聚烯杀真菌剂和非核糖体肽的协同组合和相关的使用方法

文档序号:3480061阅读:413来源:国知局
聚烯杀真菌剂和非核糖体肽的协同组合和相关的使用方法
【专利摘要】本发明包括包含聚烯杀真菌剂和至少一种脂肽的协同杀真菌组合的组合物和用这种组合物控制真菌病原体的方法。
【专利说明】聚烯杀真菌剂和非核糖体肽的协同组合和相关的使用方法
发明领域
[0001]本发明涉及聚烯杀真菌剂与抗生素非核糖体肽如两亲性环脂肽的协同组合,以改善两种组分的杀真菌活性。
[0002]发明背景
[0003]杀真菌剂有许多用途,包括用于作物保护;作为食品、饲料和化妆品防腐剂;和应用于人和兽的药物。作物减产、经食物传播的疾病、以及人和动物的真菌感染成为发达和发展中国家共同的问题。因此,改善现有杀真菌剂(尤其是环保且对真菌耐受性发展不敏感的杀真菌剂)的效力是非常期待的。
[0004]聚烯杀真菌剂为已经在前述领域中应用的抗真菌抗生素。它们的获得可通过发酵链霉菌属物种,如纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis),其通常见于土壤中。聚烯杀真菌剂的活性可部分从它们通过与麦角固醇形成复合物而损伤细胞膜的能力推导出。大量的研究已经证实真菌对那他霉素的耐受性发展潜力非常低。另外,聚烯杀真菌剂具有可忽略的毒性,因为它们不影响哺乳动物细胞内存在的胆固醇。
[0005] 非核糖体肽,包括环状两亲性脂肽如表面活性素类、伊枯草菌素类和芬枯草菌素类(fengycins),其抗微生物性能是公认的并已经应用于作物保护领域。由于它们的作用方式,它们还在生物制药及其它生物技术应用中有潜在用途。脂肽可通过各种土壤细菌的发酵获得,包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)0脂肽,与聚烯杀真菌剂类似,通过破坏细胞膜杀死真菌。可以预见真菌对这些化合物的耐受性发展潜力非常低,因为它们直接作用于膜脂而不是直接作用于单点蛋白靶标。另外,脂肽对环境无害且对工人和消费者的危险低;事实上,用含有芽孢杆菌属(Bacillus)菌株处理的作物可在处理的当天收获。 申请人:已经发现聚烯杀真菌剂和脂肽的组合会导致在抗微生物如真菌的效力上协同增强,而不仅仅是累加增强。不希望受任何理论的束缚, 申请人:假设本发明的脂肽和聚烯杀真菌剂以协同杀真菌的方式起作用,因为每种类型的化合物通过不同的作用方式破坏真菌的细胞膜。
[0006]发明概述
[0007]本发明提供一种低毒、低耐受性诱导、增效的杀真菌组合物,其包含比许多传统合成杀真菌剂毒性小且以比各个化合物的施用率低的组分。该杀真菌组合物包含一种或多种聚烯杀真菌剂和至少一种脂肽的协同杀真菌组合。在一实施方案中,聚烯杀真菌剂为下列中的一种或多种:那他霉素(natamycin)、制霉菌素(nystatin)、两性霉素B、金色制霉素、非律平和光明霉素(Iucenosomycin)和/或每种这些聚烯杀真菌剂的衍生物。在另一实施方案中,所述组合物包含一种以上的聚烯杀真菌剂。
[0008]该协同杀真菌组合中的脂肽组分可以是产脂肽微生物产生的发酵产物的一部分,可以是此种杀真菌的发酵产物的粗提取物,或者可以是由此种发酵产物纯化或半纯化。在其它实施方案中所述脂肽是合成或半合成的(即,母体脂肽由微生物获得和衍生而来)。在一些实施方案中,产脂肽的微生物为芽孢杆菌属物种细菌。在其它实施方案中其为链霉菌。在还有的其它实施方案中其为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种细菌。[0009]在具体的实例中,产脂肽的细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或产一种或多种脂肽的任何其它芽孢杆菌属物种。在又一实例中,由这样的芽孢杆菌属物种生产的脂肽选自下列族中的一种或多种:表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物和芬枯草菌素型化合物。一些产生脂肽的芽孢杆菌属物种描述于发明详述中(例如,解淀粉芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌(cereus)、苏云金芽孢杆菌(thuringiensis)、凝结芽孢杆菌(coagulans)、短小芽孢杆菌(pumilus)、地衣芽孢杆菌(Iicheniformis));其它将是本领域的技术人员已知的。在具体的实例中,产脂肽的细菌为枯草芽孢杆菌QST713。在一实施方案中,组合物包含聚烯杀真菌剂组分和含脂肽的发酵产物。在一实例中含脂肽的发酵产物得自芽孢杆菌属物种细菌,如上面提及的那些。
[0010]在一些实施方案中本发明组合物的脂肽组分包含下列化合物中的一种或多种:表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物和fusaricidin类。适用于本发明的伊枯草菌素型化合物包括一种或多种下列化合物:芽孢菌霉素D、芽孢菌霉素F、芽孢菌霉素L、芽孢菌霉素LC (亦称bacillopeptin)、抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A、伊枯草菌素AL和伊枯草菌素C (后三种化合物本文中合称伊枯草菌素类)。适用于本发明的芬枯草菌素型化合物为芬枯草菌素A、芬枯草菌素B、大侧柏素(plipastatin)A、大侧柏素B、大侧柏素类(plipastatins)和阿瓜斯他汀类(agrastatins),如描述于美国专利6,291, 426中(后四种列举的在本文中合称大侧柏素类)。适用于本发明的表面活性素型化合物为埃斯波素(esperin)、地衣素(Iichenysin)、帕米拉素(pumiIacidin)和表面活性素。在一具体的实施方案中,脂肽组分包括伊枯草菌素型化合物如伊枯草菌素As、抗霉枯草菌素和/或芽孢菌霉素、芬枯草菌素型化合物和表面活性素中的一种或多种。在另一实施方案中脂肽组分包括下列化合物中的至少两种:伊枯草菌素类、芬枯草菌素型化合物和表面活性素类。
[0011]在一些实施方案中协同杀真菌组合包含聚烯杀真菌剂和一种或多种脂肽。在另一实施方案中协同杀真菌组合包含聚烯杀真菌剂和两种或两种以上的脂肽。所述脂肽可以来自下列化合物族中的一种或多种化合物:表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或芬枯草菌素型化合物。在一实例中,所述脂肽包含一种或多种伊枯草菌素类和/或一种或多种芬枯草菌素型化合物和`/或表面活性素。在一实施方案中,组合物的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或制霉菌素且脂肽组分包含伊枯草菌素类(A、B和/或C)、芽孢菌霉素、表面活性素、fusaricidin、和/或芬枯草菌素型化合物,或者各自单独或组合。在一具体的实例中,脂肽由产脂肽的芽孢杆菌属物种细菌的发酵产物半纯化或纯化。在该实施方案的还有的另一个实例中,聚烯杀真菌剂为那他霉素或其衍生物或者制霉菌素或其衍生物。
[0012]组合物中的聚烯杀真菌剂组分与脂肽组分的重量/重量比(例如,含脂肽的发酵液,含有脂肽的粗提取物;纯化或半纯化的脂肽提取物;或化学合成的或衍生的纯脂肽)为约500:1至1:500。在一实施方案中,那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物与包含一种或多种化合物的脂肽组分的重量/重量比为约500:1至约1:500,所述化合物选自一种或多种下述化合物族:表面活性素型化合物,伊枯草菌素型化合物,芬枯草菌素型化合物,和/或fusaricidin类。在一具体的实施方案中那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物与脂肽组分的重量/重量比为约500:1至约1:500,所述脂肽组分包括伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和/或芬枯草菌素型化合物的组合。在一些实施方案中,那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物与含有一种或多种伊枯草菌素型化合物的脂肽组分的重量/重量比为约500:1至约1:500,所述伊枯草菌素型化合物如伊枯草菌素As和/或芽孢菌霉素。在其它实施方案中,那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物与含有芬枯草菌素型化合物的脂肽组分的重量/重量比为约500:1至约1:500。在还有其它的实施方案中那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物与含有表面活性素型化合物如表面活性素的脂肽组分的重量/重量比为约500:1至约1:500。在一实施方案中,那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物与得自发酵液的脂肽粗提取物的重量/重量比为约1:500至约500:1,其包括含有芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或表面活性素型化合物的发酵液。在一些实施方案中聚烯杀真菌剂与脂肽组分的任何上述组合的重量/重量比为约100:1至约1:100 ;在其它实施方案中其为约10:1至约1:10 ;在还有的其它实施方案中其为约5:1至约1:5 ;还在其它实施方案中其为约2:1至约1:2 ;还在其它实施方案中其为约 1:1。
