一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法。本发明的聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物包括以下组分：组分I：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF，纯度≥95.0％；组分II：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF、di-mPEG20000-rhG-CSF、tri-mPEG20000-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤5.0％，且0≤rhG-CSF含量≤3.0％；组分III：mPEG20000，0≤含量≤5.0％；以及残余量杂质，含量＜0.5％。本发明提供的聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物活性组合物，各项指标均符合药用要求，质量均一，且体外活性、半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证聚乙二醇修饰的rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。
【专利说明】—种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF药物组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]粒细胞集落刺激因子G-CSF是一种药学上的活性蛋白，其可以促使中性粒系细胞的产生，增殖和分化，并激活血液中成熟中性粒细胞的功能。G-CSF可用于各种白细胞减少症，它可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移，并且用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞减少患者，或用作骨髓移植的前序。rhG-CSF由原核表达系统(E.coli)重组表达制备，由175个氨基酸残基组成的单链的非糖基化多肽链。
[0003]蛋白治疗药物rhG-CSF的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。市售rhG-CSF有短期的药理学作用，且在白细胞减少状态的持续期间通常必须一天给药一次以上，这给病人带来很大痛苦。
[0004]PEG-rhG-CSF就是用PEG (聚乙二醇)对rhG-CSF进行修饰，从而降低rhG-CSF的免疫原性并延长其半衰期。
[0005]中国专利申请CN1139932A(文献I)公开了一种N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF的制品，所述制品优选由至少90%的N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF及至多10%的未发生聚乙二醇化的rhG-CSF组成；更优选由至少95%的N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF及至多5%的未发生聚乙二醇化的rhG-CSF组成。在该专利说明书中，当所用PEG为甲氧聚乙二醇醛(mPEG)时，未提示纯化后样品单PEG化的rhG-CSF的含量。我们参考该专利公开方法，采用mPEG20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率只有70 %左右，按照其公开的纯化方法也不能得到高纯度(90%以上)的单PEG化的rhG-CSF。OlafB.Kinstler等在 Pharmacutical research Vol.13Νο.71996, “Characterization and StabilityofN-terminally PEGylated rhG-CSF”(文献 2)中公开了与 CN1139932A 类似方法。我们采用PEG20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率也只有70%左右，按照其公开的纯化方法也不能得到高纯度(90%以上)的单PEG化的rhG-CSF。
[0006]为了提高对rhG-CSF的N-末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度，我公司进行了大量研究工作，并于2005年3月25日提交了中国专利申请CN1687106A(文献3)，公开了一种改进的聚乙二醇修饰蛋白质α -氨基的方法，将用N-末端单mPEG-rhG-CSF的转化率提高到95 %，经纯化后的产品含95 % mPEG-rhG-CSF及5 %的rh_G_CSF。用该专利公开方法可得到基本上均一的N-末端单InPEG2cicicicTrhG-CSF产品，但产品中未反应的rhG-CSF含量稍高，将对产品质量产生一定影响，并且该方法增加了对ε氨基进行保护及去除保护基步骤，操作相对繁琐，且在生产上需要增加相应反应设备，增加了生产成本。
【发明内容】
[0007] 本发明人长期致力于PEG化rhG-CSF的研究工作，通过对用现有技术方法制备得到的mPEG-rhG-CSF产品进行研究，发现产品中主要存在以下杂质:
[0008](I)未反应完的原料，如:mPEG，rhG-CSF ；
[0009](2)其它取代位置的单(mono)取代mPEG-rhG-CSF ；
[0010](3)多取代的 mPEG-rhG-CSF，如 d1-mPEG-rhG-CSF、tr1-mPEG-rhG-CSF ；
[0011](4)其它杂质，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。
