结合并阻断髓样细胞表达的触发受体-1(trem-1)的抗体的制作方法

结合并阻断髓样细胞表达的触发受体-1(trem-1)的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及能够特异性结合TREM-1并防止TREM-1活化的抗体，TREM-1为一种在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上表达的蛋白质。所述抗体可用于治疗患有例如类风湿性关节炎和炎性肠病等炎性疾病的个体。
【专利说明】结合并阻断髓样细胞表达的触发受体-1 (TREM-1)的抗体 发明领域
[0001] 本发明涉及鉴定功能性TREM-I抗体的方法。本发明还涉及能够特异性地结合 TREM-I并能够降低或阻断TREM-I活性（信号转导和/或活化）的抗体。此外，本发明涉及 所述抗体的用途，例如治疗和药物用途。
[0002] 发明背景 髓样细胞表达的触发受体-I (TREM-I)是在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表 达的受体。当被激活时，TREM-I与信号转导蛋白质DAP12缔合，并触发促炎细胞因子从表 达它的细胞中释放（Bouchon 等，J. Immunol. 2000; 164(10): 4991-4995)。已知 TREM-I mRNA和蛋白质表达在患有脓毒症、类风湿性关节炎（RA)和炎性肠病（IBD)的个体的髓样 细胞中增量调节。越来越多的科学证据支持TREM-I促成炎性疾病发生和发展的理论，因为 募集到发炎区域的TREM-I阳性单核细胞和嗜中性粒细胞使炎症恶化（Bouchon等，Nature 2001; 410: 1103-1107 ;Schenk 等，Clin Invest. 2007; 117(10): 3097 - 3106) ;Kuai 等，Rheumatology (Oxford). 2009; 48(11): 1352-1358。
[0003] 能够结合TREM-I的抗体是已知的，包括市售的TREM26和TREM37 (目录号分别 为 314902 和 316102, Biolegend，San Diego，CA 92121，USA)、MAB1278 (目录号 MAB1278， R&D Systems，Minneapolis，MN 55413, USA)、mAb 6B1 (目录号 HM2252, Hycult Biotech， Uden，Netherlands)和抗 TREM-1 2E2 (目录号 HPA005563，Sigma-Aldrich，Denmark)。所 有已知的TREM-I抗体在固定时是激动性的；即它们增加细胞因子从单核细胞、巨噬细胞和 嗜中性粒细胞中释放。已知的TREM-I抗体的另一个特性是它们不与来自灵长类动物（例 如食蟹猴（cynomolgus monkey)或恒河猴（rhesus monkey))的TREM-1交叉反应，这意味 着在这些动物中无法测试已知的抗体。
[0004] 因此，本领域需要能够结合和阻断TREM-I的功能的抗体。本领域需要能够防止 TREM-I形成二聚体/多聚体的TREM-I抗体。本领域需要能够阻断TREM-I活化和信号转导 的TREM-I抗体。本领域需要能够干扰TREM-I与其配体间的相互作用的TREM-I抗体。本 领域需要能够阻断细胞因子从髓样细胞中释放的TREM-I抗体。本领域需要在溶解或固定 时几乎没有或没有激动活性的TREM-I抗体。本领域还需要能够结合人TREM-I和来自一个 或多个其它物种（例如灵长类动物）的TREM-I两者的抗体，从而能够在合适的动物模型中 进行毒理学研究以及评价抗体的药代动力学和药效学。
[0005] 本文公开了适宜用作药物的TREM-I抗体。所述抗体可能对患有脓毒症或慢性炎 性疾病（例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和炎性肠病）的个体的生命质量具有重大 影响。
[0006] 概述 本发明涉及鉴定功能性TREM-I抗体的方法，所述方法包括（a)培养表达TREM-1、信号 转导蛋白和报道构建体（reporter construct)的第一细胞；(b)在将第一细胞与TREM-I调 节剂一起温育时测量所述细胞的活性；(c)使（b)的共培养物与TREM-I抗体接触；和（d) 测得第一细胞的活性小于或大于（b)中测量的活性。
[0007] 可调整方法以鉴定阻断性TREM-I分子，例如抗体。鉴定阻断性TREM-I抗体的方 法包括（a)培养表达TREM-I、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与 激活性化合物（例如TREM-I配体）或激活的嗜中性粒细胞一起温育时测量所述细胞的活 性；(c)使第一细胞和激活性化合物（例如TREM-I配体）或激活的嗜中性粒细胞的共培养 物与TREM-I抗体接触；和（d)测得第一细胞的活性小于（b)中测量的活性。
[0008] 可调整方法以鉴定刺激性TREM-I抗体。鉴定刺激性TREM-I抗体的方法包括（a) 培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)测量第一细胞的活性；（c) 使所述细胞与TREM-I抗体接触/温育；和（d)测得第一细胞的活性大于（b)中测量的活 性。
[0009] 第一细胞可为造血起源。（b)的调节剂可为激活的嗜中性粒细胞或TREM-I配体。 信号转导蛋白可为DAP10、DAP12、TCIU、Fe γ RIII和Fc受体或其部分。信号转导蛋白可 通过转录因子例如NFAT或NF κ B传递信号。报道基因可为不在所述第一细胞中天然表达 的基因，并可为编码β_半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白（GFP)或氯霉素转移酶的基 因。本发明还涉及可借助本发明方法鉴定的刺激性TREM-I抗体。
[0010] 本发明涉及能够与TREM-I特异性地结合且能够阻断TREM-I功能的抗体。所述抗 体能够防止或减少TREM-I的二聚化或多聚化。所述抗体能够阻断TREM-I与其配体间的相 互作用，或该抗体能够阻断被TREM-I配体诱导的TREM-I功能。TREM-I可为人TREM-I和/ 或来自另一非人物种的TREM-I，例如来自另一非人灵长类动物的TREM-I。
[0011] 本发明的抗体能够与HiAb 0170竞争结合人TREM-I。本发明的抗体能够特异性地 结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸D38-F48的多肽。本发明的抗体可具有包 含选自 SEQ ID NO: 1 (人 TREM-1)的 038、乂39、1(40、〇41、042、￥43、了44和1^45的1、2、3、 4、5、6、7个或全部氨基酸残基和选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的E46、K47和F48的氨 基酸残基的1、2个或全部氨基酸残基的表位，可采用HX-MS测定。本发明的抗体可具有包 含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D42、E46、D92和H93的1、2、3个或全部氨基酸残基 的表位，可通过测量与TREM-I的变体结合的抗体来测定。
[0012] 本发明的抗体能够与mAb 0170竞争结合食蟹猴TREM-I。本发明的抗体能够特异 性地结合包含食蟹猴TREM-1 (SEQ ID NO: 12)的氨基酸E19-L26或SEQ ID NO: 21的相 应氨基酸的多肽，可米用HX-MS测定。
[0013] 本发明的抗体可用作治疗患有一种或多种自身免疫病和/或慢性炎症的个体的 药物。因此，本发明还涉及治疗患有一种或多种自身免疫病和/或慢性炎症的个体的方法。
[0014] 附图简述 图 I :BWZ. 36/hTREM-l:DAP12: NFAT-LacZ 细胞系（本文亦称为 "BWZ/hTREM-Ι 报道细 胞"）的活化被抗体例如14F128和14F113降低，但不被市售抗体MAB1278 MAB1278 (R&D Systems，Minneapolis，MN 55413, USA :目录号 MAB1278)、抗 TREM-1 HPA (Sigma，USA :目 录号 HPA005563)、aTREM26 (Biolegend，San Diego, CA 92121，USA :目录号 314902)和 aTREM37 (Biolegend，San Diego, CA 92121，USA:目录号 316102)降低。
[0015] 图2 :单独或与TLRL预刺激的嗜中性粒细胞共培养的BWZ/hTREM-1报道细胞。与 未激活的嗜中性粒细胞相比，TLRL激活的嗜中性粒细胞能够诱导信号（发光）增加15倍 (参见最后两栏）。阳性对照（板结合的激动性MAB1278 (R&D Systems，Minneapolis，丽 55413，USA:目录号MAB1278)在该实验中得到32倍诱导（参见第2栏）。以平均值土 SEM (η = 3)对数据绘图。
[0016] 图3 :其中TREM-I被PGN-激活的嗜中性粒细胞刺激的归一化报道分子测定，显 示市售抗体 TREM-26 (目录号 314902, Biolegend，San Diego, CA 92121，USA)、TREM-37 (目录号316102,81〇168611(1，5&11016 8〇，〇六92121，旧六）、嫩81278 (目录号嫩81278，1?&0 Systems，Minneapolis，MN 55413, USA)和抗 TREM-I ΗΡΑ (目录号 HPA005563, Sigma，St Louis，M0，USA)在报道分子测定中是增强TREM-I依赖性发光信号的激动性抗体（给出高于 1的信号）。表明标识为5F27A1和14F69的抗体是最佳阻断剂（给出小于0. 5的信号）。以 平均值土 SEM (η = 3)对数据绘图。同种型对照MAB002 (目录号MAB002，R&D Systems， Minneapolis，MN 55413, USA)。所有抗体均以 1 μ g/ml 使用。
[0017] 图4 :BWZ/hTREM-l报道分子测定中的活性。x轴上，TREM-I阻断性活性以在将0. 2 μ g/ml抗体加入BWZ/hTREM-Ι报道细胞中时所保持的活性表示，所述报道细胞用PGN刺激 的嗜中性粒细胞预激活。当TREM-I抗体是板结合的时，一些（包括所有的市售TREM-I抗 体）能够交叉结合TREM-I从而激活TREM-I。这种活性在y轴上表示。因此与已知抗体相 t匕，在左下角方框中以小圆点表示的抗体全都显示不同的性质，是有利地阻断性的，而不是 激动性的。
[0018] 图5 :人TREM-I抗体与来自恒河猴的PBMC的结合。在左上角，显示大多数抗体只 结合人TREM-I (每个黑色圆点代表一种抗体）。一些抗体，例如mAb 0025和14F128、14F11、 14F29、14F113和14F69,能够与人TREM-I和恒河猴TREM-I两者结合，表明交叉反应性。
[0019] 图6 :抗人TREM-I抗体与来自食蟹猴的PBMC的结合。在左上角，显示了大多数抗 体仅结合人TREM-I (每个黑色圆点代表一种抗体）。一些抗体，例如mAb 0025和14F128、 14F11U4F29,能够结合人和食蟹猴TREM-I两者，表明交叉反应性。一些抗体，例如14F69 (mAb 0044)，能够同样好地结合食蟹猴PBMC (图6B)和人PBMC (图6C)。
[0020] 图 7 :在 mAb 0023 或 mAb 0026 (A)、mAb 0024 或 Biolegend Clone 26 (B)、mAb 0025 (C)或RnD Biosystems的MAB1278 (D)存在或不存在时HX分析的hTREM-1肽的序列 覆盖。在HX分析的肽之上显示一级序列（如水平条形柱所示）。在mAb存在或不存在时都 显示类似交换模式的肽用白色表示，而在mAb结合时显示氘掺入减少的肽使用黑色。用方 框标出的序列区限定表位。
[0021] 图8 :hTREM-l上mAb 0025的表位的结构作图。hTREM-1 (pdb 1Q8M)的结构用二 聚体的一部分作为黑色C-α丝线表示。hTREM-Ι二聚体的另一部分用灰色条带表示，其中 0025表位用黑色表示。
[0022] 图9 :与TREM-I配体复合物共培养的BWZ/hTREM-Ι报道细胞反映了 TREM-I功能 性，其被TREM-I mAb-0170剂量依赖性地抑制。
[0023] 图10 :TNF α从受PGLYRP-I刺激的M2巨噬细胞中的释放被TREM-I抗体阻断。
