Tnf超家族三聚化的抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于抑制属于TNF超家族配体的三聚化的方法和组合物。具体地说，本发明涉及抑制RANKL的三聚化。因此，本文提供的所述方法和组合物可被用于治疗与增加的RANK信号传导相关的失调，具体地说，可用于治疗涉及骨质流失相关的失调。还提供了抑制属于TNF超家族配体的三聚化的新型化合物。
【专利说明】TNF超家族三聚化的抑制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于抑制属于TNF超家族的配体三聚化的方法和组合物。具体地说，本发明涉及抑制RANKL三聚化。因此，本文提供的方法和组合物可被用于治疗与增加的RANK信号传导相关的失调，具体地说，可被用于治疗涉及骨质流失的失调。
【背景技术】
[0002]骨重建是通过成骨细胞合成骨基质并且通过成骨细胞调整骨吸收的连续过程[1，2]。正常情况下，成骨细胞活性和破骨细胞活性是相平衡的，从而保持骨骼的完整性。骨重建中的紊乱可导致骨骼异常，诸如由于受损的破骨细胞活性而导致的以过量的骨量为特征的骨骼石化症以及由于增强的破骨细胞活性而导致的以减少的骨量为特征的骨质疏松症。RANKL是破骨细胞诱导的骨吸收的主要介质[3]，并且属于以同三聚化为的TNF超家族[4，5] ο它是II型跨膜蛋白，由形成β -折叠的短N末端细胞质结构域和保守的胞外结构域组成，该II型跨膜蛋白被预期为组装成受体活化所需的三聚体[6，7]。通过跨膜形式的蛋白水解加工或通过可选择的剪接产生可溶的RANKL[8，9] oRANKL表达在活化的T淋巴细胞[4，5]以及基质细胞[10，11]上，并且以三聚体与其受体RANK结合，RANK表达在破骨细胞前体和成熟的破骨细胞的表面上。这种相互作用对于破骨细胞的分化、活性和存活是必要的[10，12]，随后将导致骨吸收。骨保护素(OPG) (RANKL的诱饵受体)抑制RANKL与RANK的结合，并且因而限制破骨细胞生成[11]。RANKL[13，14]和RANK[15，16]的基因消融由于破骨细胞形成的完全缺乏而导致严重的骨硬化病，这证实了 RANKL和RANK对于破骨细胞生成是必不可少的。OPG的缺失导致增加的破骨细胞生成和骨钙质缺乏[17]。而PANKL由于其在骨吸收中的作用而闻名，它还在免疫系统[4,5，13，18，19]、怀孕期间的乳腺发育[20]、体温调节[21]、癌症转移[22]以及激素源性的乳房发育[23]中起到多重作用。
[0003]由于RANKL在骨骼上的效果，RANKL是在骨质疏松症、类风湿关节炎和癌症转移中抑制骨吸收的主要治疗靶点[24]。事实上，使用狄诺塞麦(denosumab)(针对RANKL的完全人源性单克隆抗体)的临床试验在患有骨质疏松症的绝经后妇女中[25]以及在接受雄激素剥夺疗法的前列腺癌的患者中[26]显示出增加的骨量和降低的骨折发生率。最近，这种抗体已被批准在美国和欧盟中用于治疗患有骨质疏松症的患者以及正在经受激素消融疗法的前列腺癌患者。另一方面，最近已经报道了患有常染色体隐性遗传骨硬化病(ARO)( 一种无法治愈的罕见遗传性疾病)的儿童中位于RANKL的胞外结构域内的各种突变(0MM602642) [27]。然而，不仅受限于参与RANKL功能的重要残基的识别，而且受限于对ARO潜在的分子发病机制的阐明，尚未报道在Rankl基因中携带功能突变的动物模型。
【发明内容】
[0004]本公开的一个方面提供了一种用于抑制TNF超家族成员多肽的三聚化的方法，所述方法包括使所述多肽与三聚化抑制剂相接触，所述三聚化抑制剂选自
[0005]a)显性阴性的TNF超家族成员多肽或其片段，优选在三聚化结构域中具有显性阴性突变的TNF超家族成员多肽或其片段；
[0006]b)在所述多肽的Fi3-链中与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，优选地，在对应于人类RANKL中第279位甘氨酸残基处与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，而假若当所述三聚化抑制剂为6，7_ 二甲基-3-[[甲基[2-[甲基[[1-[3-(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃-4-酮)时，所述TNF超家族成员多肽不是TNF- α。优选地，当三聚化抑制剂为如本文所述的为通式I的化合物、通式I的化合物的立体异构体、通式I的化合物的互变异构体或它们的任意比例的的混合物；通式I的化合物的药学可接受的盐、通式I的化合物的药学可接受的溶剂化物、通式I的化合物的药学可接受的多晶型物时，所述TNF超家族成员多肽不是TNF-α。更优选地，当三聚化抑制剂为在F β -链中与所述TNF超家族成员多肽结合时，所述TNF超家族成员多肽不是TNF-α。优选地，所述TNF超家族成员多肽或其片段包括在Fi3-链中的突变，优选在对应于人类RANKL中第279位甘氨酸残基处的突变。在一些实施方式中，该方法为体外方法。
[0007]优选地，提供一种抑制TNF超家族成员多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与T23或T23的功能性衍生物、或6，7_ 二甲基-3-[[甲基[2_[甲基[[1_[3_(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃-4-酮)的功能性衍生物；优选地选自PRA123、PRA224、PRA333、PRA738和PRA828，最优选PRA224相接触。