[0012]发明人通过大量研究发现，当产品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF纯度达到95%以上，上述(2)~(3)类杂质总和含量≤5%，且(I)类杂质中G-CSF含量≤3%, (4)类杂质含量<0.5%时，产品质量基本均一，且动物实验表明产品安全有效。因此，发明人对用现有技术方法制备得到的mPEG-rhG-CSF粗品的纯化方法进行了研究，终于找到一种能够使N末端mono-mPEG-rhG-CSF纯度达到95%以上，且各类杂质能够降到上述指标甚至更低以下，从而提高了 mPEG-rhG-CSF的质量稳定性，保障了其临床用药安全。
[0013]因此，本发明的一方面提供一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，其特征在于，包括以下组分:
[0014]组分1:N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，纯度≤ 95.0 % ；
[0015]组分I1:选自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF、tr1-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，O≤含量≤5.0%，且O≤rhG-CSF含量≤3.0% ；
[0016]组分II1:mPEG，0 ≤含量≤ 5.0% ；
[0017]以及残余量杂质，含量< 0.5%。
[0018]上述药物活性组合物中:
[0019]优选地，组分1:纯度≤96.0% ;组分I1:选自rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF中的一种或两种，O≤含量≤4.0% ;组分II1:0≤mPEG含量≤4.0%。
[0020]更优选地，组分1:纯度≤97.0 % ;组分II选自rhG-CSF、diiPEG-rhG-CSF中的一种或两种，且 O < d1-mPEG-rhG-CSF 含量≤ 3.0%,0 < rhG-CSF 含量≤ 2.0%，组分 III:O ( mPEG 含量≤ 3.0%。
[0021]进一步优选地，组分1:纯度≤98.0% ;组分I1:选自rhG-CSF、diiPEG-rhG-CSF中的一种或两种，且O < d1-mPEG-rhG-CSF含量≤2.0%,0 < rhG-CSF含量≤1.0%，组分III:0 ( mPEG 含量≤ 2.0%。
[0022]进一步优选地，组分1:纯度≤99.0% ;组分I1:选自rhG-CSF、diiPEG-rhG-CSF中的一种或两种，且O < d1-mPEG-rhG-CSF含量≤1.0%,0 < rhG-CSF含量≤0.5%，组分III:0 ( mPEG 含量≤ 1.0%。
[0023]上述任一药物活性组合物中，所述mPEG优选为分子量为20kDa的mPEG。
[0024]上述任一药物活性组合物中，所述残余量杂质包含外源性DNA、宿主菌蛋白；优选地，所述外源性DNA含量< IOng/剂量，所述宿主菌蛋白含量< 0.02%。
[0025]rhG-CSF序列中的5个赖氨酸为mPEG的结合位点，因此，上述药物活性组合物中，所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中，任一位点与PEG结合的mPEG-rhG-CSF ；非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF指的是，除N-末端外，其它任一结合位点形成的mono-mPEG-rhG-CSF ;所述d1-mPEG-rhG-CSF指的是,5个结合位点中任意两个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF ;所述tr1-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意三个位点结合mPEG 的 mPEG-rhG-CSF。[0026]本发明中所述组分I含量指的是其蛋白含量。
[0027]本发明另一方面还提供了一种上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤:
[0028](I)离子交换色谱法层析:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括上样、冲洗、梯度洗脱步骤；
[0029](2)分子筛层析:将离子交换层析富含N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的收集峰用Superdex 75柱进行分子筛层析，包括上样、洗脱步骤，得N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。
[0030]上述制备方法中:离子交换色谱法层析和分子筛层析中的上样和冲洗步骤所用缓冲液相同，为IOmM醋酸钠-醋酸缓冲液，任选地，可加入少量表面活性剂，所述表面活性剂优选为0.004%吐温-80溶液，下文中将IOmM醋酸钠-醋酸缓冲液和0.004%吐温-80溶液组成的缓冲液简称为缓冲液A ;离子交换色谱法层析中的梯度洗脱步骤所用缓冲液为IOmM醋酸钠-醋酸缓冲液与氯化钠溶液，和/或表面活性剂的混合液，所述氯化钠溶液浓度优选为1M，所述表面活性剂优选为0.004%吐温-80溶液，下文将缓冲液A与IM氯化钠的混合溶液简称缓冲液B。
[0031]进一步地,所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法,包括以下步骤:
[0032](I)离子交换色谱法层析:将N-末端-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括:
[0033]①上样:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释上样；
[0034]②冲洗:以缓冲液A冲洗I~5个柱体积；