[0024] 图11 :对人和食蟹猴TREM-I序列进行比对。在两种之间不同的氨基酸残基用粗 体表示。突出显示已表明位于表位内的残基（使用HX-MS和表面等离子共振测定）。
[0025] 序列简述 SEQ ID NO: 1表示野生型（wt)人TREM-I的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID NO: 2表示ml4F69抗体可变重链的氨基酸序列。
[0027] SEQ ID NO: 3表示ml4F69抗体可变轻链的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID NO: 4表示第一人源化TREM-I抗体（mAb 0170)重链的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO: 5表示第一人源化TREM-I抗体（mAB 0170)轻链的氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO: 6表示第二人源化TREM-I抗体（mAb 0122)重链的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO: 7表示第二人源化TREM-I抗体（mAb 0122)轻链的氨基酸序列。
[0032] SEQ ID NO: 8表示ml4F128抗体重链的氨基酸序列。
[0033] SEQ ID NO: 9表示ml4F128抗体轻链的氨基酸序列。
[0034] SEQ ID NO: 10表示ml4F113抗体重链的氨基酸序列。
[0035] SEQ ID NO: 11表示ml4F113抗体轻链的氨基酸序列。
[0036] SEQ ID NO: 12表示在大肠杆菌（凡co/i)中表达时野生型（wt)食蟹猴（c) TREM-I胞外域的氨基酸序列。
[0037] SEQ ID NO: 13 表示 K20A-hTREM-l-Cmyc2-His6 (构建体 0222)的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID NO: 14 表示 A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-l-Cmyc2-His6 (构建体 0244) 的氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 15表示A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-l- Cmyc2-His6 (构建体 0245) 的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 16表示引物的核酸序列。
[0041] SEQ ID NO: 17表示引物的核酸序列。
[0042] SEQ ID NO: 18 表示人（h) TREM-I (1-134)-His6 的氨基酸序列。
[0043] SEQ ID NO: 19 表示 cTREM-l-Cmyc2-His6 (构建体 0238)的氨基酸序列。
[0044] SEQ ID NO: 20 表示 hTREM-l-Cmyc2-His6 (构建体 0247)的氨基酸序列。
[0045] SEQ ID NO: 21表示全长cTREM-Ι的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO: 22表示全长鼠（m) TREM-I的氨基酸序列。
[0047] SEQ ID NO: 23表示全长hPGLYRPl的氨基酸序列。
[0048] 发明描述 TREM-I是由234个氨基酸组成的跨膜蛋白质，包括单一胞外免疫球蛋白结构域和没有 明显的信号转导基序的短胞质尾。当被激活时，TREM-I与含ITAM的信号转导衔接物蛋白 DAP12缔合。下游信号转导可包括NFAT转录因子的活化，引起促炎细胞因子产生增量调节。
[0049] 本发明涉及能够特异性地结合并阻断TREM-I的功能的抗体。本发明的抗体可通 过减少/阻断TREM-I活化和下游信号转导来阻断TREM-I功能。
[0050] 本发明的抗体可通过直接或间接阻断TREM-I的数种不同机制的一种或组合中的 一种，来阻断TREM-1。例如，本发明的抗体可阻止TREM-I的天然配体肽聚糖识别蛋白1 (PGLYRP1)与TREM-I产生功能性复合体，和/或本发明的抗体可通过阻止各个TREM-I分子 形成二聚体或多聚体来阻断TREM-I。能够结合否则将驻留在TREM-I二聚体界面的TREM-I 的一部分，因此防止各个TREM-I分子彼此缔合的TREM-I抗体可减少或阻止TREM-I二聚化 或多聚化。干扰TREM-I与配体相互作用的TREM-I抗体可减少或防止TREM-I二聚化或多 聚化。本发明的抗体可阻断PGLYRP1诱导的TREM-I活化。PGLYRP1，一种高度保守的由信 号肽和肽聚糖结合结构域组成的196个氨基酸长的蛋白质，在嗜中性粒细胞中表达，并在 其活化时释放。本发明的抗体可减量调节促炎细胞因子从髓样细胞中释放。如本文所公开 的，本发明的抗体可阻断TNFa、ΜΙΡ-1 β、MCP-1、IL-1 β、GM. CSF、IL-6和/或IL-8从巨噬 细胞、嗜中性粒细胞、滑膜组织细胞和/或报道细胞中释放。
[0051] 本发明的抗体能够结合人TREM-I和来自另一非人物种的TREM-I两者。本文所用 术语"TREM-1"因此包括可来源于任何合适生物的任何天然存在的形式的TREM-I。例如， 如本文所述使用的TREM-I可为脊椎动物TREM-1，例如哺乳动物TREM-1，例如来自灵长类 动物（例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴）；啮齿动物（例如小鼠或大鼠）、兔类动物（例如 兔）或偶蹄动物（例如牛、绵羊、猪或骆驼）的TREM-I。优选TREM-I是SEQ ID NO: 1 (人 TREM-1)。TREM-I可为成熟形式T的REM-1，例如在合适细胞内进行翻译后加工的TREM-I 蛋白。例如，这种成熟的TREM-I蛋白可被糖基化。TREM-I可为全长TREM-I蛋白。
[0052] 就本发明的抗体直接或间接来源于B淋巴细胞的单个克隆的意义而言，它们可为 单克隆抗体。TREM-I抗体可采用例如实施例所述方法产生、筛选和纯化。简单地说，合适的 小鼠例如TREM-I或TREM-1/TREM-3敲除（KO)小鼠可用TREM-1、表达TREM-I的细胞或两者 的组合免疫。
[0053] 从本发明的单克隆抗体的混合物的意义来说，本发明的抗体可为多克隆。
[0054] 杂交瘤上清液的初步筛选可采用直接ELISA或FMAT进行，二级筛选可采用流式细 胞术进行。然后可在报道基因测定中筛选阳性杂交瘤上清液。
[0055] 抗体可在原核或真核细胞中重组表达。原核细胞可为大肠杆菌。真核细胞可为酵 母、昆虫或哺乳动物细胞，例如来源于是灵长类动物（例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴）、 啮齿动物（例如小鼠或大鼠）、兔类动物（例如兔）或偶蹄动物（例如牛、绵羊、猪或骆驼） 的生物的细胞。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HEK293细胞、CHO细胞和HELA细胞。 TREM-I抗体还可通过本领域技术人员已知的其它方法产生，例如噬菌体展示或酵母展示。
[0056] -旦产生，可采用实施例所述方法，针对与例如全长TREM-I或其突变体的结合筛 选抗体。
[0057] 本发明的一个实施方案是鉴定功能性TREM-I抗体的方法。能够特异性地结合 TREM-I且对TREM-I活化和下游信号转导具有任何作用的抗体在本文称为"功能性TREM-I 抗体"。"功能性" TREM-I抗体在本文是指能够阻断或刺激TREM-I的抗体。鉴定功能性 TREM-I抗体的方法包括（a)培养表达TREM-I、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b) 在将第一细胞与TREM-I调节剂一起温育时测量所述细胞的活性；（c)使（b)的共培养物与 TREM-I抗体接触；和（d)测得第一细胞的活性小于或大于（b)中测量的活性。
[0058] (a)的"第一细胞"可为造血起源的细胞，例如髓样细胞，例如T细胞。（a)的信号 转导蛋白可为能够与TREM-I形成复合体的任何信号转导蛋白。合适的信号转导蛋白包括 DAP10、DAP12、TCR4、Fc YRIII和Fc受体或其部分。（a)的报道构建体可为能够通过信号 转导蛋白被激活并产生可识别信号的任何构建体。合适的报道构建体包含转录因子和报 道基因。信号转导蛋白可通过选自NFAT和NFkB的转录因子传送信号。报道基因是不在 所述第一细胞中天然表达的基因，并且可为编码β -半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白 (GFP)或氯霉素转移酶的基因。所述第一细胞可采用本领域众所周知的方法用转录因子和 报道基因转染。
[0059] 实施例中描述的"BWZ/hTREM-Ι报道细胞"是"第一细胞"的一个实例。
[0060] (b)的调节剂可为TREM-I配体或激活的嗜中性粒细胞。（c)的"TREM-1抗体"可 为TREM-I特异性杂交瘤上清液或纯化的抗体。在（d)中测量的活性是由报道构建体产生 的信号。这种信号转导的实例是由NFAT驱动的LacZ (β-内酰胺酶萤光素酶）产生引起 的发光。
[0061] 可调整方法以鉴定阻断性TREM-I抗体。鉴定阻断性TREM-I抗体的方法包括（a) 培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将所述细胞与激活的嗜 中性粒细胞一起温育时测量第一细胞的活性；（c)使第一细胞和激活的嗜中性粒细胞的共 培养物与TREM-I抗体接触；和（d)测得第一细胞的活性小于（b)中测量的活性。
[0062] 还可调整方法以鉴定刺激性TREM-I抗体。鉴定刺激性TREM-I抗体的方法包括 (a)培养表达TREM-1、信号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)测量第一细胞的活性； (c)使所述细胞与TREM-I抗体接触/温育；和（d)测得第一细胞的活性大于（b)中测量的 活性。
[0063] 本发明涉及可通过本文公开的鉴定阻断抗体的方法鉴定的阻断性TREM-I抗体。 当用上文和实施例中描述的方法测试时，本发明的抗体能够以小于100 Kg/ml的浓度（例 如小于90 Pg/ml、例如小于80 Pg/ml、例如小于70 Pg/ml、例如小于60 Pg/ml、例如小于50 Kg/ml、例如小于40 Pg/ml、例如小于30 Pg/ml、例如小于20 Pg/ml、例如小于10 Pg/ml、例 如小于5 Pg/ml、例如小于I Pg/ml)降低所述第一细胞的活性达50%、例如60%、例如70%、例 如80%、例如90%、例如95%、例如100%。本发明的抗体能够完全消除第一细胞的活性。当用 上文和实施例中描述的方法测试时，本发明的抗体能够以小于I Kg/ml的浓度（例如小于 0.9 Pg/ml、例如小于0.8 Pg/ml、例如小于0.7 Pg/ml、例如小于0.6 Pg/ml、例如小于0.5 Kg/ml、例如小于0. 4 Pg/ml、例如小于0. 3 Pg/ml、例如小于0. 2 Pg/ml)消除第一细胞的活 性。
[0064] 本发明还涉及可通过非本文公开方法的其它方法鉴定的阻断性TREM-I抗体。
[0065] 术语"抗体"在本文是指来源于种系免疫球蛋白序列的蛋白质，其能够与抗原 (TREM-I)或其部分特异性地结合。该术语包括任何类别或同种型（即IgA、IgE、IgG、IgM 和/或IgY)的全长抗体及其任何单链或片段。与抗原或其部分特异性结合的抗体可排他 性地与该抗原或其部分结合，或可与数量有限的同源抗原或其部分结合。全长抗体通常包 含至少4条多肽链：通过二硫键互相连接的2条重（H)链和2条轻（L)链。特殊药用价值 的一个免疫球蛋白亚类是IgG家族。在人中，根据其重链恒定区的序列，可将IgG类别再分 为4个亚类：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。根据其序列组成的差异，可将轻链分成两个类型κ 和λ。IgG分子由2条重链（通过两个或更多个二硫键互连）和2条轻链组成（每条轻链 通过二硫键与重链连接）。重链可包含重链可变区（VH)和至多3个重链恒定（CH)区：CH1、 CH2和CH3。轻链可包含轻链可变区（VL)和轻链恒定区（CL)。可将VH和VL区进一步细 分成超变区，称为互补决定区（CDR)，中间散布有更保守的区，称为构架区（FR)。VH和VL区 通常由3个⑶R和4个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、 FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的超变区形成能够与抗原相互作用的[结合]结构域，同时抗 体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，所述宿主组织或因子包括但不限于 免疫系统的各种细胞（效应细胞）、Fc受体和经典补体系统的第一组分（Clq)。