[0008]优选地， 提供了一种用于抑制TNF-诱导的细胞死亡的方法，所述方法包括使对TNF-诱导的细胞死亡敏感的细胞与T23或T23的功能性衍生物、或6，7-二甲基_3_[[甲基[2_[甲基[[1-[3-(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃-4-酮)的功能性衍生物；优选地选自RA123、PRA224、PRA333、PRA738和PRA828，最优选PRA224相接触。在一些实施方式中，该方法为体外方法。在一些实施方式中，该细胞为非人细胞。
[0009]优选地，提供了一种用于降低TNF-诱导的基质金属蛋白酶释放的方法，所述方法包括使对TNF-诱导的基质金属蛋白酶释放敏感的细胞与T23或T23的功能性衍生物、或6，7-二甲基-3-[[甲基[2-[甲基[[1-[3-(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃-4-酮)的功能性衍生物；优选地选自RA123、PRA224、PRA333、PRA738和PRA828，最优选PRA224相接触。优选地，所述细胞为滑膜成纤维细胞。在一些实施方式中，该方法为体外方法。在一些实施方式中，该细胞为非人细胞。
[0010]本公开的另一方面是提供一种用于在个体中抑制破骨细胞形成或降低骨质流失的方法，所述方法包括将治疗有效量的抑制RANKL三聚化的化合物给药至有需要的个体，抑制RANKL三聚化的所述化合物选自
[0011]a)显性阴性的RANKL多肽或其片段，优选在三聚化结构域中具有显性阴性突变的RANKL多肽或其片段；
[0012]b)在所述多肽的F β -链中与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，优选地，在对应于人类RANKL中第279位甘氨酸残基处与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物。优选地，所述RANKL多肽或其片段包括在F β -链中的突变，优选在对应于人类RANKL中第279位甘氨酸残基处的突变。优选地，所述化合物为Τ23或Τ23的功能性衍生物、或6，7- 二甲基-3_[[甲基[2-[甲基[[1-[3-(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃-4-酮)的功能性衍生物；优选地，选自RA123、PRA224、PRA333、PRA738 和 PRA828，最优选 PRA224。
[0013]本公开的另一方面提供了一种用于预防、治疗或降低个体中病症的方法，所述个体经受以下病症的折磨:骨质疏松症、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、骨转移、青少年骨质疏松症、成骨不全症、高钙血症、甲状旁腺功能亢进症、骨软化、骨钙质缺乏、溶骨性骨病、骨坏死、佩吉特骨病(Paget' s disease ofbone)、由类风湿性关节炎引起的骨质流失、炎性关节炎、骨髓炎、牙周骨质流失、由癌症引起的骨质流失、年龄相关的骨量流失、骨质减少，以及炎症性肠综合症，
[0014]所述方法包括将治疗有效量的抑制RANKL的三聚化的化合物给药至有需要的个体，抑制RANKL的三聚化的所述化合物选自
[0015]a)显性阴性的RANKL多肽或其片段，优选在三聚化结构域中具有显性阴性突变的RANKL多肽或其片段；
[0016]b)在所述多肽的F β -链中与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，优选地，在对应于人类RANKL中第279位甘氨酸残基处与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物。优选地，所述RANKL多肽或其片段包括在F β -链中的突变，优选在对应于人类RANKL中第279位甘氨酸残基处的突变。优选地，所述化合物为Τ23或Τ23的功能性衍生物、或6，7- 二甲基-3_[[甲基[2-[甲基[[1-[3 -(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4Η-1-苯 并呋喃-4-酮)的功能性衍生物；优选地，选自RA123、PRA224、PRA333、PRA738 和 PRA828，最优选 PRA224。
[0017]在上述方法的优选实施方式中，与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物为在图23中所示的化合物、该化合物的立体异构体、该化合物的互变异构体或它们的任意比例的混合物；该化合物的药学可接受的盐、该化合物的药学可接受的溶剂化物、该化合物的药学可接受的多晶型物。优选地，所述化合物为图23 (T23)的化合物I。
[0018]在本发明的优选实施方式中，与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物为通式I的化合物、通式I的化合物的立体异构体、通式I的化合物的互变异构体或它们的任意比例的混合物；通式I的化合物的药学可接受的盐、通式I的化合物的药学可接受的溶剂化物、通式I的化合物的药学可接受的多晶型物；
[0019]
【权利要求】
1.一种用于对TNF超家族成员多肽的三聚化进行抑制的方法，所述方法包括使所述多肽与三聚化抑制剂相接触，所述三聚化抑制剂选自: a)在所述多肽的Fi3-链中与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，优选在对应于人类RANKL中第279位的甘氨酸残基处与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，假设当所述三聚化抑制剂为6，7_ 二甲基-3-[[甲基[2-[甲基[[1-[3-(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃-4-酮)时，所述TNF超家族成员多肽不是TNF-α ;以及 b)显性阴性的TNF超家族成员多肽或其片段，优选在三聚化结构域中具有显性阴性突变的TNF超家族成员多肽或其片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，与所述TNF超家族成员多肽结合的所述化合物选自 PRA224、PRA828、PRA123、PRA333、PRA738 和 T23。