[0013]在一实施方案中,聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物,且脂肽组分包括下列中的一种或多种:(i)伊枯草菌素,(ii)芽孢菌霉素,(iii)抗霉枯草菌素,(iv)埃斯波素,(V)地衣素,(vi)帕米拉素,(vii)表面活性素,(viii)芬枯草菌素A,(ix)芬枯草菌素B,(X)大侧柏素A,(xi)大侧柏素B,和/或(xii)阿瓜斯他汀。在前述实施方案的另一个实例中,组合物不包含表面活性素。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物或制霉菌素或其衍生物,且脂肽组分包括下列中的一种或多种:(i)伊枯草菌素,(ii)表面活性素,(iii)芬枯草菌素和/或(V)大侧柏素。在该实施方案的另一个实例中,那他霉素或制霉菌素的衍生物与母体化合物比较具有相等或更好的杀真菌活性。
[0014]本发明的组合物用于各种真菌控制的应用。上述组合物可用于控制真菌的植物病原体、收获后的真菌病原体、食品或饲料的真菌病原体和人真菌病原体。
[0015]在一实施方案中,任何上述组合物都可通过将组合物施加于植物、植物周围的区域、或食用栽培蘑燕、蘑燕 菌丝体(mushroom spawn)或蘑燕基肥(compost)用于控制祀向病原体如镰孢霉属(Fusarium)物种、葡萄孢属(Botrytis)物种、轮枝孢霉属(Verticillium)物种、丝核菌属(Rhizoctonia)物种、木霉属(Trichoderma)物种和腐霉属(Pythium)物种。在一实施方案中,用于控制此种病原体的本发明组合物的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。在另一个实施方案中其为制霉菌素或其衍生物。
[0016]在另一实施方案中,本发明的组合物用于控制收获后病原体如青霉属(Penicillium)、地霉属(Geotrichum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、和刺盘抱属(Colletotrichum)物种。在一实施方案中,用于控制此种病原体的组合物的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。在另一个实施方案中其为制霉菌素或其衍生物。
[0017]在另一实施方案中,本发明的组合物用于控制存在于食品或饲料的真菌病原体,如青霉属物种、曲霉属(Aspergillus)物种和镰孢霉属物种。在一实施方案中,用于控制此种病原体的组合物的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。在另一个实施方案中其为制霉菌素或其衍生物。在还有的另一实施方案中,脂肽组分为一种或多种脂肽的纯化的提取物。
[0018]在另一实施方案中,本发明的组合物用于通过给受试者施用包含聚烯杀真菌剂和至少一种多肽的组合物来治疗或预防受试者的真菌感染。在一实施方案中真菌感染由念珠菌(Candida)引起,用于组合物中的聚烯杀真菌剂为制霉菌素或其衍生物。在另一实施方案中真菌感染由念珠菌引起,且用在组合物中的聚烯杀真菌剂为那他霉素或其衍生物。在另一实施方案中真菌感染由镰孢霉(Fusarium)或曲霉(Aspergillus)引起且可导致角膜感染。在这样的实例中,用在组合物中的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。在组合物用于治疗角膜感染另一个实例中,聚烯杀真菌剂组分为制霉菌素或其衍生物。在又一实例中所述组合物的脂肽组分为一种或多种脂肽的纯化的提取物。
[0019]本发明还包括通过下述方法生产杀真菌组合物的方法:制备一种或多种聚烯杀真菌剂与一种或多种脂肽的组合,测试该组合抗靶向真菌的协同效力和生产包含该组合和载体的杀真菌组合物。在一实施方案中,一种或多种脂肽为芽孢杆菌属物种细菌(如上面和在发明详述中描述的那些)的发酵产物提取物或其一部分。在该实施方案的另一个实例中,在制备该组合产品之前,选择产脂肽的细菌,如芽孢杆菌属物种菌株或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种菌株,用产脂肽的细菌生产含脂肽的发酵产物,此种发酵产物或其提取物用于制备组合产品。在一实例中,此种发酵产物将包括下列脂肽中的一种或多种:表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物和/或fusaricidin,在更具体的实例中,此种发酵产物将包括下列脂肽中的一种或多种:表面活性素、大侧柏素、芬枯草菌素、伊枯草菌素和/或芽孢菌霉素。在另一实施方案中,在制备组合产品之前,针对抗靶向病原体的杀真菌活性筛选每一种聚烯杀真菌剂组分和脂肽组分,且只有至少具有一定杀真菌活性的聚烯杀真菌剂和脂肽组分将用于制备组合产品。在其它实施方案中,靶向真菌为植物病原体,如镰孢霉属、葡萄孢属(Botrytis)和轮枝孢属(Verticillium);收获后病原体,如青霉属和地霉属(Geotrichum);食品或饲料的真菌病原体,如曲霉属、镰孢霉属(Fusarium)和青霉属;和人真菌病原体,如念珠菌属、曲霉属和镰孢霉属。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)也可作为念珠菌属的模型用作为上述方法中的祀向病原体。在一实例中,受试的组合产品的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物或制霉菌素和其衍生物。在另一个实例中,受试的脂肽为表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物、芬枯草菌素型化合物和/或fusar icidin类的一种或多种。
[0020]附图简述
[0021]附图1显示与阴性对照(没有进行处理)相比在(i)得自枯草芽孢杆菌QST713的脂肽粗提取物和那他霉素,(ii )单独的脂肽,或(iii)单独的那他霉素的存在下酿酒酵母的生长百分数。
[0022]图2显示与阴性对照相比在(i)脂肽的粗提取物,(ii)那他霉素,和(iii)脂肽和那他霉素的存在下扩展青霉(Penicillium expansum)的生长百分数。
[0023]图3显示与阴性对照相比在(i)那他霉素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的组合,和(V)那他霉素和各种半纯化或纯化脂肽或所有半纯化或纯化脂肽的组合的存在下扩展青霉的生长百分数。如图中所用的,“N”指那他霉素;“脂肽粗品”指脂肽粗提取物;“I”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
[0024]图4显示与阴性对照相比在(i)那他霉素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的组合,和(V)那他霉素和各种半纯化或纯化脂肽的组合的存在下白地霉(Geotrichum candidum)的生长百分数。如图中所用的,“N”指那他霉素;“L”指脂肽粗提取物;“1”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
[0025]图5显示与阴性对照相比在(i)制霉菌素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)制霉菌素和脂肽粗提取物的组合,和(V)制霉菌素和各种半纯化或纯化脂肽的组合的存在下白地霉的生长百分数。如图中所用的,“Ny”指制霉素;“L”指脂肽粗提取物;“1”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