[0066] 本发明的抗体可以是分离的。术语"分离的抗体"是指与其所产生的环境中的其它 组分分离和/或从中回收和/或从其所产生的环境中存在的组分的混合物中纯化的抗体。
[0067] 抗体的某些抗原结合片段在本发明的情况下可能是合适的，因为已表明抗体的 抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。术语抗体的"抗原结合片段"是指保持与本 文所述抗原（例如TREM-1)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合片 段的实例包括Fab、Fab'、F (ab) 2、F (ab'）2、F (ab)S、Fv (通常抗体单臂的VL和VH结构 域）、单链Fv (scFv;参见例如 Bird 等，Science 1988;242:42S_426;以及 Huston 等， PNAS 1988 ;85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常 VH 和 CHI 结构域）和 dAb (通常 VH 结构 域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单一 VH和单一 VL链的一价分子；微型抗 体（minibody)、双抗体（diabody)、三抗体、四抗体和κ体（kappa bodies)(参见例如 111 等，Protein Eng 1997;10:949-57);骆驼 IgG5IgNAR;以及一种或多种分离的 CDR 或 功能性抗原互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起以形成 功能性抗体片段。抗体片段的各种类型已描述或综述于例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136 ;W02005040219 和已公开的美国专利申请 20050238646 和 20020161201。这些抗体片段可采用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以与完整 抗体相同方式针对效用来筛选片段。
[0068] 本发明的抗体可为人抗体或人源化抗体。本文所用术语"人抗体"意指包括具有 其中至少一部分的构架区和/或至少一部分的CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的可变 区的抗体。（例如，人抗体可具有其中构架区和CDR区两者来源于人种系免疫球蛋白序列的 可变区）。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明 的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如通过体外随机或位 点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。
[0069] 这种人抗体可为人单克隆抗体。这种人单克隆抗体可通过包括获自转基因非人动 物（例如转基因小鼠）的B细胞的杂交瘤产生，所述动物具有包含与永生化细胞融合的人 重链转基因和轻链转基因的基因组。
[0070] 人抗体可自建立在人种系序列选择基础上的序列文库分离，以天然和合成序列多 样性使之进一步多样化。
[0071] 可通过人淋巴细胞的体外免疫，然后将淋巴细胞用埃巴病毒（Epstein-Barr virus)转化来制备人抗体。
[0072] 术语"人抗体衍生物"是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种作用剂或抗 体的缀合物。
[0073] 本文所用术语"人源化抗体"是指含有来源于非人免疫球蛋白的一个或多个序列 (CDR区或其部分）的人/非人嵌合抗体。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白（受体 抗体），其中至少来自受体超变区的残基被来自非人物种（例如来自小鼠、大鼠、兔或非人 灵长类动物）的抗体（供体抗体）超变区（具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能 性）的残基置换。在一些实例中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基置换。这类修 饰的一个实例是引入一个或多个所谓的回复突变（back-mutation)，其通常是来源于供体 抗体的氨基酸残基。抗体的人源化可采用本领域技术人员已知的重组技术进行（参见例如 Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology,第 248 卷，Benny K. C. Lo 主编）。轻链和重链可变结构域两者的合适的人受体构架可通过例如序列或结构同源性鉴 定。或者可根据例如结构、生物物理和生物化学性质的知识使用固定的受体构架。受体构架 可以是种系来源的或来源于成熟抗体序列。来自供体抗体的CDR区可通过CDR移植转移。 可通过鉴定其中来自供体抗体的氨基酸残基的重新引入（回复突变）对人源化抗体的性 质具有有益作用的关键构架位置，针对例如亲和力、功能性和生物物理性质进一步优化CDR 移植的人源化抗体。除供体抗体来源的回复突变以外，可通过在CDR或构架区中引入种系 残基、消除免疫原性表位、位点定向诱变、亲和力成熟等，对人源化抗体进行工程改造。
[0074] 此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰 以进一步精修抗体性能。一般来说，人源化抗体可包含至少一个（通常2个）可变结构域， 其中所有或基本所有的CDR区相当于非人免疫球蛋白的CDR区，且其中所有或基本所有的 FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体还可任选包含至少一部分的免疫球蛋 白恒定区（Fe)(通常人免疫球蛋白的恒定区）。
[0075] 术语"人源化抗体衍生物"是指人源化抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种作 用剂或抗体的缀合物。
[0076] 本文所用术语"嵌合抗体"是指其轻链和重链基因通常通过遗传工程自来源于不 同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体基因的 可变区段可与人恒定区段连接。
[0077] 抗体的片段可结晶区（"Fc区"/Vc结构域"）是包含恒定CH2和CH3结构域的抗 体的N端区。Fe结构域可与称为Fe受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋白质相互 作用。Fe区使得抗体能够与免疫系统相互作用。本发明的一个方面，抗体可被工程改造以 包括Fe区内的修饰，通常改变其功能性质的一个或多个，尤其例如血清半衰期、补体结合、 Fe-受体结合、蛋白质稳定性和/或依赖抗原的细胞毒性或其缺乏。此外，本发明的抗体可 经化学修饰（例如一个或多个化学部分可与抗体连接）或被修饰以改变其糖基化，再次改 变抗体的一个或多个功能性质。IgGl抗体可携带修饰的Fe结构域，其包含一个或多个、或 许所有下列突变：分别将导致对某些Fe受体的亲和力降低（L234A、L235E和G237A)和Clq 介导的补体结合减少（A330S和P331S)(残基编号按照EU指数）。
[0078] 本发明抗体的同种型可为IgG，例如IgGl，例如IgG2,例如IgG4。如有需要，抗体 的类别可通过已知技术"转换"。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可被类别转换成IgG 抗体。类别转换技术还可用来将一种IgG亚类转化成另一种亚类，例如由IgGl转化成IgG2 或IgG4 ;由IgG2转经成IgGl或IgG4 ;或由IgG4转化成IgGl或IgG2。还可通过来源不同 IgG亚类区域的组合，对抗体进行工程改造以产生恒定区嵌合分子。
[0079] 在一个实施方案中，CHl的铰链区被修饰使得铰链区的半胱氨酸残基的数目发生 改变，例如增加或减少。这种方法进一步描述于例如Bodmer等人的美国专利号5, 677, 425。
[0080] 恒定区可被修饰以稳定抗体，例如从而降低二价抗体分离成两个一价VH-VL片段 的风险。例如，在lgG4恒定区中，残基S228 (残基编号按照EU指数）可突变成脯氨酸（P) 残基以稳定铰链处的重链间二硫桥形成（参见例如Angal等，Mol Immunol. 1995; 30: 105-8)。
[0081] 抗体或其片段也可根据其互补决定区（⑶R)定义。当在本文使用时，术语"互补 决定区"或"超变区"是指其中参与抗原结合的氨基酸残基所处的抗体区域。超变区或CDR 可鉴定为在抗体可变结构域的氨基酸比对中具有最高可变性的区域。数据库可用于CDR 鉴定，例如Kabat数据库，例如⑶R定义为包含轻链可变结构域的氨基酸残基24-34 (LI)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)和重链可变结构域的 31-35 (HI)、50-65 (H2)和 95-102 (H3); (Kabat 等（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 公布号 91-3242)。或者 CDR可定义为来 自"超变环"的那些残基（轻链可变结构域的残基26-33 (LI)、50-52 (L2)和91-96 (L3) 和重链可变结构域的 26-32 (HI)、53-55 (H2)和 96-101 (H3);Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917)。通常，该区氨基酸残基的编号通过Kabat等人（同上）描述 的方法进行。短语例如"Kabat位置"、"Kabat残基"和"按照Kabat"在本文是指重链可变 结构域或轻链可变结构域的这种编号系统。采用Kabat编号系统，肽的实际的线性氨基酸 序列可含有较少的或其它的氨基酸，相当于可变结构域的构架（FR)或CDR的缩短或插入。 例如，重链可变结构域可包括⑶R H2残基52后的氨基酸插入（残基52a、52b和52c，按照 Kabat)和重链FR残基82之后插入的残基（例如残基82a、82b和82c等，按照Kabat)。可通 过在抗体序列同源性区域与"标准" Kabat编号序列的比对，来确定指定抗体残基的Kabat 编号。
[0082] 术语"构架区"或"FR"残基是指不在本文定义的⑶R内的VH或VL氨基酸残基。
[0083] ml4F69抗体具有SEQ ID NO: 2所示的可变重链序列和SEQ ID NO: 3所示的可变 轻链序列。本发明的抗体可包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。ml4F69抗体 具有 SEQ ID NO: 2 的氨基酸 31-35、50-68 和 101-110 和 SEQ ID NO: 3 的氨基酸 24-38、 54-60和93-101中所示的⑶R序列。本发明的抗体可包含这些⑶R序列的1、2、3、4、5个或 所有6个。本发明的抗体可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸101-110。
[0084] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸31-35 (TYAMH)的⑶Rl序列， 其中这些氨基酸之一可被不同的氨基酸取代。
[0085] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYADSVKD) 的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
