一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，取干净、新鲜的海带并灭菌处理；对海带进行研磨，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃的条件下恒温培养5~7天；挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，得到海带内生地衣芽孢杆菌DNN6；以抑菌活性为指标优化菌株培养条件，优化的培养条件为菌株DNN6在pH9，蔗糖50g/L和蛋白胨10g/L的培养基中25℃发酵6天。8000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为95%，4℃静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白。本方法操作简单、成本低廉。
【专利说明】一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域中抗肿瘤蛋白的一种制备方法，特别是一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]海带QMmirmria Japonica Aresch)是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物。它生长于水温较低的海中，分布于中国北部沿海及朝鲜、日本和苏联太平洋地区沿岸，在中国北部及东南沿海有大量养殖。海带主要是自然生长，也有人工养殖，多以干制品行销于市，质量以色褐、体短、质细而肥厚者为佳。海带有“长寿菜”、“海上之蔬” “含碘冠军”的美誉。
[0003]海带作为一种重要的海洋资源，其食用与药用价值早为世人所知。从海带中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗HIV和增强免疫功能，对治疗心脑血管疾病和中、早期慢性肾衰等均有一定的作用。海带中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有在抗肿瘤方面被充分利用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉的海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，使海带在抗肿瘤方面得以广泛应用。
[0005]本发明的一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，步骤如下:
a、取干净、新鲜的海带并灭菌处理，所述的灭菌处理是用75%的酒精和1%的氯化汞对海带的表面进行灭菌处理；
灭菌处理后对海带进行研磨，研磨成匀浆，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37 V的条件下恒温培养5~7天；
b、挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis ；该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC N0.7077 ；
C、以抑菌活性为指标优化菌株培养条件，优化的培养条件为菌株DNN6在pH 9，蔗糖50g/L和蛋白胨10 g/L的培养基中25°C发酵6天；
d、8000 r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为95%，4°C静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得到海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白。
[0006]本发明的海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白在抗肿瘤方面的应用。
[0007]本发明的一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，操作简单、成本低廉，从海带内生地衣芽孢杆菌菌株DNN6的发酵液中所提取的抗肿瘤活性蛋白抗肿瘤活性强，对小鼠体内S180肿瘤生长有抑制活性，对白血病k562细胞株、人肝癌H印G2，乳腺癌MDA-MB-231和MFC-7均有明显的抑制活性，还可抑制和脐静脉内皮细胞HuvEc，因此可应用于抗肿瘤药品的制备，具有产业价值。
[0008]本发明中的海洋地衣芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC N0.7077。
【具体实施方式】
[0009]本发明实施例依次按如下步骤进行: a、将刚打捞的新鲜海带，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，再用75%酒精漂洗30-90s (30s 一个梯度)，无菌水冲洗；0.1%氯化汞漂洗6-18s (6s 一个梯度)，无菌水冲洗多次。将不同灭菌时间梯度的海带片都分成两份，一份用灭菌研钵研碎后接种到培养皿上作为实验组，另一份直接放入空白培养基做对照组。倒置于37°C温室中培养5~14天，观察选取较好的实验条件，即选择实验组中内生菌生长良好，而对照组中无菌落长出的灭菌时间梯度作为海带表面灭菌条件。海带表面灭菌充分研磨后，将200μL研磨液均匀涂布于现有的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37°C恒温培养5~7天。