[0026]图6显示与阴性对照相比在(i)那他霉素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的组合;和(0那他霉素和各种半纯化或纯化脂肽的组合的存在下柑橘采后酸腐病菌(Geotrichum citr1-aurantii)的生长百分数。如图中所用的,“N”指那他霉素;“L”指脂肽粗提取物;“I”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
[0027]图7显示与阴性对照相比在(i)制霉菌素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)制霉菌素脂肽粗提取物的组合,和(V)制霉菌素和各种半纯化或纯化脂肽的组合的存在下柑橘采后酸腐病菌的生长百分数。如图中所用的,“Ny”指制霉素;“L”指脂肽粗提取物;“1”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
[0028]图8显示与阴性对照相比在(i)那他霉素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)那他霉素和脂肽粗提取物的组合,和(V)那他霉素和各种半纯化或纯化脂肽的组合的存在下酿酒酵母的生长百分数。如图中所用的,“N”指那他霉素;“L”指脂肽粗提取物;“1”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
`[0029]图9显示与阴性对照相比在(i)制霉菌素,(ii)脂肽粗提取物,(iii)各种半纯化或纯化脂肽,(iv)制霉菌素和脂肽粗提取物的组合,和(V)制霉菌素和各种半纯化或纯化脂肽的组合的存在下酿酒酵母的生长百分数。如图中所用的,“Ny”指制霉素;“L”指脂肽粗提取物;“1”指半纯化伊枯草菌素型化合物;“F”指半纯化芬枯草菌素型化合物;“S”指纯化的表面活性素型化合物。
[0030]发明详述
[0031]所有公开、专利和专利申请,包括其中的任何附图和附件,均通过引用以这样的程度并入本文,即如同各个公开或专利申请被特别地且各自地指明通过引用并入本文。
[0032]以下说明包括用于理解本发明的信息。不是承认本文中提供的任何信息都是先有技术或与本申请要求保护的发明有关、或任何特别地或含蓄地提及的公开都是先有技术。
[0033]本发明包括用于控制微生物病原体,如真菌、卵菌(oomycetes)和/或细菌的聚烯杀真菌剂与除酶之外的抗生素非核糖体肽的协同组合。
[0034]本发明的聚烯杀真菌剂为含大环内酯环的抗真菌抗生素,其中大环内酯环具有(i)刚性亲脂性聚烯部分和柔性的、亲水性羟基化部分和(ii)与大多数真菌细胞膜内的固醇,主要是麦角固醇的结合的能力。大环内酯环可具有12-40个碳、6-14个羟基基团,并可与碳水化合物连接或可不与碳水化合物连接。该环可与一种或多种糖如含五个或更多碳单元的单糖、脱氧糖、氨基糖等连接,其中所述糖含有附于环(包括氧化连接)的取代基。本发明的聚烯杀真菌剂可由一种链霉菌属(Streptomyces)细菌获得。此种杀真菌剂包括那他霉素、制霉菌素、两性霉素B、金色制霉素、非律平和鲁斯霉素以及它们的衍生物。衍生物的实例包括,例如美国专利5,606,038中描述的两性霉素B衍生物,或制霉菌素衍生物/类似物如 fcuheim 等,ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Nov.2004,pp.4120-4129 中描述的S44HP、NYST1068、和辛烯制霉菌素。衍生物为天然存在的母体分子的类似物或与母体分子相比保持至少一定杀真菌活性的由母体分子衍生的合成或半合成的化合物。在一些实施方案中,与母体分子相比衍生物具有至少相同的或更高的杀真菌活性。衍生物包括盐类和溶剂合物及其它与母体分子相比溶解度增加的改进形式。
[0035]本发明的抗生素非核糖体肽(NRPs)为破坏细胞膜或细胞壁的非核糖体肽,不包括酶类。此种抗生素NRPs通过称为非核糖体肽合成酶的大酶复合物、而不是通过核糖体合成。如本文中所使用的,术语“抗生素”,指能够杀死或使微生物病原体,如真菌、卵菌和/或细菌的生长变慢。互联网上提供了称为Norine的非核糖体肽的数据库,该数据库描述于 Caboche, S.等,“N0RINE:A Database of Nonribosomal Peptides, ”Nucleic AcidsResearch, 36:D326-D331, (2008)中。本发明抗生素NRPs破坏细胞膜,包括细胞器膜、或细胞壁。膜或壁可通过各种方式来破坏,包括抑制细胞膜或细胞壁组分的合成;细胞膜组分的物理破坏,如通过磷脂膜的透化,其通过膜增溶或者通过渗透性干扰;或者与细胞膜中的小分子结合。
[0036]本发明破坏细胞壁的抗真菌的NRPs包括棘白菌素类,其为半合成的两亲性脂肽,由与易变构型(configured)的脂质侧链连接的环六肽芯构成。棘白菌素类抑制1,3_β -葡聚糖的合成,I, 3-β -葡聚糖是子囊菌(ascomycete)细胞壁的主要多糖组分,维持细胞的渗透完整性并与细胞分裂和生长有关。棘白菌素类包括卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。
[0037]本发明破坏细胞膜的抗真菌的NRPs还包括可从各种细菌包括芽孢杆菌属物种、类芽孢杆菌属物种和链霉菌属物种中获得的脂肽,如两亲性环肽。如本文中所用的术语“月旨肽”指两亲性环肽。
[0038]在一些实施方案中,这些两亲性环肽由六至十个与氨基或羟基脂肪酸连接的α -氨基酸构成,如芬枯草菌素型化合物、伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和fusaricidin类。所述伊枯草菌素型化合物由七个氨基酸构成并与β -氨基脂肪酸连接。脂肪酸链的长度可在C14至C17之间变化。这些化合物可由芽孢杆菌属的各个种包括枯草芽孢杆菌(subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(amyloliquefaciens)获得。所述伊枯草菌素类和它们的变化形式描述于 Ongena, M.,等,“Bacillus Lipopeptides: VersatiIe Weaponsfor Plant Disease Biocontrol, ^Trends in Microbiology, 16 (3): 115-125, (2007)中。本发明的伊枯草菌素型化合物包括一种或多种下列化合物:芽孢菌霉素D、芽孢菌霉素F、芽孢菌霉素L、芽孢菌霉素LC (亦称bacillopeptin)、抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A、伊枯草菌素AL和伊枯草菌素C (后三种化合物本文中合称伊枯草菌素类)。
[0039]芬枯草菌素型化合物由十个与羟基脂肪酸连接的氨基酸构成,其中羟基脂肪酸具有长度在 C14至C18之间变化的链。这些化合物可由芽孢杆菌属的各个种包括枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌获得和从链霉菌属物种获得。芬枯草菌素型化合物描述于Ongena,上文中。适合于本申请中描述的组合物的芬枯草菌素型化合物包括 Kimura, et al., “SNA60_367_New Peptide Enzyme Inhibitorsagainst Aromatase, ” Journal of Antibiotics, 50 (6): 529-531,(1997)中描述的得自链霉菌属物种的芬枯草菌素A、芬枯草菌素B、大侧柏素A、大侧柏素B、大侧柏素类,和美国专利6,291,426中描述的阿瓜斯他汀类(所列的后四种本文中合称大侧柏素类)。[0040]表面活性素型化合物由七个与羟基脂肪酸连接的氨基酸构成,其中羟基脂肪酸具有长度在C13至C16之间变化的链。这些化合物可由芽孢杆菌属的各个种获得,包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。表面活性素族的化合物描述于Ongena,上文中。本发明的表面活性素型化合物包括一种或多种下列化合物:埃斯波素、地衣素、帕米拉素和表面活性素。
[0041]fusaricidin类由六个与15-胍基_3_羟基十五烧酸连接的氨基酸构成。fusaricidin类可从类芽孢杆菌属物种,包括多粘类芽孢杆菌(polymyxa)中获得。fusaricidin 家族化合物描述于 Choi, S-K,等,“Identification and FunctionalAnalysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxaE681,,,Biochemical and Biophysical Research Communications, 365:89-95,(2008)中。本发明的fusaricidin类包括一种或多种下列化合物:fusaricidinA_D和fusaricidinL1-F03、L1-F04、L1-F05、L1-F06、L1-F07 和 L1-F08。