[0086] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 2的氨基酸101-110 (DMGQRRQFAY)的CDR3 序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
[0087] 本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 3的氨基酸24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的 ⑶Rl序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
[0088] 本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 3的氨基酸54-60 (RASNLES)的CDR2序列， 其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
[0089] 本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 3的氨基酸93-101 (QQSNEDPYT)的CDR3 序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
[0090] mAb 0170抗体具有SEQ ID NO: 4所示重链序列和SEQ ID NO: 5所示轻链序列。 本发明的抗体可包含这个重链序列和/或这个轻链序列。mAb 0170抗体具有SEQ ID NO: 4 的氨基酸 31-35、50-68 和 101-110 和 SEQ ID NO: 5 的氨基酸 24-38、54-60 和 93-101 所 示的⑶R序列。本发明的抗体可包含这些⑶R序列的1、2、3、4、5个或所有6个。
[0091] mAb 0122抗体具有SEQ ID NO: 6所示重链序列和SEQ ID NO: 7所示轻链序列。 本发明的抗体可包含这个重链序列和/或这个轻链序列。mAb 0122抗体具有SEQ ID NO: 6 的氨基酸 31-35、50-68 和 101-110 和 SEQ ID NO: 7 的氨基酸 24-38、54-60 和 93-101 所 示的⑶R序列。本发明的抗体可包含这些⑶R序列的1、2、3、4、5个或所有6个。
[0092] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸31-35 (TYAMH) 的CDRHl序列，其中这些氨基酸之一可被不同的氨基酸残基取代。
[0093] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取 代。
[0094] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 4的氨基酸101-110 (DMGIRRQFAY)的 ⑶RH3序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
[0095] 本发明抗体的重链可包含SEQ ID NO: 6的氨基酸101-110 (DMGQRRQFAY)的 ⑶RH3序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
[0096] 本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的⑶RLl序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸取代。
[0097] 本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸54-60 (RASNLES)的CDRL2序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
[0098] 本发明抗体的轻链可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸93-101 (QQSNEDPYT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸的1或2个可被不同的氨基酸取代。
[0099] ml4F128抗体具有SEQ ID NO: 8所示重链和SEQ ID NO: 9所示轻链。本发明的 抗体可包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。ml4F128抗体具有SEQ ID NO: 8 的氨基酸 31-35、50-68 和 101-110 和 SEQ ID NO: 9 的氨基酸 24-38、54-60 和 93-101 所示 ⑶R序列。本发明的抗体可包含这些⑶R序列的1、2、3、4、5个或所有6个。
[0100] ml4F113抗体具有SEQ ID NO: 10所示重链和SEQ ID NO: 11所示轻链。本发明 的抗体可包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。ml4F113抗体具有SEQ ID NO: 10 的氨基酸 31-35、50-68 和 101-110 和 SEQ ID NO: 11 的氨基酸 24-38、54-60 和 93-101 所示的⑶R序列。本发明的抗体可包含这些⑶R序列的1、2、3、4、5个或所有6个。本发明 的抗体可包含SEQ ID NO: 10的氨基酸101-110。
[0101] 术语"抗原"（Ag)是指用于免疫有免疫活性的脊椎动物以产生识别Ag的抗体 (Ab)的分子实体。在本文中，Ag的范围更宽泛，一般意指包括被Ab特异性识别的靶分子， 因此包括用于免疫方法或用于产生Ab的其它方法（例如噬菌体展示）的分子的片段或模 拟物。
[0102] 在"抗原结合多肽"（例如抗体（Ab))与其相应抗原（Ag)间的分子相互作用的情 况下定义本文所用术语"表位"。"表位"一般是指Ab与之特异性地结合的Ag的区域或区，即 与Ab物理接触的区域或区。物理接触可通过Ab和Ag分子中原子的各种标准（例如2-6A、 例如3A、例如4A、例如5A的距离截止值；或溶剂可及性）定义。蛋白质表位可包含直接参与 结合Ab的Ag的氨基酸残基（亦称表位的免疫显性组分）和不直接参与结合的其它氨基酸 残基，例如被Ab有效阻断的Ag的氨基酸残基，即Ab的"溶剂排斥表面（solvent-excluded surface) "和/或"足迹（footprint) "内的氨基酸残基。
[0103] 本文的术语表位包括与TREM-I抗体特异性地结合的TREM-I的任何特定区的两种 类型的结合区。TREM-I可包含许多不同的表位，它可包括而不限于构象表位（由彼此接近 位于成熟TREM-I构象的一个或多个非连续氨基酸组成）和翻译后表位（其全部或部分由 与TREM-I共价连接的分子结构例如糖基组成）。
[0104] 可采用各种实验和计算表位作图方法，以不同的细节层次描述和表征给定抗体 (Ab)/抗原（Ag)对的表位。实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振（NMR)波谱学、氢 氣交换质谱法（Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry，HX-MS)和各种竞争结 合方法、本领域已知的方法。由于每种方法依赖于独特的原理，因此表位的描述与测定表位 的方法密切相关。因此，根据所采用的表位作图方法，可对给定Ab/Ag对的表位进行不同的 描述。
[0105] 在其最详细的层次上，可通过界定存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间座 标以及有关它们对结合热力学的相对贡献的信息，来描述Ag和Ab之间相互作用的表位。在 不太详细的层次上，表位可通过界定Ag和Ab之间原子接触的空间座标来表征。在甚至更 不详细的层次上，表位可通过它包括的如通过特定标准界定的氨基酸残基来表征，所述标 准例如Ab:Ag复合物中原子的距离或溶剂可及性。在更少细节的层次上，表位可通过功能 (例如通过与其它Ab的竞争结合）来表征。表位还可以更普通地定义为包含其被另一个氨 基酸取代时将改变Ab和Ag间相互作用特性的氨基酸残基。
[0106] 在通过Ab (例如Fab片段）和其Ag间的复合物的空间座标界定的来源于X射线 的晶体结构的情况下，除非另有说明或与上下文抵触，否则术语表位在本文明确定义为其 特征在于距Ab重原子的距离例如4A内具有重原子（即非氢原子）的TREM-I残基。
[0107] 根据在不同细节层次上获得的表位的描述和定义（取决于所采用的表位作图方 法）的事实，因此断定在相同Ag上不同Ab的表位的比较可在不同的细节层次上类似地进 行。
[0108] 如果表位含有相同的一组氨基酸残基，则氨基酸水平上描述的表位（例如通过X 射线结构测定）被称为相同的。如果至少一个氨基酸被表位共有，则表位被称为重叠。如 果无氨基酸残基被表位共有，则表位被称为单独的（独特的）。
[0109] 还可通过将抗体对野生型人TREM-I的结合动力学与抗体对在预计表位上具有丙 氨酸突变的人TREM-I变体的结合动力学进行比较，来间接定义表位。抗体对其中氨基酸残 基被丙氨酸残基置换的人TREM-I的变体的亲和力降低或结合消除表明突变的氨基酸有助 于所述抗体和野生型人TREM-I间的相互作用。该方法提供负的表位鉴定。由于蛋白质错折 叠或解折叠会给出与相互作用消除类似的结果的事实，有损该方法界定表位的有效性。如 果交叉反应性抗体存在，则通过直系同源靶蛋白（例如食蟹猴TREM-1)的功能突变分析的 比较获益来补充分析。比较将界定不与例如食蟹猴TREM-I交叉反应的抗体和交叉反应性 抗体间的表位差异。
[0110] 还可通过测量抗体（或抗体片段）与野生型抗原（TREM-I)的变体的结合，提供表 位的间接鉴定。如果抗体或其片段结合例如人但非食蟹猴TREM-1，且如果所述抗体或其片 段能够结合食蟹猴TREM-I的部分人源化变体，则这种重新获得的结合表明被取代的氨基 酸残基对抗体与抗原的相互作用是重要的。同样地，与人TREM-I相比与食蟹猴TREM-I具 有较弱结合的抗人TREM-I抗体（或其Fab片段）对食蟹猴TREM-I的人源化变体的亲和力 增加，可提供有关组成结合表位的残基特征的信息。
[0111] 相同突变对任何给定交叉反应性抗体的作用使得可能区分可能的蛋白质错折叠 (与两种抗体的结合消除）和人TREM-I中相互作用丧失（与抗体之一结合，与另一种抗体 的结合消除），同时明确提供有关不交叉反应的抗体和交叉反应性抗体间在氨基酸水平上 的表位差异的信息。
[0112] 本发明的抗体能够结合人TREM-I的变体。本发明的抗体能够结合 K20A-hTREM-l-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13)，采用例如表面等离子共振测定。
[0113] 本发明的抗体能够结合食蟹猴TREM-I的变体。本发明的抗体能够结合A24T/ Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-l-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14)，采用例如表面等离子共振 测定。本发明的抗体能够结合 A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-l-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15)，采用例如表面等离子共振测定。
[0114] 本发明的抗体能够特异性地结合TREM-1，其中所述抗体能够特异性地结合人 TREM-I的（i)选自以下的至少一个氨基酸残基：八21、了22、1(23、1^4、了25326，和（^)选自 以下的至少一个氨基酸残基：A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、157、158、R59、D60、 G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、 P79、V80、Q81、V82、G83、R84、185 ;和（iii)选自以下的至少一个氨基酸残基：C113、V114、 1115、Y116、Q117、P118 和 P119。
[0115] 本发明的抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸 D38-F48的多肽，采用例如HX-MS测定。
