专利名称：一种用气味结合蛋白15基因检测昆虫自残率的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用气味结合蛋白15基因检测昆虫自残率的方法。
背景技术：
害虫生物防治在农林业可持续发展中发挥着不可替代的重要作用。天敌昆虫的大量生产更是生物防治中最基础也是最重要的环节。捕食性天敌昆虫躅蝽(Arma chinensis)可以控制来自鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多种农林害虫，尤其是它还可以控制重大外来入侵害虫马铃薯甲虫和美国白蛾，因此躅蝽是一种应用前景很好的天敌昆虫商品O作为商品，大量减少生产成本是人们追求利润最大化的一个途径。在天敌昆虫躅蝽生产中就可以应用不同的食物来生产躅蝽，例如，不同的昆虫猎物、含昆虫成分的人工饲料和不含昆虫成分的人工饲料，进而减少生产成本。但是应用不同的食物生产出来的躅蝽的生物学特性参差不齐，有些释放后能达到很好的控制害虫的作用，有的则在释放后效果不显著。由于不同食物饲喂的躅蝽在表型上很难区分，因此这些天敌昆虫在释放前是很难评估它们的生物学特性的。种内自残现象是捕食性天敌昆虫大量群体饲养过程中很严重的一个问题。自残率高的昆虫种群很难在短期内大量扩繁，因此倍增时间大大延长，进而增加饲养成本。在用人工饲料饲养的躅蝽种群内，自残率较高。但是对于不同食物来源或不同商家的商品躅蝽自残率的检测方法仍旧是在饲 养过程中测试其自残率的多少，这种方法费时费力费钱。不进行生物学测定就很难对商品进行快速的检测。气味结合蛋白15(odorant binding proteinl5)是昆虫感受外界气味的蛋白，气味结合蛋白15表达量的变化会影响昆虫感知外界气味的程度，气味结合蛋白15基因表达量的减少会使昆虫对同类的气味感知能力下降，这就会大大增加同类自残的现象。而这种现象在捕食性天敌昆虫中更为突出。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测气味结合蛋白15编码基因表达量的物质的用途。本发明提供了用于检测气味结合蛋白15编码基因表达量的物质在检测昆虫自残率中的应用；所述气味结合蛋白15的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述应用中，所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；所述昆虫种群具体为取食不同物质昆虫种群；所述取食不同物质昆虫种群进一步具体为取食人工饲料的昆虫种群或取食猎物的昆虫种群；所述气味结合蛋白15编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸。所述昆虫具体为躅蝽。上述人工饲料按照如下方法制备生猪肝60g、大豆粉10g、水100ml、鸡蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化胆碱O. 4g、泛酸韩8mg、叶酸O. lmg、烟酰胺O. 2mg、庆大霉素
3.9mg ;具体饲喂方法见实施例2 ；上述猎物为昨蚕(Antheraea pernyi)蛹；具体饲喂方法见实施例2。上述应用中，所述用于检测气味结合蛋白15编码基因表达量的物质为如下1)-3)中任意一种I)引物对A :所述引物对由引物I和引物2组成；所述引物I的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4 ；2 )含有所述弓I物对A的RT-PCR试剂；3)含有所述引物对A或所述RT-PCR试剂的试剂盒。本发明的另一个目的是提供一种引物对A。本发明提供的一种弓丨物对A，由引物I和引物2组成；所述引物I的 核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4。
含有上述的引物对A的RT-PCR试剂也是本发明保护的范围；上述RT-PCR试剂具体由水、RT-PCR扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、上述的引物对A、荧光染料(SYBR Green I)和Taq酶组成；所述引物对A中的各条引物在所述RT-PCR试剂中的终浓度具体为O. 2-1 μ Μ，所述引物对A中的各条引物在所述RT-PCR试剂中的终浓度进一步具体为O. 25 μ M0含有上述的引物对A或上述的RT-PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。上述试剂盒还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7。本发明的第三个目的是提供一种检测昆虫自残率的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用上述的引物对A或上述的RT-PCR试剂或上述的试剂盒对待测的昆虫A和B进行RT-PCR扩增，所述取食不同物质的昆虫种群为取食人工饲料的昆虫种群或取食猎物的昆虫种群；若所述昆虫A气味结合蛋白15基因的表达量高于所述昆虫B，则所述昆虫A的自残率低于所述昆虫B。上述方法中，所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；所述RT-PCR扩增的模板为昆虫的cDNA ；所述昆虫具体为躅蝽。在本发明的实施例中，所述昆虫A为取食猎物的昆虫种群；所述昆虫B为取食人工饲料的昆虫种群。本发明的第四个目的是提供一种蛋白或其编码基因。本发明提供的蛋白的的氨基酸序列为序列表中的序列2 ；本发明提供的蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸。
本发明的实验证明，本发明所提供的检测方法可以通过检测气味结合蛋白15基因表达量来检测不同种群的昆虫自残率，特别是不同营养源的躅蝽的自残率，用本发明的检测方法检测昆虫的自残率仅需2-3天。而用传统的生物学方法需要30-60天左右。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。
图1为躅蝽beta-actin内参扩增曲线图2为躅蝽beta-actin内参融解曲线图3为躅蝽气味结合蛋白15基因扩增曲线图4为躅蝽气味结合蛋白15基因融解曲线