[0042]某些细菌产生一种或多种脂肽,且已知各种脂肽的组合具有协同的杀真菌活性。在一实施方案中,组合物的脂肽组分含有由下列脂肽类别中的至少两种脂肽的组合:表面活性素型化合物、伊枯草菌素型化合物、和芬枯草菌素型化合物。在另一实施方案中,组合含有两种或两种以上的下列化合物:伊枯草菌素As、大侧柏素A和B、芬枯草菌素A和B和表面活性素。在另一实施方案中,组合含有一种或多种下列化合物:伊枯草菌素As、大侧柏素A和B、芬枯草菌素A和B、表面活性素和阿瓜斯他汀。
[0043]本发明的脂肽通过一种或多种细菌,如上面描述的那些产生,或化学合成。如本文中所使用的术语“发酵液”,指微生物发酵后所得到的培养基,其中尤其包括微生物及其构成部分、未使用的原料底物、和在发酵过程中微生物产生的代谢物。如本文中所使用的术语“发酵固体物”,指浓缩和/或干燥了的发酵液。如本文中所使用的术语“发酵产物”,指发酵液和/或发酵固体物。如本文中所使用的术语“脂肽”,指属于发酵产物一部分的脂肽和指纯化至至少到某种程度的脂肽,为化学合成或生物产生。
[0044]培养细菌的方法是本领域公知的。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵、或液体表面培养。对于芽孢杆菌属,在发酵即将结束时,当营养素耗尽时,细胞开始从生长期向孢子形成期过渡,使得发酵的最终产物主要为孢子、代谢产物和残余发酵培养基。孢子形成是许多芽孢杆菌(Bacilli)自然生命周期的一部分,并通常从细胞对营养限制的响应开始。对于本发明,对发酵进行设定以获得高水平的脂肽和促进孢子形成。
[0045]由发酵(即,发酵液)产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢产物可直接使用或通过常规的工业方法,如离心法、正切流动过滤、滤床过滤(depth filtration)和蒸发浓缩(以制备发酵固体物)。在一些实施方案中,将浓缩的发酵固体物洗涤,例如,通过透析过滤(diafiltration)工艺洗漆,以除去残留的发酵液和代谢产物。
[0046]发酵液或发酵固体物可在添加或不添加载体的情况下采用常规的干燥工艺或方法干燥,如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、滚筒干燥、或蒸发。所得到的干发酵固体物可进一步处理,如通过碾磨或制粒,以达到特定的粒度或物理形式。干燥后还可加入下文中描述的载体,视情况用于期望的使用方法。
[0047]细菌产生的脂肽可从细菌细胞中分离或从其它细菌组分中进一步纯化且,在一些实施方案中相互分离。术语“无细胞的制剂”指通过本领域的技术人员公知的方式已经从其中除去或基本上除去细胞的发酵液。制造无细胞制剂的一些方法描述如下。无细胞的发酵液制剂可以本领域已知的任何方式获得,如发酵液的萃取、离心和/或过滤。本领域的技术人员将理解所谓的无细胞制剂可能不是完全无细胞而是主要无细胞或基本上无细胞,依赖于所用的除细胞的技术(例如,离心的速度)。可对所得到的无细胞制剂干燥和/或与有助于在其特定的应用方面的组分一起配制。上面描述的用于发酵液的浓缩法和干燥技术也适用于无细胞制剂。
[0048]在一些实施方案中,在通过发酵液的离心制备无细胞制剂之后,代谢产物可经尺寸排阻过滤如包括LH-20、G10、和G15和G25的Sephadex树脂纯化,其中当脂肽在800道尔顿至1600道尔顿之间时,所述Sephadex树脂能基于截止分子量,如低于约2000道尔顿、低于约1500道尔顿、低于约1000道尔顿等的分子量将代谢产物分组到不同的级分中。
[0049]如本文中所使用的术语“粗提取物”指发酵液的有机提取物,诸如乙酸乙酯提取物,其中该提取物富集脂肽。一种由细菌培养物获得脂肽粗提取物的方法描述于实施例1中。
[0050]如本文中所使用的术语“半纯化的”,指从发酵液中分离出来的约50%至约90%纯的脂肽。如本文中所使用的术语“纯化的”,指从发酵液中分离出来的约91%至约100%纯的脂肽。本发明的脂肽可以是纯化或半纯化的。
[0051]在一实施方案中,本发明的脂肽由枯草芽孢杆菌QST713获得或者枯草芽孢杆菌QST713的发酵产物用作组合物的含脂肽组分。枯草芽孢杆菌QST713、其突变体、其上清液、及其脂肽代谢产物、和它们 用于控制植物病原体和昆虫的方法全部描述于美国专利6,060,051; 6,103,228; 6, 291,426; 6, 417,163 和 6,638,910 中。在这些专利中,菌株称为 AQ713。枯草芽孢杆菌QST713已依据用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约的条款在1997年5月7日于NRRL以保藏号B21661保藏。本说明书中关于QST713的任何提及指枯草芽孢杆菌QST713。适用于本发明的枯草芽孢杆菌QST713的特定变异体(例如,枯草芽孢杆菌AQ30002和AQ30004,以保藏号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏)描述于美国专利申请13/330,576中。
[0052]在其它实施方案中,能产生脂肽的芽孢杆菌菌株用作本发明脂肽的来源。如上所述,发酵液或发酵液的提取物可用作本发明的协同杀真菌组合中的含脂肽组分。由QST713的发酵液获得脂肽的方法描述于实施例中。通常由芽孢杆菌属细菌的发酵液获得脂肽,并且就脂肽的存在分析发酵液是本领域技术人员公知的,使得适合于本发明的其它菌株能容易被技术人员识别。产生各种脂肽的芽孢杆菌属菌株描述于上文引用的Ongena综述文章(Trends in Microbiology (2007)Vol.16,N0.3)中。许多其它文章描述了产脂肽的芽孢杆菌属菌株和由此种菌株的发酵液提取脂肽的方法:参见;例如,Alvarez, F.,等,“The piant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP218andARP23capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin andfengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease,,Journalof Applied Microbiology(2011) 112:159-174;Ongena, M.等,“Involvement offengycin—type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential ofBacillus subtilis,” Applied Microbiology Biotechnology (2005) 69:29-38 ;Wang, Y.,等,“Separation and extraction of antimicrobial lipopeptides produced byBacillus amyloliquefaciens ES_2with macroporous resin,,Eur.Food Res.Technol.(2010)231:189-196。
[0053]本发明的组合物可包含载体,其为加入到组合物中的惰性制剂成分以改善回收率、效力、或物理性能和/或有助于包装和给药,其中组合物包括含脂肽的发酵产物、脂肽的无细胞制剂或纯化的、半纯化的或粗品的脂肽提取物。此种载体可单独或组合加入。
[0054]本发明的组合物可用于各种目的,包括作物的保护和收获后水果、蔬菜和植物的保护;作为化妆品、加工食品、动物饲料、或木材的防腐剂;和用于药物和兽医的应用。依赖于具体的应用,将组合物与适宜的载体一起配制有助于它们的应用或施用。在一些实施方案中,载体为抗结块剂、抗氧化剂、膨胀剂(bulking agents)、和/或保护剂。有用载体的实例包括多糖(淀粉、麦芽糖糊精、甲基纤维素、蛋白质、如乳清蛋白、肽、树胶),糖(乳糖、海藻糖、蔗糖),脂质(卵磷脂、植物油、矿物油),盐(氯化钠、碳酸钙、枸橼酸钠),硅酸盐(粘土、无定形硅石、烟雾/沉淀硅石、硅酸盐盐类),蜡,油,醇和表面活性剂。