[0116] 本发明的抗体可具有包含以下的表位：SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸残基 D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44 和 L45 的 1、2、3、4、5、6、7 个或全部和选自 SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的E46、K47和F48的氨基酸残基的1、2个或全部，采用例如HX-MS测定。
[0117] 本发明的抗体可具有包含以下的表位：选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的D42、 E46、D92和H93的氨基酸残基的1、2、3个或全部，使用TREM-I的变体和表面等离子共振测 定。
[0118] 本发明的抗体可具有至少包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸残基E46和 /或D92的表位，使用TREM-I的变体和表面等离子共振测定。
[0119] 本发明的抗体还包含选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的L31、I86和VlOl的氨基 酸残基的1、2个或全部。
[0120] 本发明的抗体能够特异性地结合包含食蟹猴TREM-1 (SEQ ID NO: 12)的氨基酸 残基E19-L26或SEQ ID NO: 21的相应氨基酸的多肽，采用例如HX-MS测定。
[0121] 本发明的抗体能够特异性地结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含选自SEQ ID NO: 1 的 V39、K40、C41、D42、Y43、L45、E46、K47、F48 和 A49 的氨基酸残基的 1、2、3、4、5、6、 7、8、9个或全部。
[0122] 本发明的抗体能够特异性地结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含SEQ ID NO: 1的D42。本发明的抗体能够特异性地结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含SEQ ID NO: 1的E46。所述抗体的表位可包含SEQ ID NO: 1的￥39工41、042、￥43丄45。所述抗体的表 位可包含SEQ ID NO: 1的E46、K47和A49。所述抗体的表位还包含SEQ ID NO: 1的F48。
[0123] 术语"抗原互补位"的定义通过将含义反转而来源于"表位"的上述定义。因此，术 语"抗原互补位"是指Ag与之特异性结合的Ab上的区域或区，即Ab以此与Ag物理接触。
[0124] 在来源于X射线的晶体结构的情况下，由Ab (例如Fab片段）与其Ag之间的复 合物的空间座标界定，除非另有说明或与上下文抵触，否则术语抗原互补位在本文明确定 义为特征在于在距TREM-I中重原子4A距离内具有重原子（即非氢原子）的Ag残基。
[0125] 指定抗体（Ab)/抗原（Ag)对的表位和抗原互补位可通过常规方法鉴定。例如，可 通过评价抗体结合不同的片段或变体TREM-I多肽的能力，来确定表位的总体位置。还可采 用常规方法，确定TREM-I内与抗体接触的特定氨基酸（表位）和抗体中与TREM-I接触的 特定氨基酸（抗原互补位）。例如，可将抗体和靶分子混合，并且可使Ab:Ag复合物结晶。 可测定复合物的晶体结构，并用来鉴定抗体与其靶之间相互作用的特定部位。
[0126] 根据抗体同时与其共同抗原结合的能力，来表征与相同抗原结合的抗体，并可对 抗体进行"竞争结合"/ "框并（binning)"。在本文的情况下，术语"框并"是指将与相同抗 原结合的抗体归类的方法。抗体的"框并"可在基于标准技术的测定法（例如表面等离子 共振（SPR)、ELISA或流式细胞术）中以两种抗体与其共同抗原的竞争结合为基础。
[0127] 抗体的"框（bin)"使用参比抗体定义。如果第二抗体不能够在与参比抗体相同的 时间内与抗原结合，则第二抗体被称为属于与参比抗体相同的"框"。在这种情况下，参比抗 体和第二抗体竞争性地结合抗原的相同部分，并被称作"竞争性抗体"。如果第二抗体能够 在与参比抗体相同的时间内与抗原结合，则第二抗体被称为属于单独的"框"。在这种情况 下，参比和第二抗体不竞争性地结合抗原的相同部分，并被称为"非竞争性抗体"。
[0128] 抗体"框并"不提供有关表位的直接信息。竞争性抗体，即属于相同"框"的抗体 可具有相同的表位、重叠表位或甚至单独的表位。后者是如果与其抗原表位结合的参比抗 体占据了第二抗体接触其抗原表位所需空间（"位阻"）的情况。非竞争性抗体一般具有单 独的表位。
[0129] 本发明的抗体可与mAb 0170竞争与人TREM-I结合。本发明的抗体可与mAb 0170 竞争与食蟹猴TREM-I结合。换句话说，本发明的抗体可属于与mAb 0170相同的"框"。
[0130] 术语"结合亲和力"在本文是指两种分子（例如抗体或其片段和抗原）间非共价 相互作用的强度的度量。术语"结合亲和力"用来描述一价相互作用（内在活性）。
[0131] 可通过测定平衡解离常数（Kd)，定量测定通过一价相互作用的两种分子（例如抗 体或其片段和抗原）间的结合亲和力。接着可通过测量复合物形成和解离的动力学，例如 通过SPR方法，测定K D。相当于一价复合物缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数 ka (或km)和解离速率常数kd (或kj。Kd通过方程式Kd = kd /ka与ka和kd相关。
[0132] 根据上述定义，可通过各个抗体/抗原复合物的Kd值的比较，来比较与不同分子 相互作用有关的结合亲和力，例如不同抗体对给定抗原的结合亲和力的比较。
[0133] 本发明的抗体可以I X KT7M或更小、I X KT8M或更小、或I X KT9M或更小、或1 X KT10M或更小、I X KT11M或更小、I X KT12M或更小或I X KT13M或更小的亲和力（KD)结 合人TREM-1，采用表面等离子共振测定。本发明的抗体可以I X KT7M或更小、I X KT8的 M或更小、或I X KT9M或更小、或I X KTkiM或更小、I X KT11M或更小、I X KT12M或更小 或I X KT13M或更小的亲和力（KD)结合食蟹猴TREM-1，采用表面等离子共振测定。
[0134] 术语"结合特异性"在本文是指分子（例如抗体或其片段）与单种唯一的抗原或与 有限数目的高度同源的抗原（或表位）的相互作用。相比之下，能够特异性地结合TREM-I 的抗体不能够结合不相似的分子。本发明的抗体不能够结合Nkp44。
[0135] 可通过众所周知的方法，直接测定相互作用的特异性和平衡结合常数的值。评价 配体（例如抗体）结合其靶的能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质 印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力还可通过本领域已知的标 准测定法（例如SPR)来评价。
[0136] 可进行竞争结合测定法，其中将抗体与靶的结合与所述靶被该靶的另一配体（例 如另一种抗体）的结合相比较。
[0137] 另一方面，本发明提供包含本发明的分子（例如本文所述TREM-I抗体、多核苷酸、 载体和细胞）的组合物和制剂。例如，本发明提供包含与药学上可接受的载体配制在一起 的本发明的一种或多种TREM-I抗体的药物组合物。
[0138] 因此，本发明的一个目的是提供包含所述TREM-I抗体的药物制剂，所述抗体以 0.25 mg/ml-250 mg/ml的浓度、例如10-200 mg/ml的浓度存在，且其中所述制剂的pH为 2. 0-10. 0,例如pH为4. 0-8. 0。制剂还包含缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和 /或表面活性剂的一种或多种及其各种组合。药物组合物中防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定 剂和表面活性剂的用途为本领域技术人员所熟知。可参照Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。
[0139] 在一个实施方案中，药物制剂为含水制剂。这类制剂通常为溶液剂或混悬剂，但也 可包括胶体、分散剂、乳剂和多相材料。术语"含水制剂"定义为制剂包含至少50% w/w水。 同样，术语"含水溶液剂"定义为包含至少50 % w/w水的溶液剂，术语"含水混悬剂"定义 为包含至少50 % w/w水的混悬剂。
[0140] 在另一个实施方案中，药物制剂是冻干制剂，医师或患者在用前向其中加入溶剂 和/或稀释剂。
[0141] 又一方面，药物制剂包含所述抗体的水溶液剂和缓冲剂，其中抗体以I mg/ml或以 上的浓度存在，且其中所述制剂的pH为约2. 0-约10. 0。
[0142] 本发明的TREM-I抗体和包含所述抗体的药物组合物可用于治疗例如下列炎性疾 病：炎性肠病（IBD)、克罗恩病（CD)、溃疡性结肠炎（UC)、肠易激综合征、类风湿性关节炎 (RA)、银屑病、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮（SLE)、狼疮肾炎、I型糖尿病、格雷夫斯病 (Grave' s disease)、多发性硬化（MS)、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠状动脉疾病、慢性阻 塞性肺病、间质性肺病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、全身性硬皮病、骨关节炎、特应性皮 炎、白癜风、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征（Sjogrens' s syndrome)、自身免疫性肾炎、 古德帕斯彻综合征（Goodpasture's syndrome)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、变态反应、 哮喘和是急性或慢性炎症的结果的其它自身免疫病。
[0143] 本发明的TREM-I抗体可适用于治疗患有炎性肠病的个体。炎性肠病（IBD)是可 影响从口到肛门的胃肠道的任何部分的疾病，其引起各种不同症状。IBD主要引起腹痛、腹 泻（其可以是带血的）、呕吐或体重减轻，但还可引起胃肠道以外的并发症，例如皮疹、关节 炎、眼炎、疲劳和注意力缺乏。可将IBD患者分成两个主要类别，患溃疡性结肠炎（UC)的一 类和患克罗恩病（CD)的一类。CD-般涉及回肠和结肠，它可影响肠的任何区域，但通常是 不连续的（疾病病灶区散布在整个肠中）。UC总是涉及直肠（结肠的），并且是更连续性 的。CD中，炎症是透壁的，导致脓肿、瘘和狭窄，而在UC中，炎症通常局限于粘膜。对于克罗 恩病没有已知的药物或手术治愈，而一些UC患者可通过手术切除结肠治愈。治疗选择限于 控制症状，保持缓解和防止复发。可以CD的克罗恩病活性指数（CDAI)评分的降低来测量临 床上炎性肠病的功效，该评分是基于实验室检验和生命质量问卷的得分量表。在动物模型 中，功效通常通过体重增加以及疾病活性指数（DAI)来衡量，所述疾病活性指数是粪稠度、 粪的重量和粪中的血液的组合。
[0144] 本发明的TREM-I抗体可适用于治疗患有类风湿性关节炎的个体。类风湿性关节 炎（RA)是影响几乎整个身体（如果不是全身的话）的全身性疾病，并且是关节炎最常见的 形式之一。其特征在于关节炎症，它引起疼痛、僵硬、发热、发红和肿胀。这种炎症是炎性细 胞侵入关节的结果，并且这些炎性细胞释放可消化骨和软骨的酶。因此，这种炎症可导致除 其它生理作用以外的严重的骨和软骨损害及关节退化和严重疼痛。受累关节可能失去其形 状和排列，导致疼痛和运动丧失。
[0145] 有若干本领域已知的类风湿性关节炎动物模型。例如，在胶原诱发性关节炎（CIA) 模型中，小鼠出现类似于人类风湿性关节炎的炎性关节炎。由于CIA与RA共有类似的免疫 学和病理学特征，因此这使之成为筛选潜在人抗炎化合物的合适模型。在该模型中的功效 通过关节肿胀减轻来衡量。临床上，在RA中的功效通过减轻患者症状的能力来衡量，所述 症状作为关节肿胀、红细胞沉降率、C-反应性蛋白质水平和血清因子（例如抗瓜氨酸化蛋 白抗体）水平的组合来衡量。
