从而稳定异多聚体，并由此例如有利于异多聚体形成，超过同多聚体形成。隆起可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在正确情况下，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码隆起。为了实现这一点，将编码第一多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要大的“输入”氨基酸残基的核酸替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。可替换的初始残基的数目的上限是第一多肽的界面中的残基的总数。下表显示了各种氨基酸残基的侧链体积。
[0210]表2
[0211]氨基酸残基的特性
【权利要求】
1.一种变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含野生型Fe多肽的Fe变体，所述Fe变体包含所述野生型Fe多肽的Fe区中的至少一处氨基酸修饰，其中与野生型Fe多肽相比，所述变体蛋白质展现降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量。
2.—种变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含野生型Fe多肽的Fe变体，所述Fe变体包含所述野生型Fe多肽的Fe区中的至少两处氨基酸修饰，其中与野生型Fe多肽相比，所述变体蛋白质展现降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量。
3.权利要求1或2的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其进一步包含节-入-穴修饰。
4.一种变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含野生型Fe多肽的Fe变体，其中所述Fe变体包含至少一条重链上的残基241和243处用与野生型Fe多肽中存在的不同的氨基酸进行的替代，由此引起与包含野生型Fe多肽的IgG抗体相比降低的错配、降低的头-尾形成或升高的总体产量。
5.权利要求4的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体，其包含至少一条重链上选自 F241R/F243S 和 F241R/F243S 的突变。
6.权利要求4或5的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体,其进一步包含节-入-穴修饰。
7.前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体,其中该蛋白质或抗体是多特异性抗体。
8.一种分离的核酸，其编码前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。
9.一种表达载体，其编码权利要求1-7任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求8的核酸分子或包含该核酸分子的表达载体。
11.权利要求10的宿主细胞，其生成前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。
12.权利要求11的宿主细胞，其为CHO细胞。
13.权利要求11的宿主细胞,其为大肠杆菌细胞。
14.一种生成前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体的方法，其包括培养权利要求10的细胞并自细胞培养物回收变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体。
15.—种组合物，其包含前述权利要求任一项的变体异多聚体蛋白质或经过修饰的IgG抗体以及载体。
【文档编号】C07K16/00GK103649117SQ201280016878
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年2月3日 优先权日:2011年2月4日
【发明者】J.M.埃利奥特, J.希尔 申请人:基因泰克公司