[0010]b、挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，用滤纸片法检测各纯菌株的抑菌活性作为初步筛选标准。
[0011]通过耐盐性试验、对溶菌酶抗性试验、V.P实验、苯丙氨酸、丙二酸盐实验、柠檬酸盐利用、产糊精结晶、油脂水解、淀粉水解、二羟丙酮的形成、过氧化氢酶、酪氨酸水解、产硫化氢、明胶水解、对溶菌酶抗性、石蕊牛乳实验、糖发酵、硝酸盐还原、产生吲哚、动力实验、卵磷脂酶、甲基红实验、酪素水解等生理生化试验将其鉴定到种，该活性菌株为地衣芽孢杆菌，该菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.7077。
[0012]C、以抑菌圈平均直径为标准，优化次级代谢产物产生的最佳条件，在pH 9的蔗糖蛋白胨液体培养基中25°C发酵6天，所述蔗糖蛋白胨液体培养基的质量百分比分别为5%和1%。
[0013]d、8000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为95%，4°C静置过夜，过滤，将沉淀用蒸馏水溶解后，再用3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥；SDS-PAGE电泳结果表明沉淀物为蛋白质。
[0014]e、体外抗肿瘤活性的检测:取冻干样品用DMEM溶解，培养肿瘤细胞(将肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病细胞K562)和脐静脉内皮细胞HuvEc，样品设定浓度梯度，用MTT法测蛋白作用后肿瘤细胞存活率。具体操作如下:
首先培养肿瘤细胞，将肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7、白血病细胞K562和脐静脉内皮细胞HuvEc复苏到20%的血清培养集中，培养4飞天，接种到六孔板中，换成10%培养基培养，细胞密度达到2 X IO6后接种到96孔板中，每空100μL，过夜；将蛋白用DMEM溶液溶解，然后用DMEM做梯度稀释(10、20、30、40、60、80、100、150mg/mL)，将96孔板中培养基弃掉加入蛋白样品孵育6小时，空白对照只加DMEM。配制MTT，6小时后每空加入ΙΟμL ΜΤΤ，孵育4小时，然后将孔内液体弃掉，每空加入100μL DMSO溶解紫色结晶，37°C水浴保持20分钟。然后用酶标仪在490 nm下测吸光度值进而处理数据计算细胞存活率。结果该蛋白在150mg/mL时对白血病细胞K562抑制率高达94.73%，对脐静脉内皮细胞HuvEc抑制率61.3%，对肝癌细胞HePG2抑制率为51%，对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7抑制率分别为33.14%和41.88%，该菌株发酵液在低剂量范围内抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞，因此可作为粉剂或针剂应用于抗肿瘤药物的制备。
[0015] f、对小鼠体内S180实体瘤的抑制活性:将S180肉瘤细胞接种昆明小鼠，次日开始给药，连续给药10日后解剖小鼠检测各项指标。(给药剂量:极低剂量:0.05 Pg/kg.d ;低剂量:0.5 Pg/kg.d ;中剂量:5 Pg/kg.d ;高剂量:50 Pg/kg.d ;极高剂量:100 Pg/kg.d,阳性对照:环磷酰胺20 mg/kg.d(腹腔注射给药)抑瘤率效果呈现剂量效应，从0.5 Pg/kg开始呈现抑制效果，抑制率依次为2.036%，3.908%，48.665%，59.063%,阳性对照抑制率92.1%，在蛋白剂量低于阳性对照200倍就可达到如此好的抑制效果，因此该蛋白可开发成针剂或粉剂用于肿瘤的治疗。
【权利要求】
1.一种海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白的制备方法，其特征在于:步骤如下: a、取干净、新鲜的海带并灭菌处理，所述的灭菌处理是用75%的酒精和1%的氯化汞对海带的表面进行灭菌处理； 灭菌处理后对海带进行研磨，将研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37°C的条件下恒温培养5~7天； b、挑取单菌落反复划线培养至纯菌株,得到地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis,该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC N0.7077 ； C、以抑菌活性为指标优化菌株培养条件，优化的培养条件为菌株DNN6在pH 9，蔗糖50g/L和蛋白胨10 g/L的培养基中25°C发酵6天； d、8000 r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为95%，4°C静置过夜，过滤将沉淀用蒸馏水溶解后，再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥，得到海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白。
2.根据权利要求1所述的海洋地衣芽孢杆菌抗肿瘤蛋白在抗肿瘤方面的应用。
【文档编号】C07K1/36GK103966287SQ201310034692
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】张付云, 徐凤, 杨阳, 苍桂璐, 王维才 申请人:大连海洋大学, 张付云