[0035]③梯度洗脱:以缓冲液A及缓冲液B梯度洗脱，收集洗脱峰1、2、3 ;
[0036](2)分子筛层析:将离子交换层析收集峰2用SuperdeX75柱进行分子筛层析，包括:
[0037]①上样:将收集峰2用缓冲液A上样；
[0038]②以缓冲液A洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端-mPEG-rhG-CSF。
[0039]更进一步的,所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法,包括以下步骤:
[0040](I)离子交换色谱法层析:将N-末端mono-mPEG2_Q-rhG-CSF粗品用Macro CapSP离子交换色谱法层析，包括:
[0041 ] ①上样:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释至100~200 μ g/mL,以340mL/min± 10%的流速上样；
[0042]②冲洗:以缓冲液A以400mL/min ± 10 %的流速冲洗3个柱体积；
[0043]③梯度洗脱:以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min± 10%的流速梯度洗脱6个柱体积，所述梯度为O至50% ±10%，收集洗脱峰1、2、3 ;
[0044](2)分子筛层析:将离子交换层析收集峰2用SuperdeX75柱进行分子筛层析，包括:
[0045]①上样:将收集峰I用缓冲液A以120mL/min± 10%的流速上样，上样体积为柱体积的
[0046]5 % ；[0047]②以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即
[0048]N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF。
[0049]所述洗脱峰I~5参见附图1和2。
[0050]本发明另一方面还提供一种上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物组合物,包含上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物及药学上可接受的载体，通常将其制成注射制剂，优选冻干粉针剂，这些制剂可采用本领域一般技术人员公知的相应辅料，采用相应公知的药物制剂的制备技术制得。
[0051]本发明另一方面还提供上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物或包含其的药物组合物在制备用于治疗以造血或免疫功能减退为特征的疾病的药物中的应用，优选所述疾病是由化疗、放疗、感染性疾病、严重慢性嗜中性粒细胞减少症或白血病引起的。
[0052]本发明另一方面还提供一种采用上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法得到的mPEG2_-rhG-CSF产品，体外活性≥9 X 107IU/mg，优选为1.2~
2.5X108IU/mg。
[0053]本发明所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物,各项指标均符合药用要求，质量均一，且药效、半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证N-末端mono-mPEG-rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。
【专利附图】
【附图说明】
[0054]图1:本发明实施例离子交换色谱法层析洗脱示意图
[0055]图2:本发明实施例分子筛层析洗脱示意图
[0056]图3:制备例制备的mPEG2Q(l(l(|-rhG-CSF粗品的液相图谱
[0057]图4:实施例1制备的InPEG2cicicicTrhG-CSF药物活性组合物组分I和11检测的液相图谱
[0058]图5:实施例2制备的mPEG2_Q-rhG-CSF药物活性组合物组分I和11检测的液相图谱
[0059]图6:实施例3制备的mPEG2_Q-rhG-CSF药物活性组合物组分I和11检测的液相图谱
[0060]图7:实施例4制备的HiPEG2cicicicTrhG-CSF药物活性组合物组分I和11检测的液相图谱
[0061 ]图8:实施例5制备的mPEG2Q(l(l(l-rhG-CSF药物活性组合物组分I和11检测的液相图谱
[0062]图9:实施例6制备的mPEG2_Q-rhG-CSF药物活性组合物组分I和11检测的液相图谱【具体实施方式】
[0063]以下结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
[0064] 以下制备例和实施例检测方法如下:
[0065]1、组分I及组分II中各成分的含量检测方法:照高效液相色谱法测定
[0066]色谱条件及测定方法:
[0067]仪器:WATERSTM600型高效液相色谱仪[0068]色谱柱:采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
[0069]测定方法:以A相(三氟乙酸-水溶液:量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液:量取1.0ml三氟乙酸和99ml水加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀)为流动相，在室温条件下，按下表进行梯度洗脱。上样量应不低于10 μ g,在波长280nm处检测。
[0070]表1组分I及组分II流动相洗脱梯度
【权利要求】