[0055]用于动物饲料添加剂的适宜的载体列于American Feed ControlOfficials, Inc.' s Official Publication 中,每年公布一次。参见,例如 OfficialPublication of American Feed Control Officials,Sharon Krebs, editor, 2006版,ISBN1-878341-18-9。
[0056]用于药物或兽医应用的组合物与基于给药方式而变化的药学上可接受的载体相组合。
[0057]本发明的组合物可以以控制病原体的有效量应用于需要处理的场所。如本文中所使用的术语“控制”,指杀 死或抑制病原体的生长。在一实施方案中病原体为真菌。在另一实施方案中病原体为卵菌。
[0058]在一实施方案中,聚烯杀真菌剂和含脂肽的组分(例如纯化或半纯化的脂肽、粗提取物、发酵产物或化学合成或衍生化的产品)以1:1比例(w/w)应用。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽的成分的比例为约2: 1、约3: 1、约4: 1、约5: 1、约10: 1、约15: 1、约20:1、或约50:1。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的比例为约1:2、约1:3、约 1:4、约 1:5、约 1:10、约 1:15、约 1:20、或约 1:50。
[0059]在一具体的实施方案中,聚烯杀真菌剂与包含一种或多种脂肽的含脂肽组分可在该组合物中以各种重量/重量(w/w)比提供。在一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的重量/重量比为约500:1至约1:500。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的重量/重量比为约100:1至约1:100。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的重量/重量比为约10:1至约1:10。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的重量/重量比为约5:1至约1:5。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的重量/重量比为约2:1至约1:2。在另一实施方案中,聚烯杀真菌剂与含脂肽成分的重量/重量比约1:1。
[0060]在一实施方案中,该组合物应用于植物或应用于食用栽培蘑菇。在植物应用中,组合物可应用于植物的任何部分,包括它的根、叶或果实,或应用于植物周围的区域,包括植物周围的土壤。在蘑菇应用中,组合物可应用于蘑菇或应用于蘑菇菌丝体或应用于蘑菇基肥。应用可在种植之前、种植时和/或种植后发生。示例性的靶向病原体为镰孢霉属物种、葡萄孢属物种、轮枝孢霉属物种、丝核菌属物种、木霉属物种(绿霉)、腐霉属物种和疫霉属(Phytophthora)物种。确定本发明组合物的施用量为本领域的技术人员公知。本发明的组合物将通常由0.005g/L至100g/L每种聚烯杀真菌剂和非核糖体蛋白,如脂肽,构成。在协同的组合物应用于植物、植物局部或应用于植物周围的区域或应用于食用栽培蘑菇、蘑菇菌丝体或蘑菇基肥的一实施方案中,聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。
[0061]在另一实施方案中场所为收获后食品和收获后非食用植物材料,如生物燃料的原料。如本文中所使用的,收获后食品指从田地收获以后但包装之前的水果、蔬菜、谷粒、油菜籽、和任何其它食用植物和坚果。示例性的收获后病原体包括但不限于:灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(灰霉)、致病性刺盘孢属物种如急尖炭疽刺盘孢菌(Colletotrichumacutatum)、Colletotrichum coccodes、t5蕉科炭疽刺盘抱菌(Colleotrichum musa)、和头干状炭疽刺盘孢菌(Colletotrichum capsici)、软腐欧文氏菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)、白地霉、柑橘采后酸腐病菌(酸腐病)、Helminthosporium solani (马铃薯的银腐病)、Monilinia fructicola (褐腐病)、青霉属物种,包括指状青霉(digitatum)(柑桔绿霉病)和扩展青霉(仁果类的青霉)、根霉属(Rhizopus)物种(根霉腐烂或渗漏)、黑曲霉(黑霉)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)(胡萝卜黑根腐病)、水果的毛霉菌腐烂(例如,梨上的梨形毛霉(Mucor piriformis))、和链格孢属腐烂(主要影响胡萝卜、西兰花、马铃薯、胡椒、苹果、猕猴桃、梨、榲梓(quinces)和西红柿)。确定本发明组合物用于收获后食品和收获后非食用植物材料的施用量为本领域的技术人员公知。在一实施方案中在组合物应用于收获后食品和收获后非食用植物材料,如生物燃料的原料的情况下,聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。
[0062]在另一实施方案中场所为食品或饲料。如本文中所使用的术语食品包括加工食品,如乳制品、面包、玉米饼、熟食店肉类、和焙烤食品;半加工的或微加工的食品如肉和切开的水果和蔬菜;和包装的食品,如包装的莴苣、菠菜及其它蔬菜。术语饲料包括经过加工的动物性饲料和青贮饲料。在此种应用中靶向病原体为诱导腐败和产生真菌毒素的病原体。示例性的病原体为曲霉属物种、青霉属物种和镰孢霉属物种。确定本发明组合物的施用量为本领域的技术人员公知。剂量水平和推荐的应用方法详述于许多参考文献,包括Davidson, P.Michael,等,eds., Antimicrobials in Food,第三版,CRC Press2005,第 8章,第275-289页。在其中本发明的协同组合物应用于食品或饲料的一个实施方案中,聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。
[0063]在另一实施方案中场所为人或动物。在人和兽医应用中,将组合物局部地应用于皮肤和粘膜以控制白色念珠菌和/或镰孢霉属物种。在一实施方案中,组合物用于预防或治疗阴道感染,尤其是白色念珠菌引起的以及光滑念珠菌(C.glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)、和热带念珠菌(C.tropicalis)。在其中协同组合物应用于治疗念珠菌属的一个实施方案中聚烯杀真菌剂组分为制霉菌素。在人类中,本发明的组合物还可应用于指甲、头皮和皮肤以控制皮肤真菌,如发癣菌属(Trichophyton)、表皮癖菌属(Epidermophyton)和小孢霉属(Microsporum),其对局限于身体角化结构(皮肤、指甲和头发)的各种疾病表现负责。在人类中,该组合物可以锭剂的形式施用,以治疗口腔念珠菌病或口服施用以治疗或预防肠念珠菌病。本发明的组合物还可用于治疗曲霉和镰孢霉角膜感染。在其中组合物用于治疗角膜感染的一个实施方案中,组合物的聚烯杀真菌剂组分为那他霉素或其衍生物。确定本发明组合物的适宜的施药量将属于本领域技术人员的公知常识。
[0064]在一些实施方案中在应用或施用组合物之前对需要处理的场所进行鉴别。
[0065]在一实施方案中,组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可根据它们对各种剂型的适配性而变化。在一实施方案中,组合物可包含一种或多种局部组合物形式的药学上可接受的载体。局部组合物可以是霜剂、凝胶、油、喷雾、粉末、糊剂、粘土(clay)的形式或任何本领域已知的用于将组合物施用于皮肤或受试者(人或动物)的其它形式、方式或方法。含在局部组合物中的可接受的载体可根据制剂的类型进行变化。例如,软膏、糊剂、霜剂或凝胶剂制剂可包含动物和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚二醇类、硅酮、斑脱土、硅土、滑石粉、氧化锌或这些物质的混合物。 [0066]在一实施方案中,组合物可包含一种或多种作为口服组合物的药学上可接受的载体。口服剂型可以是固体粉末、小胶囊、片剂、锭剂、丸剂、胶囊、软凝胶或液体的形式,其可单独或以与其它组分适当的组合形式施用。例如,本发明的组合物可作为容易给药的实践以一个或多个小胶囊或锭剂施用。在制备口服剂型的组合物中,任何常规介质都可以利用。至于液体制剂(例如,悬浮液、酏剂、和溶液),可使用含有例如水、油、醇、矫味剂、防腐剂、着色剂等的介质。药学上可接受的载体如淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等可用于制备口服固体物(例如,粉末、小胶囊、丸剂、片剂、胶囊、和锭剂)。也可以运用控释形式。由于它们易于施用,小胶囊、片剂、丸剂、和胶囊为最有利的口服剂量单位形式,在这种情况下使用固体载体。如果期望,片剂可以按标准技术包糖衣或肠溶包衣。所有这些药物载体和制剂为本领域普通技术人员公知。参见例如,WADE&WALLER,HANDBOOK OFPHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (第二版,1994)。