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测昆虫自残率的气味结合蛋白15及其编码基因的发现和专用引物的设计研究发现，气味结合蛋白15基因是一种检测昆虫自残率的很好的分子标记，因此本发明通过躅蝽的气味结合蛋白15 (odorant binding proteinl5)编码基因的表达用来检测躅蝽的自残率。 躅蝽的气味结合蛋白15编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。根据躅蝽的气味结合蛋白15编码基因设计用于扩增该编码基因的引物如下上游引物ATTACCGACATTAGGAGAAGATGAA(序列 3);下游引物ACTCAGCAGTGAAGTTCTCCAT(序列 4)。实施例2、气味结合蛋白15或编码基因或专用引物在检测躅蝽自残率中的应用下述实验中米用的螞畴(Armachinensis,记载在 Taxonomic and bionomicnotes on Arma chinensis(Fallou)(Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae, Zootaxa,3382:41-52, 2012，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得)根据取食物质的不同分为两组，每组50只取食人工饲料组躅蝽饲喂人工饲料的躅蝽(27 ±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每天每头成虫饲喂160 μ I人工饲料，一直到躅蝽自然死亡；取食猎物组躅蝽饲喂猎物的躅蝽(27±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每对成虫饲喂一头猎物，每隔7-15天根据猎物被取食情况更换一次猎物，一直到躅蝽自然死亡；人工饲料为生猪肝60g、大豆粉IOgjjC 100ml、鸡蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VC0. 2g、氯化胆碱0. 4g、泛酸I丐8mg、叶酸0. lmg、烟酰胺0. 2mg、庆大霉素3. 9mg ；猎物为昨蚕(Antheraea pernyi )蛹(可商购)。一、躅蝽cDNA的获得1、躅蝽RNA抽提
步骤如下将各组躅蝽样品移入加入适量液氮的研钵中，快速、用力研磨成匀浆，移至1. 5ml
离心管中。加1000 μ ITrizol到1. 5ml离心管中，静置5分钟。加200 μ I氯仿，旋涡振荡10秒，静置5分钟，放入离心机中，12，000g4°C离心15分钟。将上清液转移至新的1. 5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，_20°C放置I小时，室温静置10分钟。放入离心机中，12，000g，4°C离心10分钟。弃上清液，将异丙醇除尽，加入Iml75%的无水乙醇，12，000g，4°C离心5分钟。弃上清液，待沉淀 干燥后加入DEPC处理水，_80°C保存，得到RNA。2、反转录米用Superscript III Reverse Transcriptase kit 试剂盒(Invitrogen 18080044)进行反转录a)取一灭菌的无RNA酶的印pendorf管，每个样本加入如下表I所示的组分得到mixl ；表I为反转录加入组分I
权利要求
1.用于检测气味结合蛋白15编码基因表达量的物质在检测昆虫自残率中的应用； 所述气味结合蛋白15的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；所述气味结合蛋白15编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸； 所述昆虫具体为躅蝽。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述用于检测气味结合蛋白15编码基因表达量的物质为如下I) -3)中任意一种 1)引物对A:所述引物对由引物I和引物2组成；所述引物I的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4 ； 2)含有所述引物对A的RT-PCR试剂； 3)含有所述引物对A或所述RT-PCR试剂的试剂盒。
4.一种引物对A，由引物I和引物2组成； 所述引物I的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4。
5.含有权利要求4所述的引物对A的RT-PCR试剂Jy^iRT-PCR试剂具体由水、RT-PCR扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、权利要求4所述的引物对A、SYBR和Taq酶组成； 所述弓I物对A中的各条弓I物在所述RT-PCR试剂中的终浓度具体为O. 2-1 μ Μ，所述弓I物对A中的各条引物在所述RT-PCR试剂中的终浓度进一步具体为O. 25 μ Μ。
6.含有权利要求4所述的引物对A或权利要求5所述的RT-PCR试剂的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7。
8.—种检测昆虫自残率的方法，包括如下步骤用权利要求4所述的引物对A或权利要求5所述的RT-PCR试剂或权利要求6或7所述的试剂盒对待测的昆虫A和B进行RT-PCR扩增；若所述昆虫A的气味结合蛋白15基因的表达量高于所述昆虫B，则所述昆虫A的自残率低于所述昆虫B。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于 所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群； 所述RT-PCR扩增的模板为昆虫的cDNA ； 所述昆虫具体为躅蝽。
10.一种蛋白或其编码基因 所述蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2 ； 所述蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第10-273位核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种用气味结合蛋白15基因检测昆虫自残率的方法。本发明提供了用于检测取食不同物质的昆虫种群的气味结合蛋白15编码基因表达量的物质在检测取食不同物质的昆虫种群自残率中的应用；所述气味结合蛋白15的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明所提供的检测方法可以用于检测昆虫自残率，特别是不同营养源的蠋蝽的自残率，用本发明的检测方法检测昆虫的自残率仅需2-3天。而用传统的生物学方法需要30-60天左右。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。
文档编号C07K14/435GK103060467SQ20131003209
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者邹德玉, 陈红印, 张礼生, 王树英, 陈长风, 王孟卿, 刘晨曦 申请人:中国农业科学院植物保护研究所