[0146] 本发明的TREM-I抗体可适用于治疗患有银屑病的个体。银屑病是T细胞介导的 炎性皮肤病症，它可引起相当的不适。它是一种目前尚无法治愈并且累及所有年龄的人的 疾病。虽然患有轻度银屑病的个体常常可用局部药剂控制他们的疾病，但是全世界超过 100万患者需要紫外光治疗或全身免疫抑制疗法。遗憾的是，紫外线幅射的不便和风险及 许多疗法的毒性限制其长期使用。此外，患者常常具有银屑病复发，并且在一些情况下在停 止免疫抑制疗法后不久便反弹。最新开发的基于CD4+ T细胞转移的银屑病模型模拟人银 屑病的许多方面，因此可用于鉴定适用于银屑病治疗的化合物（Davenport等，Internat. Immunopharmacol 2:653-672，2002)。使用评分系统，通过皮肤病理的减轻来衡量在该模 型中的功效。同样，在患者中的功效通过皮肤病理减轻来衡量。
[0147] 本发明的TREM-I抗体可适用于治疗银屑病性关节炎的个体。银屑病性关节炎 (PA)是一种发生在患有银屑病的患者的子集中的炎症性关节炎类型。在这些患者中，皮肤 病理/症状伴发类似于类风湿性关节炎中所见的关节肿胀。它的特征在于皮肤炎症的斑 块状凸起的红色区域并带有鳞屑。银屑病通常累及肘和膝尖端、头皮、脐和生殖区或肛门四 周。大约10%患有银屑病的患者还发生其关节的相关炎症。
[0148] 本文所用术语"治疗"是指有需要的任何人或其它动物受试者的医学治疗。预期 所述受试者已经历由医师或兽医医师进行的身体检查，医师已做出试验性或确定性诊断， 该诊断可表明使用所述治疗有益于所述人类或其它动物受试者的健康。所述治疗的时机和 目的可依据许多因素（例如受试者的健康现状）而在个体间不同。因此，所述治疗可以是 预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的。
[0149] 就本发明而言，预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的治疗可代表本发明 的各个方面。
[0150] 可经胃肠外（例如静脉内，例如肌内，例如皮下）给予本发明的抗体。或者，可通 过非胃肠外途径（例如经口或局部）给予本发明的抗体。可预防性给予本发明的抗体。可 治疗性给予（在要求时）本发明的抗体。
[0151] 示例性的实施方案 1. 一种鉴定功能性TREM-I抗体的方法，所述方法包括（a)培养表达TREM-I、信号转导 蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与TREM-I调节剂一起温育时测量所述细 胞的活性；（c)使（b)的培养物与TREM-I抗体接触；和（d)测得第一细胞的活性小于或大 于（b)中测量的活性。
[0152] 2. -种鉴定阻断性TREM-I抗体的方法，所述方法包括（a)培养表达TREM-Mf 号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)在将第一细胞与激活的嗜中性粒细胞一起温育 时测量第一细胞的活性；（c)使第一细胞和激活的嗜中性粒细胞的培养物与TREM-I抗体接 触；和⑷测得第一细胞的活性小于（b)中测量的活性。
[0153] 3.实施方案1-2中任一个的方法，其中（b)的调节剂是激活的嗜中性粒细胞或 TRHM-I 配体。
[0154] 4. -种鉴定刺激性TREM-I抗体的方法，所述方法包括（a)培养表达TREM-Mf 号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；(b)测量第一细胞的活性；（c)使所述细胞与TREM-I 抗体接触/温育；和（d)测得第一细胞的活性大于（b)中测量的活性。
[0155] 5.实施方案1-4中任一个的方法，其中第一细胞是造血起源的。
[0156] 6.实施方案5的方法，其中所述造血起源的细胞是髓样细胞。
[0157] 7.实施方案5的方法，其中所述造血起源的细胞是T细胞。
[0158] 8.实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是DAP10。
[0159] 9.实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是DAP12。
[0160] 10.实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是TCIU。
[0161] 11.实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是Fe Y RIII。
[0162] 12.实施方案1-7中任一个的方法，其中所述信号转导蛋白是Fc受体。
[0163] 13.实施方案1-6中任一个的方法，其中所述报道构建体包含转录因子和报道基 因。
[0164] 14.实施方案13的方法，其中所述转录因子是NFAT。
[0165] 15.实施方案14的方法，其中所述转录因子是NFkB。
[0166] 16.实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因编码β-半乳糖苷酶。
[0167] 17.实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因编码萤光素酶。
[0168] 18.实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因编码绿色荧光蛋白 (GFP)。
[0169] 19.实施方案13-15中任一个的方法，其中所述报道基因是编码氯霉素转移酶的 基因。
[0170] 20. -种鉴定阻断性TREM-I抗体的方法，所述方法包括（a)培养表达TREM-I、 DAP12和编码萤光素酶的基因的T细胞；(b)在将所述T-细胞与激活的嗜中性粒细胞一起 时温育测量T细胞的发光；（c)使（b)的共培养物与TREM-I抗体接触；和（d)测得T细胞 的发光小于（b)中测量的活性。
[0171] 21.实施方案7的方法，其中所述细胞是BWZ. 36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ T细 胞系。
[0172] 22.通过实施方案1-3和5-21中任一个的方法鉴定的抗体。
[0173] 23. -种能够特异性地结合TREM-I并能够阻断TREM-I功能的抗体。
[0174] 24.实施方案22-23中任一个的抗体，其中所述抗体能够防止或减少TREM-I的二 聚化/多聚化。
[0175] 25.实施方案22-24中任一个的抗体，其中所述抗体能够阻断TREM-I与其配体间 的相互作用。
[0176] 26.实施方案22-25中任一个的抗体，其中所述抗体能够阻断PGLYRP1诱导的 TREM-I 功能。
[0177] 27.实施方案22-26中任一个的抗体，其中所述TREM-I是人TREM-I。
[0178] 28.实施方案27的抗体，其中所述抗体还能够特异性地结合并阻断来自另一非 人物种的TREM-I的功能。
[0179] 29.实施方案28的抗体，其中所述来自另一物种的TREM-I是食蟹猴TREM-I。
[0180] 30.实施方案28的抗体，其中所述来自另一物种的TREM-I是恒河猴TREM-I。
[0181] 31.实施方案22-30中任一个的抗体，其能够特异性地结合 K20A-hTREM-l-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 13)〇
[0182] 32.实施方案22-31中任一个的抗体，其能够特异性地结合A24T/Y28F/N30S/ R32Q/P70H-cTREM-l-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 14)〇
[0183] 33.实施方案22-32中任一个的抗体，其能够特异性地结合A24T/Y28F/N30S/ R32Q/E54K-cTREM-l-Cmyc2-His6 (SEQ ID NO: 15) 〇
[0184] 34.实施方案22-33中任一个的抗体，其与mAb 0170竞争以结合人TREM-I。
[0185] 35.实施方案22-34中任一个的抗体，其与mAb 0170竞争以结合食蟹猴TREM-I。
[0186] 36.实施方案22-35中任一个的抗体，其能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸D38-F48的多肽，采用例如HX-MS测定。
[0187] 37.实施方案22-36中任一个的抗体，其具有包含选自SEQ ID NO: 1 (人 TREM-1)的 D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44 和 L45 的 1、2、3、4、5、6、7 个或全部氨基酸残 基和选自SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的E46、K47和F48的1、2个或全部氨基酸残基的表 位，采用例如HX-MS测定。
[0188] 38.实施方案22-37中任一个的抗体，其能够特异性地结合包含食蟹猴TREM-I的 氨基酸残基E38-L45的多肽，采用例如HX-MS测定。
[0189] 39.实施方案22-38中任一个的抗体，其具有至少包含选自SEQ ID NO: 1 (人 TREM-1)的D42、E46、D92和H93的氨基酸残基的表位，采用表面等离子共振测定。
[0190] 40.实施方案22-39中任一个的抗体，其具有至少包含SEQ ID NO: 1 (人 TREM-1)的氨基酸残基E46和/或D92的表位，采用表面等离子共振测定。
[0191] 41.实施方案22-40中任一个的抗体，其中所述抗体能够特异性地结合人TREM-I 的（丨）选自以下的至少一个氨基酸残基421、了22、1(23、1^24、了25326;和（^)选自以下的 至少一个氨基酸残基：A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、 M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、 Q81、V82、G83、R84、I85 ;和（iii)选自以下的至少一个氨基酸残基：C113、V114、I115、Y116、 Q117、P118 和 P119。
[0192] 42.实施方案22-40中任一个的抗体，其中所述抗体能够特异性地结合⑴选自 以下的至少一个氨基酸残基：V39、K40、C41、D42、Y43、T44、L45、E46、K47、F48、A49、S50、 S51、Q52、K53、A54、W55、Q56 ;和（ii)选自以下的至少一个氨基酸残基：T70、E71、R72、P73、 S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、185 ;和（iii)选自以下的至少一个 氨基酸残基：C113、V114、I115、Y116、Q117、P118、P119。
[0193] 43.实施方案22-42中任一个的抗体，其重链包含相当于SEQ ID NO: 4的氨基酸 残基101-110 (DMGIRRQFAY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的1、2或3个可被不同的 氨基酸取代。
[0194] 44.实施方案22-42中任一个的抗体，其重链包含相当于SEQ ID NO: 6的氨基酸 残基101-110 (DMGQRRQFAY)的⑶RH3序列，其中1、2或3个氨基酸残基可被不同的氨基酸 取代。
[0195] 45.实施方案43-44中任一个的抗体，其还包含相当于SEQ ID NO: 4或SEQ IDN0: 6的氨基酸残基31-35 (TYAMH)的⑶RHl序列，其中这些氨基酸残基之一可被 不同的氨基酸残基取代；和/或相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列，其中所述氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残 基取代。
[0196] 46.实施方案43-45中任一个的抗体，其轻链包含：相当于SEQ ID NO: 5或SEQ IDN0: 7的氨基酸残基24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的CDRLl序列，其中这些氨基酸的1、2 或3个残基可被不同的氨基酸取代；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基 酸残基54-60 (RASNLES)的⑶RL2序列，其中这些氨基酸的1或2个残基可被不同的氨基 酸取代；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基93-101 (QQSNEDPYT) 的CDRL3序列，其中这些氨基酸的1或2个残基可被不同的氨基酸取代。