1.一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，其特征在于，包括以下组分: 组分 1:N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，纯度≤ 95.0% ； 组分 I1:选自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF、tr1-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，O≤含量≤5.0%，且O≤rhG-CSF含量≤3.0% ； 组分III:mPEG,0≤含量≤5.0% ； 以及残余量杂质，含量< 0.5%。
2.如权利要求1所述的药物活性组合物，其特征在于，组分1:纯度≥96.0%;组分II:选自rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF中的一种或两种，O≤含量≤4.0%;组分II1:0≤mPEG含量≤ 4.0%;优选地，组分1:纯度≥97.0%;组分II:0 ≤含量≤ 3.0%;组分III:0 ≤含量≤3.0% ;更优选地，组分1:纯度≥98.0% ;组分II:0 ≤含量≤ 2.0% ;组分III:0 ≤含量≤2.0% ;进一步优选地，组分1:纯度≥99.0% ;组分II:0 ≤含量≤1.0% ;组分III:O ≤mPEG 含量≤ 1.0%。
3.如权利要求1或2所述的药物活性组合物，其特征在于，所述mPEG的分子量为20kDa。
4.如权利要求1或所述的药物活性组合物，其特征在于，所述残余量杂质包含外源性DNA、宿主菌蛋白；优选地，所述外源性DNA含量< IOng/剂量；所述宿主菌蛋白含量(0.02%。
5.一种如权利要求1所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤: (1)离子交换色谱法层析:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用MacroCap SP离子交换色谱法层析，包括上样、冲洗、梯度洗脱步骤； (2)分子筛层析:将离子交换层析富含N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的收集峰用Superdex 75柱进行分子筛层析，包括上样、洗脱步骤，得N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。
6.如权利要求5所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括如下步骤， (1)离子交换色谱法层析:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用MacroCap SP离子交换色谱法层析，包括: ①上样:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释上样； ②冲洗:以缓冲液A冲洗I~5个柱体积； ③梯度洗脱:以缓冲液A及缓冲液B梯度洗脱，收集洗脱峰1、2、3； (2)分子筛层析:将离子交换层析收集峰2用SuperdeX75柱进行分子筛层析，包括: ①上样:将收集峰2用缓冲液A上样； ②以缓冲液A洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端mono-mPEG-rhG-CSF； 所述缓冲液A为IOmM醋酸钠-醋酸缓冲液和0.004%吐温-80溶液的混合液；所述缓冲液B为缓冲液A与IM氯化钠的混合溶液。
7.如权利要求6所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物的制备方法，包括如下步骤: (1)离子交换色谱法层析:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP离子交换色谱法层析，包括:①上样:将N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A稀释至100~200μ g/mL,以340mL/min± 10%的流速上样； ②冲洗:以缓冲液A以400mL/min±10%的流速冲洗3个柱体积； ③梯度洗脱:以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10%的流速梯度洗脱6个柱体积，所述梯度为O至50% ±10%，收集洗脱峰1、2、3 ； (2)分子筛层析:将离子交换层析收集峰2用SuperdeX75柱进行分子筛层析，包括: ①上样:将收集峰2用缓冲液A以120mL/min±10%的流速上样，上样体积为柱体积的5% ； ②以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF。
8.—种药物组合物,包含如权利要求1至4所述的任一 N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物为注射制剂，优选为冻干粉针剂。
9.如权利要求1至4所述的任一N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，或权利要求8所述的药物组合物，在制备用于治疗以造血或免疫功能减退为特征的疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病是由化疗、放疗、感染性疾病、严重慢性嗜中性粒细胞减少症或白血病引起的。
10.一种采用权利要求5至7任一所述的制备方法得到的MPEG20000-rhG-CSF产品，体外活性> 5.0X107IU/mg，优选为 5.8 X 1O7 ~8.3X107IU/mg。
【文档编号】C07K1/16GK103908660SQ201310022078
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月5日 优先权日:2013年1月5日
【发明者】梁关军, 窦燕峰, 王龙山, 徐光
申请人:石药集团百克(山东)生物制药有限公司