[0067]在本发明的具体实施方案中可包括软凝胶剂型的组合物。软凝胶为装有溶液、悬浮液、或半固体糊剂的整块的密封的软明胶壳。软凝胶主要用于容纳液体,其中活性成分以溶解或悬浮的状态存在。软凝胶已经是公知的且使用了许多年和用于各种目的。由于软凝胶具有完全不同于两构件(two-piece)的硬壳胶囊性质,因此软凝胶能保留液体填充物。软凝胶通常用于以胶囊包裹液体媒介物(vehicle)或载体(carrier)中的消费物质,包括维生素、饮食补充剂、药物等。软凝胶是可提供优于传统剂型如片剂、硬壳胶囊和液体的明显优点的独特的剂型。这些优点包括患者依从性和消费者偏好、改善的生物利用度、在许多情况下的产品开发速度、缩短的制造时间、由于活性成分较少暴露于氧而带来的增强的药物稳定性、优良的剂量均一性、和产品差异。
[0068]在一实施方案中,本发明的组合物和方法可具有令人愉快的或适口的味道。适口的味道可通过包含甜味剂和/或香料来实现。可包含在本发明组合物中的甜味剂,通过举例说明和非限制性地包括,蔗糖、果糖、高果糖玉米糖浆、葡萄糖、糖精钠、麦芽糖糊精、阿司帕坦、乙酰舒泛钾、新橙皮苷双氢查耳酮、三氯蔗糖、甘草酸单铵、及其它本领域普通技术人员已知的那些。
[0069]崩解剂也可包含在本发明的组合物中以促进溶出。崩解剂,包含渗透化剂和芯吸剂,能将水或唾液汲取到组合物中,促进从组合物的内部以及外部溶出。可用于本发明中的这种崩解剂、渗透化剂和/或芯吸剂,通过举例说明和非限制性地包括,淀粉,如玉米淀粉,马铃薯淀粉,其预胶化和改性淀粉,纤维素试剂,如艾迪速(Ac-d1-sol ),蒙脱石粘土,交联PVP,甜味剂,斑脱土,微晶纤维素,交联羧甲纤维素钠,藻酸盐,淀粉羟基乙酸钠,树胶,如琼月旨,瓜尔胶,刺槐豆(locust bean),卡拉牙胶,果胶,阿拉伯胶,黄原胶和西黄蓍胶、对含水溶剂具有高亲和性的硅土,如胶体二氧化硅,沉淀二氧化硅,麦芽糖糊精,β -环糊精,聚合物,如卡波姆,和纤维素试剂,如羟甲基纤维素,羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。
[0070]除上面描述的那些之外,任何适当的填充剂和赋形剂都可用于制备本发明的组合物,只要它们符合本文中描述的目的。例如,粘合剂为用于制粒中导致粉粒粘附的物质。这种用于本发明中的合适的化合物,通过举例说明和非限制性地包括,金合欢胶,可压性糖,明胶,蔗糖及其衍生物,麦芽糖糊精,纤维素聚合物,如乙基纤维素,羟丙基纤维素,羟丙基甲基纤维素,羧甲基纤维素钠和甲基纤维素,丙烯酸类聚合物,如不溶性丙烯酸酯甲基丙烯酸铵共聚物,聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸共聚物,聚维酮,共聚维酮,聚乙烯醇类,藻酸,藻酸钠,淀粉,预胶化淀粉,瓜尔豆胶,聚乙二醇及其它本领域普通技术人员已知的那些。
[0071]稀释剂也可包含在本发明的组合物中以增进组合物的粒化。稀释剂可,通过举例说明和非限制性地包括,微晶纤维素,蔗糖,磷酸二钙,淀粉,乳糖和小于13个碳原子的多元醇,如甘露醇,木糖醇,山梨醇,麦芽糖醇和药学上可接受的氨基酸,如甘氨酸,和它们的混合物。
[0072]润滑剂为用于组合物制剂中减少组合物压制过程中的摩擦。可用于本发明中的润滑剂,通过举例说明和非限制性地包括,硬脂酸,硬脂酸钙,硬脂酸镁,硬脂酸锌,滑石粉,矿物油和植物油,苯甲酸,聚(乙二醇),山嵛酸甘油酯,硬脂基富马酸酯,及其它本领域普通技术人员已知的那些。
[0073]助流剂改善制 造过程中粉末混合物的流动和使组合物重量差异减到最小。可用于本发明中的助流剂,通过举例说明和非限制性地包括,二氧化硅,胶态或烟雾硅石,硬脂酸镁,硬脂酸钙,硬脂酸,玉米淀粉,滑石粉及其它本领域普通技术人员已知的那些。
[0074]着色剂也可包含在本发明的组合物中。如本文中所用的,术语“着色剂”包括用于赋予制剂颜色的化合物。此种化合物,通过举例说明和非限制性地包括,FD&C红3,FD&C红20,?0&(:黄6,?0&(:蓝2,0 & C绿5,FD&C橙5,D & C红8,焦糖,和氧化铁,红颜料及其它本领域普通技术人员已知的那些。着色剂还可包括颜料,染料,色调剂(tints),二氧化钛,天然着色剂,如葡萄皮提取物,甜菜红粉,β胡萝卜素,胭脂树萃(annato),卡红(carmine),姜黄,辣椒粉及其它本领域普通技术人员已知的那些。
[0075]含水注射悬浮液可含有增强悬浮液粘度的物质,如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外,活性化合物的悬浮液可制成合适的油性注射悬浮液形式。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油,或合成脂肪酸酯,如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可用于递送。
[0076]组合物可包含增溶剂以确保活性成分如杀真菌剂和/或脂肽良好的溶解和/或溶出。也加入增溶剂以提高杀真菌剂和/或脂肽和/或其它组分,如表面活性剂,的溶解度,或维持组合物在稳定的或均匀的溶液或分散液状态。
[0077]适宜的增溶剂的实例包括但不限于下列:醇类和多元醇,如乙醇,异丙醇,丁醇,苯甲醇,乙二醇,丙二醇,丁二醇及其异构体,甘油,季戊四醇,山梨醇,甘露醇,卡必醇(transcutol),二甲基异山梨醇,聚乙二醇,聚丙二醇,聚乙烯醇,羟丙基甲基纤维素及其它纤维素衍生物,环糊精和环糊精衍生物;平均分子量为约200至约6000的聚乙二醇的醚类,如四氢糠醇PEG醚(glycofuiOl)或甲氧基PEG ;酰胺类及其它含氮化合物如2-吡咯烷酮,2-哌啶酮,ε -己内酰胺,N-烷基吡咯烷酮,N-羟烷基吡咯烷酮,N-烷基哌啶酮,N-烷基己内酰胺,二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮;酯如丙酸乙酯,三丁基枸橼酸酯,乙酰基枸橼酸三乙酯,乙酰枸橼酸三丁酯,枸橼酸三乙酯,油酸乙酯,辛酸乙酯,丁酸乙酯,三醋精,丙二醇单乙酸酯,丙二醇双乙酸酯,ε-己内酯及其异构体,δ-戊内酯及其异构体,β-丁内酯及其异构体;及其它本领域已知的增溶剂,如二甲基乙酰胺,二甲基异山梨醇,N-甲基吡咯烷酮,单辛精,二甘醇单乙醚和水。
[0078]也可使用增溶剂的混合物。实例包括但不限于,三醋精,枸橼酸三乙酯,油酸乙酯,辛酸乙酯,二甲基乙酰胺,N-甲基吡咯烷酮,N-羟乙基吡咯烷酮,聚乙烯吡咯烷酮,羟丙基甲基纤维素,羟丙基环糊精,乙醇,聚乙二醇200-100,糖原质,卡必醇(transcutol),丙二醇,和二甲基异山梨醇。在一些实施方案中,增溶剂包括山梨醇,甘油,三醋精,乙醇,PEG-400,糖原质和丙二醇。
[0079]可包含的增溶剂的量没有特别地限制。所给定的增溶剂的量可限于生物可接受的量,其可由本领域技术人员容易确定。在一些情况下,包含远远超过生物可接受的量的增溶剂的量,例如,以使药物的浓度达到最大可能是有利的,其中过量的增溶剂在将组合物提供给受试者之前采用常规的技术,如蒸馏或蒸发,除去。因此,如果存在,增溶剂可到达基于药物、及其它赋形剂相加重量的约10%,25%,50%, 100%,或最高约200%重量的重量比。如果期望,也可使用极少量的增溶剂,如约5%、2%、1%或更少。典型地,增溶剂可以约1%至约100%的量存在,更典型地以约5%至约25%重量的量存在。
[0080] 以下实施例纯粹为了本发明的示例性和非限制性的目的给出。
实施例
[0081]实施例1:脂肽和那他霉素抗酿酒酵母的协同效果
[0082]对脂肽和那他霉素组合的抗酿酒酵母效力进行测验,酿酒酵母被公认为测试抗真菌活性的有机物模型且与念珠菌属紧密相关。参见Smits, GJ,等,“Stress Tolerance inFungi To Kill a Spoilage Yeast,,,Current Opin Biotechnol., 16(2):225-30, (2005)和 Castrillo, JI,等,“Yeast as a Touchstone in Post-Genomic Research:Strategiesfor Integrative Analysis in Functional Genomics, ”J Biochem Mo IBiol.,37(1):93-106, (2004)。