[0197] 47.实施方案43-46中任一个的抗体，其包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6和 / 或 SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7。
[0198] 48.实施方案22-47中任一个的抗体，其以I X KT7M或更小、I X KT8M或更小、或 I X KT9M或更小、或I X 10_1QM或更小、I X KT11M或更小、I X KT12M或更小或I X KT13M 或更小的结合亲和力（KD)结合人TREM-1，采用表面等离子共振测定。
[0199] 49.实施方案48的抗体，其中所述结合亲和力（KD)为I X KTkiM或更小。
[0200] 50.实施方案22-49中任一个的抗体，其以I X KT7M或更小、I X KT8M或更小、或 I X KT9M或更小、或I X 10_1QM或更小、I X KT11M或更小、I X KT12M或更小或I X KT13M 或更小的结合亲和力（KD)结合食蟹猴TREM-1，采用表面等离子共振测定。
[0201] 51.实施方案50的抗体，其中所述结合亲和力为I X KT9M或更小。
[0202] 52.实施方案22-51中任一个的抗体，其是IgG。
[0203] 53.用作药物的实施方案22-52中任一个的抗体。
[0204] 54.用于治疗自身免疫病和/或慢性炎症的实施方案22-53中任一个的抗体。
[0205] 55.用于制备治疗自身免疫病和/或慢性炎症的药物的实施方案22-52中任一个 的抗体。
[0206] 56. -种治疗自身免疫病和/或慢性炎症的方法，所述方法包括将实施方案 22-52中任一个的抗体给予有需要的受试者。
[0207] 57.实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病 是类风湿性关节炎。
[0208] 58.实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病 是克罗恩病。
[0209] 59.实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病 是溃疡性结肠炎。
[0210] 60.实施方案53-55中任一个的用途或实施方案56的方法，其中所述自身免疫病 是银屑病性关节炎。
[0211] 通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。本说明 书全文中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开的专利申请的内容均通过引用明 确结合到本文中。 实施例
[0212] 实施例I :BWZ. 36人TREM-I :DAP12稳定细胞系的产生 BWZ. 36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ 细胞系（本文亦称为 "BWZ/hTREM-Ι 报道细 胞"）来源于BW5147 T细胞（小鼠 Ofes 胸腺淋巴瘤细胞系，ATCC TIB-47， LGC Standards，Middelsex，UK)，并含有受4拷贝NFAT启动子元件调节的LacZ报道构 建体（参见 Karttunen, J.和 Shastri, N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 3972-3976及Fiering，S·，Northrop, J. P·，Nolan, G. P·，Matilla，P·，Crabtree, G. R.和 Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4，1823-1834)。使用 Superfect 转 染试剂（目录号 301305，Qiagen Nordic，Denmark)，将使用 TREM-1 cDNA (Gene Bank Ref. ID: ΝΜ_018643· 2，Sino Biological Inc.，Beijing, China)作为模板和寡聚 5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEQ ID NO: 16)和5' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAG GGTAC (SEQ ID NO: 17)作为引物克隆至pIREShyg载体GenBank登录号U89672 (目录号 6061-l，Clontech Laboratories，CA，USA)的 TREM/DAP12/pMX-IRES 载体（自 SmaI 位点至 BamHI 位点编码 786 bp TREM-1)转染到 PLAT-E 包装细胞系（由 W. Yokoyama, Washington University 提供；或者，目录号 RV-101,RV-101，Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa，Finland)。如下使用含有TREM/DAP12/pMX-IRES病毒颗粒的PLAT-E上清液来感 染BWZ. 36细胞：将2xl05个BWZ. 36细胞在6孔板中培养，更换培养基为I. 5 ml含有病毒 颗粒+ 8 mg/ml聚凝胺（polybrene)的上清液。6-8小时后，将I. 5 ml正常培养基加到板 中，使细胞再温育24小时。将稳定表达TREM-I的BWZ. 36细胞系用抗TREM-I单克隆抗体 (克隆21C7)染色，并通过细胞分选来分离。
[0213] 实施例2 :BWZ. 36人TREM-1 :DAP12稳定细胞系的培养 将 BWZ/hTREM-Ι 报道细胞在补充了 10% FCS (目录号 16140-071，Gibco, New York， 旧八)、1%青霉素/链霉素（目录号15070-06,6让(：〇)、11111丙酮酸钠（目录号11360,6让(3〇)、 5 μΜ -2ME (目录号 31350-010, Gibco)和 2 mM L-谷氨酰胺（目录号 25030, Gibco)的 无酚红RPMI 1640 (目录号11835, Gibco, Carlsbad CA, USA)中培养。不需要特殊的板或 包被。加入10 ml Versene (目录号15040, Gibco)以剥离细胞，然后将细胞转移到管中， 1200 rpm离心5分钟，并在新的无酚红RPMI 1640中洗涤。然后这些细胞准备就绪用于测 定或再培养以进一步增殖。
[0214] 实施例3 :小鼠的免疫和mAb的鉴定 为了产生结合人TREM-I的抗体，用人（h) TREM-1 (SEQ ID N0:1)、表达hTREM-Ι的细 胞（BWZ. 36细胞）或两者的组合给野生型Balb/C小鼠和TREM-I敲除（KO)小鼠（C57BL/6 背景）两者进行免疫。使用表达hTREM-Ι的BWZ. 36细胞，通过对hTREM-Ι蛋白的直接ELISA 或通过FMT进行初步筛选。通过对表达hTREM-Ι的HEK293细胞的流式细胞术进行二级筛 选。然后以实施例4所述BWZ/hTREM-Ι报道分子测定法，筛选阳性杂交瘤上清液。
[0215] 从用hTREM-Ι蛋白以两周间隔免疫6次，接着加强注射的KO小鼠中，获得最高数 目的阻断性抗体。分离出共200种以上的hTREM-Ι抗体，随后发现其中大约70种具有阻断 作用。
[0216] 在BWZ/hTREM-Ι报道分子测定中先作为上清液，稍后作为纯化的抗体，在从5000 ng/ml下至7 ng/ml的整个滴定中，作为可溶性抗体和作为板结合的抗体，测试了所有的 TREM-I特异性杂交瘤上清液。来自各种不同供体的血液用作新鲜嗜中性粒细胞的来源。例 如，图4显示来自一种融合物的抗体，其中报道分子测定中作为阻断活性的活性位于X轴， 当抗体是板结合的时，激动活性位于y轴。
[0217] 实施例4 :作为嗜中性粒细胞表达的TREM-I配体的PGLYRP1的鉴定 通过采用与质谱法联用的免疫沉淀反应（IP-MS)，PGLYRP1被鉴定为TREM-I配体。可 溶性TREM-I四聚体用作亲和力"诱饵"分子以鉴定配体。简单地说，将TREM-I-四聚体-Fc (SEQIDN0:2)和单独的CD83-Fc(SEQIDN0:5)分别以100μg/ml的终浓度与2·70亿 个人嗜中性粒细胞一起温育，在4°C下在I mL PBS中轻轻振动90分钟，通过上述葡聚糖沉 降纯化。在这些细胞沉淀后，将细胞重新悬浮于添加浓度为2 mM的交联剂3, 3'-联硫基双 [磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯](DTSSP) (Thermo Scientific :21578, Rockford，IL，USA)的 I mL PBS缓冲液中，并在室温下温育30分钟。细胞用I mL PBS洗涤3X，接着在I mL RIPA 缓冲液（Thermo Scientific，89901，Rockford，IL，USA)中裂解。在 4°C下以 15,000 X g 将 裂解液离心10分钟以除去不溶性材料。使用蛋白A Mag Sepharose ?珠粒（GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56, Piscataway，NJ，USA)，使与Fe偶联探针交联的嗜中性粒细胞 蛋白质从清液中免疫沉淀。简单地说，50 μ L珠粒先用200 μ L PBS洗涤，然后重新悬浮 于I mL细胞裂解物中，在4°C下温育60分钟，经磁性俘获，随后用200 μ I RIPA缓冲液洗 涤2Χ，然后用200 μ L PBS洗涤3Χ。在从最后的磁性俘获物中除去PBS后，使用200 μ L 含有 8 M脲、100 mM Tris (pH 8.0)和 15 mM TCEP (Thermo Scientific，77720, Rockford, IL，USA)的缓冲液，将蛋白质从磁珠中洗脱，在室温下温育30分钟，俘获珠粒，将上清液转 移到 Microcon Ultracel YM-30 过滤器（Millipore，42410，Billerica，MA，USA)中。在 14, 000 X g、20°C下，将样品离心30-60分钟，直到滤膜顶部不留下液体。保留的蛋白质然 后在室温避光下用100 UL 50mM IAA (碘乙酰胺）/8 M脲烷基化30分钟。过滤器用100 μ L 50mM NH4HCO3洗涤2X，然后转移到新的收集管中。加入含1 μ g胰蛋白酶（Promega， V5111，Madison，WI)的 60 μ L 50 mM NH4HCO3，接着在 37°C下温育过夜。通过以 14, 000 xg离心30分钟，接着用50 μ L 50 mM NH4HCO3洗涤过滤器，来收集胰蛋白酶消化物。使用 LTQ-Orbitrap-XL 质谱仪（Therm。Scientific，Waltham，MA，USA)，通过 LC/MS/MS 对 10 μ L 消化物进行分析。使用 SEQUEST-Sorcerer 引擎（4. 0· 4 build) (SageN，Milpitas，CA，USA)， 针对 IPI 人数据库（ν3·81)搜索数据，然后用 Scaffold 3 (Proteome Software，Portland， 〇R，USA)后处理以过滤蛋白质ID，其假发现率为1%。在减去阴性对照后，发现PGLYRP1是与 hTREM-Ι四聚体特异性缔合的高置信度蛋白质。嗜中性粒细胞的免疫沉淀反应显示，148种 经鉴定的蛋白质中，72种蛋白质通过仅对照构建体（⑶83)免疫沉淀，对于TREM-I和⑶83， 73种蛋白质是相同的，而仅有3种是TREM-I特异性的（图3)。随后使用来自不同供体的 嗜中性粒细胞重复实验，PGLYRP1再次被鉴定为与hTREM-Ι特异性相互作用。