3.一种用于在个体中抑制破骨细胞形成或降低骨质流失的方法，所述方法包括将治疗有效量的抑制RANKL的三聚化的化合物给药至有需要的个体，抑制RANKL的三聚化的所述化合物选自: a)在TNF超家族成员多肽的Fi3-链中与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，优选在对应于人类RANKL中第279位的甘氨酸残基处与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物；以及 b)显性阴性的RANKL多肽或其片段，优选在三聚化结构域中具有显性阴性突变的RANKL多肽或其片段。
4.一种用于预防、治疗或减轻个体中的病症的方法，所述个体经受以下病症的折磨:骨质疏松症、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、骨转移、青少年骨质疏松症、成骨不全症、高钙血症、甲状旁腺功能亢进症、骨软化、骨钙质缺乏、溶骨性骨病、骨坏死、佩吉特骨病、由类风湿性关节炎引起的骨质流失、炎性关节炎、骨髓炎、牙周骨质流失、由癌症引起的骨质流失、年龄相关的骨量流失、骨质减少以及炎性肠综合症； 所述方法包括将治疗有效量的抑制RANKL的三聚化的化合物给药至有需要的个体，抑制RANKL的三聚化的所述化合物选自: a)在TNF超家族成员多肽的Fi3-链中与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物，优选在对应于人类RANKL中第279位的甘氨酸残基处与所述TNF超家族成员多肽结合的化合物；以及 b)显性阴性的RANKL多肽或其片段，优选在三聚化结构域中具有显性阴性突变的RANKL多肽或其片段。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述RANKL多肽或其片段包括在Fβ -链中的突变，优选包括在对应于人类RANKL中第279位的甘氨酸残基处的突变。
6.根据权利要求1、3或4所述的方法，其中，与所述TNF超家族成员多肽结合的所述化合物为:通式I的化合物、通式I的化合物的立体异构体、通式I的化合物的互变异构体或它们的任意比例的混合物；通式I的化合物的药学可接受的盐、通式I的化合物的药学可接受的溶剂化物、通式I的化合物的药学可接受的多晶型物；
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述化合物为6，7_二甲基-3-[[甲基[2-[甲基[[1-[3_(三氟甲基)苯基]-1H-吲哚-3-基]甲基]氨基]乙基]氨基]甲基]-(4H-1-苯并呋喃_4_酮)或其功能性衍生物。
8.根据权利要求1、3或4所述的方法，其中，与所述TNF超家族成员多肽结合的所述化合物为图23中所示的化合物，优选为图23的化合物I。
9.一种选自 PRA224、PRA828、PRA123、PRA333 和 PRA738 的化合物。
10.一种具有通式1的化合物，
11.根据权利要求所述的化合物，其中，所述杂环体系是未经取代的或经选自三氟甲基(CF3)、氟代(F)、硝基(NO2)和氨基(NH2)中的一种或多种基团取代。
12.—种抑制TNF超家族成员的三聚化的TNF超家族成员多肽或其片段，优选地，所述多肽或其片段具有在三聚化结构域中的显性阴性突变。
13.根据权利要求12所述的TNF超家族成员多肽或其功能性片段，包括在Fβ链中的突变，优选包括在对应于人类RANKL中第279位的甘氨酸残基中的突变。
14.根据权利要求13所述的TNF超家族成员多肽或其功能性片段，包括与KLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETS⑶LATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGXFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID(SEQID NO:3)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列，其中X不是甘氨酸。
15.一种经分离的核酸，所述经分离的核酸编码根据权利要求12至14中任一项所述的TNF超家族成员多肽或其片段。
16.一种非人动物，所述非人动物包括编码根据权利要求12至14中任一项所述的TNF超家族成员多肽或其片段的核酸。
17.一种载体，所述载体包括根据权利要求15所述的核酸。
18.一种细胞，所述细胞包括根据权利要求17所述的载体。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求12至14中任一项所述的TNF超家族成员多肽或其片段或根据权利要求9至11中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的载剂。
20.一种脂质体，所述脂质体包括根据权利要求9至11所述的TNF超家族成员多肽或其片段。
【文档编号】C07D295/00GK103930126SQ201280050605
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年8月10日 优先权日:2011年8月12日
【发明者】叶莱妮·陶尼, 佐治尤斯·克利亚斯 申请人:Bsrc亚历山大.弗莱明