[0083]所用的脂肽为由枯草芽孢杆菌QST713的发酵液部分纯化的伊枯草菌素型化合物、大侧柏素型化合物和表面活性素类的复合混合物。将含有Luria肉汤(LB)的种子瓶接种QST713菌株,并将这些烧瓶在30°C下过夜培养。第二天,将取自种子瓶的等分试样接种到大豆基培养基中并使其生长直至孢子形成。将枯草芽孢杆菌QST713发酵液酸化至pH2并离心从上清液分离出固体物。脂肽集中在沉淀丸斑(pellet)中。轻轻倒出上清液并将沉淀丸斑用含水有机溶剂混合物(优选80/20乙腈/水)提取。脂肽集中在含水有机级份上。将混合物离心并移除上清液。将细胞沉淀丸斑用含水有机溶剂混合物(优选80/20乙腈/水)再提取两次。将每次提取的上清液合并,并在真空中除去溶剂。干燥过的提取物含有在枯草芽孢杆菌QST713中发现的所有三个类别的脂肽的富集形式:伊枯草菌素型化合物,包括伊枯草菌素A2,伊枯草菌素A3、A4或A5,伊枯草菌素A6,伊枯草菌素A7 ;芬枯草菌素型化合物,包括大侧柏素Al,大侧柏素A2,大侧柏素BI,大侧柏素B2,阿瓜斯他汀A,阿瓜斯他汀B,芬枯草菌素A,芬枯草菌素B ;表面活性素Al、A2或A3,表面活性素BI或B2和表面活性素Cl或C2。可将干燥过的提取物再悬浮于含水有机溶剂混合物(优选80/20乙腈/水)中。
[0084]使酿酒酵母野生型菌株BY4742在下列物质的存在下生长在液体YPD中:(I)那他霉素(Haorui Pharma-Chem Inc), (2)上述脂肽提取物,(3)那他霉素+脂肽提取物,和4)不存在脂肽或那他霉素(对照)。在加入到液体培养物之前那他霉素的初浓度为Ippm且脂肽提取物的初浓度为15ppm。那他霉素在液体培养物中的终浓度为0.08ppm且脂肽提取物的终浓度为1.12ppm,使得含有二者的样品中那他霉素与脂肽的重量/重量比为1:14。
[0085]含在30°C下生长16小时之后将那他霉素和/或脂肽的液体培养物的光密度(OD)与对照培养物的光密度进行比较。为了比较,将未处理的对照培养物的OD设置在100%并将处理过的培养物标准化至此值。
[0086]应用高英方程如下,以测定脂肽与那他霉素的协同作用。
[0087]高英方程式:Exp=X+[Y* (100-X) ] /100
[0088]如果Etjb^Exp,则存在协同效果
[0089]注:在上述方程式中Ελ、Exp, X和Y代表生长抑制。因此,X和Y通过从100减去处理过的板上的生长量来计算,如下所示。
[0090]Χ=100-77.8`9=22.11,Υ=100_93.87=6.13
[0091]Eob=100-8.51=91.49
[0092]Exp=22.11+ [6.13* (100-22.11) ]/100=26.88
[0093]Eob?Exp
[0094]结果还显示于附图1中。
[0095]实施例2:采用由商购可得的产品得到的脂肽测试那他霉素和脂肽抗酿酒酵母的协同效果
[0096]此研究,类似于实施例1的描述,采用由SERENADE?max杀真菌剂或SERENADE? Aso杀真菌剂获得的脂肽的粗提取物作为起始点进行(而不是从未配制的枯草芽孢杆菌QST713的发酵液开始)。SERENADE?产品可商购获得,它们的活性成分为枯草芽孢杆菌QST713。脂肽的粗提取物通过将SERENADE? Aso(或SERENADE? max,溶于水)酸化至PH2、离心并用有机溶剂混合物提取所得到的沉淀丸斑(pellet)来获得。将所得到的脂肽与如上所述的那他霉素组合并测试该混合物的抗酿酒酵母活性。可预见与上面获得的结果相同。
[0097]实施例3:那他霉素和脂肽的粗提取物抗扩展青霉的协同效果
[0098]研究(i)那他霉素(HaoruiPharma-Chem Inc.), (ii)得自枯草芽抱杆菌 QST713的脂肽粗提取物(按照实施例1中的描述制备),和(iii)那他霉素和脂肽粗提取物的组合对扩展青霉的作用。在96孔板中进行液体真菌生长试验以测定脂肽和那他霉素的组合在抑制真菌生长方面是否是协同作用。所有步骤都是无菌进行。
[0099]对于各96孔板,对每个孔进行三次独立的添加。首先,加入100 μ I的马铃薯右旋糖肉汤W/100ppm氯霉素。然后补充25 μ I的各样品(脂肽、那他霉素、或得自稀释板的组合(combo))。最后,将50μ1的DI H2O加入到空白板中(该板意在作为空白用于OD参比)或者将50μ I的IO5真菌接种物加入到其各自板内的每个孔中。这样,每个孔中脂肽的终浓度为1.1ppm且每个孔中那他霉素的终浓度为1.1ppmo然后将板盖上盖子并置于20°C下温育3天。
[0100]对板进行评价并解释数据
[0101]在温育期之后,通过使用可在Wallac? Victor?软件中找到的设置“micSettingsi600 (0.1s) ”米用PerkinElmer Victor板读数器在600nm下的光密度对每个板内每个孔的生长情况进行评价。在样品活性下降的情况下当在稀释系列中出现浑浊的孔(部分生长)时还可用视觉粗略地评价结果。
[0102]在获得每个孔的OD之后,通过下述计算测定相对生长:[(处理w/细菌)_(处理w/o细菌)/(稀释剂对照w/细菌)-(稀释剂对照w/o细菌)]X100。如果在600nm下的OD读数的平均值和标准差远远高于非接种过的OD参比孔的范围,则认为细菌生长的阳性对照孔是可接受的。(在未接种过的稀释剂对照和接种过的稀释剂对照孔的读数之间必须存在很大的差别以确保获得良好的生长)。
[0103]然后绘制该生长百分数相对测试过的用于稀释的样品的图表并将最后的提供至少80%生长抑制的稀释度作为最低抑制浓度(MIC)。
[0104]然后通过上面给出的高英方程式测定协同协同效果。
[0105]在本实施例中,1.1ppm脂肽的生长百分数为113%。1.1ppm那他霉素的生长百分数为102%。1.1ppm脂肽+1 .1ppm那他霉素的生长百分数为20.4%。
[0106]X=100-102.1
[0107]Y=100-112.9
[0108]Exp=-2.1+(-12.9(102.1))/100
[0109]Exp=-15.3
[0110]作为替代,对于100以上的生长百分数,舍去取整数为100。在我们的实施例中,这将使Exp=O
[0111]Eob=100-20.4
[0112]Eob=79.6
[0113]79.6?-15.3
[0114]Eob?Exp ;因此,观察到协同效果,如附图2所描述的。
[0115]实施例4:半纯化和纯化的大侧柏素类、伊枯草菌素类和表面活性素类和那他霉素抗扩展青霉的协同效果
[0116]采用扩展青霉作为靶向病原体以(i)那他霉素和得自枯草芽孢杆菌QST713的脂肽粗提取物(按照以上所述获得)和(ii)那他霉素和从枯草芽孢杆菌QST713获得的半纯化和纯化的脂肽的组合进行类似于上面描述的那些的实验,实验如下。采用酸化之后用有机溶剂萃取从枯草芽孢杆菌QST713发酵液中沉淀和提取伊枯草菌素型化合物,包括伊枯草菌素As、和芬枯草菌素型化合物,包括大侧柏素类(A,B和阿瓜斯他汀类)和芬枯草菌素类。通过反相色谱法再将这些脂肽纯化和分离,得到约83%纯的芬枯草菌素型化合物和约88%纯的伊枯草菌素类。用有机溶剂提取表面活性素类然后采用尺寸排阻柱型色谱法再纯化至95%的纯度。采用高效液相色谱跟踪测定每种脂肽类别的纯度。
[0117]每个试验孔中那他霉素的终浓度为2.23ppm ;每个孔中脂肽粗提取物的终浓度为2.23ppm ;每个孔中伊枯草菌素型化合物、表面活性素或芬枯草菌素型化合物的每种半纯化或纯化的脂肽提取物的终浓度为2.23ppm。因此,含有组合的孔中各组分的重量/重量比为1:1。
[0118]结果显示在各种组合之间有协同效果,如图3和表1中所示。表1显示如上所述的采用高英方程式的协同效果计算。
[0119]表1
[0120]
【权利要求】
1.一种组合物,包含聚烯杀真菌剂和至少一种脂肽的协同杀真菌组合。
2.权利要求1的组合物,其中至少一种脂肽选自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物和fusaricidin类。
3.权利要求1的组合物,其中所述至少一种脂肽为一种或多种伊枯草菌素型化合物。
4.权利要求1的组合物,其中所述至少一种脂肽为一种或多种芬枯草菌素型化合物。
5.权利要求1的组合物,其中所述至少一种脂肽为一种或多种表面活性素。
6.权利要求3的组合物,其中所述伊枯草菌素型化合物为伊枯草菌素A。
7.权利要求3的组合物,其中所述伊枯草菌素型化合物为芽孢菌霉素。
8.权利要求1的组合物,其中所述至少一种脂肽为fusaricidin。