[0218] 实施例5 :自大肠杆菌表达的人PGLYRP1的再折叠和纯化 人PGLYRP1在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中作为包涵体表达。细菌通过离心收获，重新 悬浮于 50mM Tris-HCl pH8.0、500 mM NaCl、5 mM EDTA、0. 5% Triton X-100 中，并通过超 声处理破坏。不溶性沉淀用50 mM Tris (pH 8. 0)、1% TritonX-100、2 M脲洗涤3次，用50 mM Tris pH 8. 0 洗涤 1 次，然后溶于 50 mM Tris-HC1、6M 盐酸胍（pH7. 4)、1 mM DTT (最 终的蛋白质浓度20mg/ml)。对于体外折叠，将溶解的人PGLYRP1包涵体稀释入50 mM Tris (pH 8.0)、2mM EDTA、5 mM半胱胺、0. 5 mM胱胺、0.4 M精氨酸（最终的蛋白质浓度lmg/ml)。 在4°C下过夜后，折叠的混合物通过离心/过滤澄清，然后12倍稀释于IOmM MES pH 3. 5以 降低电导率和PH (最终的pH约5. 8,电导率约6mS/cm)。然后将稀释的折叠混合物施加到 Hitrap SP HP 5ml 柱（17-1151-01 GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上，接着用 50 mM MES pH 5. 8的5柱体积洗涤。结合的人PGLYRP1然后用50 mM MES pH 5. 8、I M NaCl以20柱 体积的(Γ60%线性梯度洗脱。合并含有再折叠的人PGLYRP1的流分，通过Amicon ultra 15 离心单位（(UFC800324 3,000 kDa MWCO，Millipore，Hellerup，Denmark)浓缩至小于 4ml。 然后使用 Hiload 26/60 Superdex 75 318ml 柱（（17-1070-01 GE Healthcare，Uppsala， Sweden)再纯化（polish)，并且将蛋白质进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水（PBS)中。大多 数再折叠的人PGLYRP1蛋白质呈单体形式。在浓缩后，通过用NANODROP UV分光计测量280 rim吸光度，测定最终的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 评价蛋白质纯度。
[0219] 实施例6 :TREM_1反应性报道分子测定法的创建 通过用NFAT-LacZ报道构建体以及hTREM-Ι和DAP12转染BWZ. 36细胞系，来产生 TREM-I报道细胞系（如实施例所述1)。健康供体的嗜中性粒细胞通过葡聚糖沉降纯 化。在50ml管中，以3份Ficoll和4份血液的比率，在FicollPaque (17-0840-03, GE Healthcare, Piscataway，NJ，USA)梯度上使血液分层，然后在22°C下以400xg离心30分 钟，无需制动。通过抽吸轻轻取出中间的PBMC条带。吸出在密实的RBC上分层的嗜中性粒 细胞，并转移到50ml聚丙烯管中。将嗜中性粒细胞和污染性RBC用lx PBS稀释至40 ml， 随后加入 10 ml 含 4% 葡聚糖 500 (Sigma，31392, St Louis，MO, USA)的 PBS 溶液。在轻 轻倒置混合后，将管在22°C下静置20-30分钟。然后将富含粒细胞的上清液转移到新的管 中，在250 X g、22°C下离心5分钟；吸出上清液，弃去。用渗透性溶解除去污染性RBC。简 单地说，将细胞沉淀重新悬浮于7. 5 ml 0. 2 % NaCl中；轻轻混合55-60秒钟，加入17. 5 ml 1. 2 % NaCl溶液。用PBS使体积达到50 ml，以250 X g离心5分钟，将沉淀重新悬浮 于7. 5 ml 0.2 % NaCl中重复溶解第二次。将最终的粒细胞沉淀重新悬浮于RPMI/10% FBS 中。这些嗜中性粒细胞用PGN (InVivogen，tlrl_pgnsa，SanDiego，CA，USA)刺激过夜以产 生能够刺激TREM-I的激活的嗜中性粒细胞。然后以1:3报道细胞：嗜中性粒细胞的比率， 将BWZ/hTREM-Ι报道细胞加到PGN激活的嗜中性粒细胞培养物中。可使用由PGLYRP1 (SEQ ID NO: 23)和PGN组成的TREM-I配体复合物而不是激活的嗜中性粒细胞刺激TREM-I。测 定在聚-D-赖氨酸包被的黑色细胞培养板（编号356640,来自BD Biosciences，San Jose, CA, USA)中运行。在培养24小时后，使用BetaGlo试剂（E4720,来自Promega，Madison， WI，USA)读出TREM-I活化，并使用来自Perkin Elmer的TopCount发光计数器测量发 光。作为阳性对照，TREM-I可被能够激动TREM-I的板结合的TREM-I抗体（R&D MAB1278， Minneapolis，MN, USA)激活。在冰箱0/N中或在37°C、5 % C02下2小时，将板用同种型 对照或 TREM-I 抗体 MAB1278 (3 ug/ml，在 PBS 中，100 ul/ 孔）包被后，加入 BWZ/hTREM-1 报道细胞。在6-24小时温育后，可使用BetaGlo试剂（E4720,来自Promega，Madison, WI， USA)读出TREM-I活化，并可使用来自Perkin Elmer的TopCount发光计数器测量发光。这 种BWZ. 36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ细胞系（"BWZ/hTREM-Ι报道细胞"）显示对抗体介导 的TREM-I交联有高反应性，与同种型对照相比，当用1-10 μ g/ml板结合的市售抗TREM-I 抗体刺激时,得到约40倍诱导的NFAT驱动的LacZ产生（图1)。当仅用toll-样受体混合 物（tlrl_kit2hm，Invivogen，Sigma-Aldrich Denmark) (BWZ+TLR)刺激时，未观察到信号 增加。此外，未激活的嗜中性粒细胞不能刺激TREM-1，而TLR激动剂混合物（tlrl-kit2hm， Invivogen，Sigma-Aldrich Denmark)激活的嗜中性粒细胞可刺激BWZ/hTREM-1报道细胞。
[0220] 下表1显示在这样的BWZ/hTREM-Ι报道细胞测定中本文公开的TREM-I抗体能够 阻断配体诱导的TREM-I活化。
[0221] 表 1
【权利要求】
1. 一种能够特异性地结合和阻断TREM-I的抗体或其片段。
2. 权利要求1的抗体或其片段，其能够阻断PGLYRP1诱导的TREM-I活化。
3. 权利要求1-2中任一项的抗体或其片段，其与mAb 0170竞争以结合SEQ ID NO: 1 (人 TREM-1)。
4. 权利要求1-4中任一项的抗体或其片段，其与mAb 0170竞争以结合SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 21 (食蟹猴 TREM-1)。
5. 权利要求1-4中任一项的抗体或其片段，其能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的氨基酸D38-F48的多肽。
6. 权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，其能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 12 (食蟹猴TREM-1)的氨基酸残基E19-L26的多肽。
7. 权利要求1-6中任一项的抗体或其片段，其具有包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的 氨基酸残基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44和L45的1、2、3、4、5、6、7个或全部及氨基酸 残基E46、K47、F48的1、2个或全部的表位。
8. 权利要求1-7中任一项的抗体或其片段，其具有包含SEQ ID NO: 1 (人TREM-1)的 氨基酸残基D42、E46、D92和H93的1、2、3个或全部的表位。
9. 权利要求7-8中任一项的抗体或其片段，其具有还包含SEQ ID NO: I (ATREM-I) 的氨基酸残基L31、186和VlOl的1、2个或全部的表位。
10. 权利要求1-9中任一项的抗体，其能够特异性地结合SEQ ID NO: 13 (K20A-hTREM-l-Cmyc2-His6)。
11. 权利要求1-10中任一项的抗体，其能够特异性地结合SEQ ID NO: 14 (A24T/Y28F/ N30S/R32Q/P70H-cTREM-l-Cmyc2-His6)。
12. 权利要求1-11中任一项的抗体，其能够特异性地结合SEQ ID NO: 15 (A24T/Y28F/ N30S/R32Q/E54K-cTREM-l-Cmyc2-His6)。
13. 权利要求1-13中任一项的抗体，其重链包含相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸残基31-35 (TYAMH)的⑶RHl序列，其中这些氨基酸残基之一可被不 同的氨基酸残基取代；和/或相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG)的CDRH2序列，其中所述氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残 基取代；和/或相当于SEQ ID NO: 4的氨基酸残基101-110 (DMGIRRQFAY)或SEQ ID NO: 6的氨基酸残基101-110 (DMGQRRQFAY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的1、2或3个 可被不同的氨基酸取代；且其轻链包含相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残 基24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的⑶RLl序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的 氨基酸取代；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基54-60 (RASNLES) 的CDRL2序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸取代；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基93-101 (QQSNEDPYT)的CDRL3序列，其中这些氨 基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸取代。
14. 权利要求13的抗体，其重链包含相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基 酸残基31-35 (TYAMH)的CDRHl序列；和/或相当于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的 氨基酸 50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG)的 CDRH2 序列；和 / 或相当于 SEQ ID NO: 4 的氨 基酸残基 101-110 (DMGIRRQFAY)或 SEQ ID NO: 6 的氨基酸残基 101-110 (DMGQRRQFAY) 的CDRH3序列；且其轻链包含相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸残基24-38 (RASESVDTFDYSFLH)的 CDRLl 序列；和 / 或相当于 SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7 的氨基 酸残基54-60 (RASNLES)的CDRL2序列；和/或相当于SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的 氨基酸残基93-101 (QQSNEDPYT)的CDRL3序列。
15.用作药物的权利要求1-14中任一项的抗体或其片段。
【文档编号】C07K16/28GK104220456SQ201280072409
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年2月15日
【发明者】V.W.斯坦尼科, C.B.里德, S.N.格雷尔, C.维伯格, R.萨博, A.亨里克森, S.帕德克杰 申请人:诺和诺德A/S（股份有限公司）