9.权利要求1的组合物,包含至少两种脂肽。
10.权利要求书9的组合物,其中所述至少两种脂肽选自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和芬枯草菌素型化合物。
11.权利要求10的组合物,其中所述至少两种脂肽选自伊枯草菌素类、表面活性素类和芬枯草菌素型化合物。
12.权利要求1的 组合物,其中所述至少一种脂肽为含脂肽的发酵产物的一部分或含脂肽的发酵产物的提取物。
13.权利要求12的组合物,其中所述含脂肽的发酵产物得自芽孢杆菌属(Bacillus)物种的细菌。
14.权利要求13的组合物,其中所述芽孢杆菌属物种的细菌选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或角军淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
15.权利要求14的组合物,其中所述枯草芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌QST713及其变异体。
16.权利要求2的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂为那他霉素或其衍生物。
17.权利要求2的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂为制霉菌素或其衍生物。
18.权利要求2的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂为两性霉素B或其衍生物。
19.权利要求2的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂为金色制霉素或其衍生物。
20.权利要求2的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂为非律平或其衍生物。
21.权利要求2的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂为光明霉素或其衍生物。
22.权利要求1的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约500:1至约1:500。
23.权利要求1的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约100:1至约1:100。
24.权利要求1的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约10:1至约1:10。
25.权利要求1的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约5:1至约1:5。
26.权利要求1的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约2:1至约1:2。
27.权利要求1的组合物,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约1:1。
28.—种控制真菌病原体的方法,包括将有效量的包含聚烯杀真菌剂和至少一种脂肽的协同组合的组合物施用于需要处理的场所。
29.权利要求28的方法,其中所述至少一种脂肽选自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物、芬枯草菌素型化合物和fusaricidin类。
30.权利要求29的方法,其中所述至少一种脂肽为一种或多种伊枯草菌素。
31.权利要求29的方法,其中所述至少一种脂肽为一种或多种表面活性素。
32.权利要求29的方法,其中所述至少一种脂肽为一种或多种芬枯草菌素型化合物。
33.权利要求29的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为那他霉素或其衍生物。
34.权利要求29的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为制霉菌素或其衍生物。
35.权利要求29的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为两性霉素B或其衍生物。
36.权利要求29的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为金色制霉素或其衍生物。
37.权利要求29的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为非律平或其衍生物。
38.权利要求29的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为光明霉素或其衍生物。
39.权利要求28的方法,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约500:1至约1:500。`
40.权利要求28的方法,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约100:1至约1:100。
41.权利要求28的方法,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约10:1至约1:10。
42.权利要求28的方法,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约5:1至约1:5。
43.权利要求28的方法,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约2:1至约1:2。
44.权利要求28的方法,其中所述聚烯杀真菌剂和所述至少一种脂肽的重量/重量比为约1:1。
45.权利要求28的方法,其中所述至少一种脂肽为含脂肽的发酵产物的一部分或含脂肽的发酵产物的提取物。
46.权利要求28的方法,其中所述含脂肽的发酵产物得自芽孢杆菌属物种的细菌。
47.权利要求46的方法,其中所述芽孢杆菌属为枯草芽孢杆菌QST713或其变异体。
48.权利要求28的方法,其中所述场所为收获后的食物且真菌病原体为收获后病原体。
49.权利要求48的方法,其中所述收获后病原体为青霉属(Penicillium)物种或地霉属(Geotrichum)物种。
50.权利要求48或49的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为那他霉素且所述至少一种脂肽选自伊枯草菌素型化合物、表面活性素型化合物和芬枯草菌素型化合物。
51.权利要求28的方法,其中所述场所为植物、根、种子或植物周围的土壤,且真菌病原体为真菌植物病原体。
52.权利要求28的方法,其中所述场所为食物或饲料且聚烯杀真菌剂为那他霉素。
53.权利要求28的方法,其中所述场所为人或动物且其中真菌病原体为念珠菌属(Candida)。
54.权利要求53的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为制霉菌素。
55.权利要求28的方法,其中所述场所为人或动物,且其中真菌病原体为曲霉属(Aspergillus)物种或镰孢霉属(Fusarium)物种,且其中聚烯杀真菌剂为那他霉素。
56.一种治疗或预防受试者真菌感染的方法,该方法包括给受试者施用包含聚烯杀真菌剂和至少一种脂肽的协同组合的组合物。
57.权利要求56的方法,其中所述受试者为人或动物且真菌感染由念珠菌属引起。
58.权利要求57的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为制霉菌素。
59.权利要求56的方法,其中所述真菌感染由镰孢霉属物种或曲霉属物种引起。
60.权利要求59的方法,其中所述聚烯杀真菌剂为那他霉素。
61.组合物,包含聚烯杀真菌剂和含脂肽的发酵产物。
62.权利要求61的组合物,其中所述含脂肽的发酵产物得自芽孢杆菌属物种的细菌。
63.一种控制真菌病原体的方 法,包括将包含聚烯杀真菌剂和含脂肽的发酵产物的组合物施用于需要处理的场所。
【文档编号】C07H17/08GK103732064SQ201280025177
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年5月24日
【发明者】M·吉亚贝尔-戈雅, J·S·马戈利斯 申请人:拜尔作物科学有限合伙公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1