专利名称：Mip1基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及MIPl基因及其用途。
背景技术：
烟草花叶病毒属病毒(Tobamovirus)是危害我国农业生产的重要病毒病原之一，该属以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)和番爺花叶病毒(tomato mosaicvirus, ToMV)为代表，引起的花叶病是多种重要经济作物上的重要病害。病害发生时，感病植株除形成明显花叶症状外，还产生如叶片弯曲皱缩甚至枯萎，植株黄化(chlorosis)矮化，果实斑驳甚至畸形，症状导致作物生物产量剧烈下，给农业生产造成重大损失。TMV作为最早发现的植物病毒，已成为病毒学研究的模式系统，本研究试图从TMV运动蛋白(MP)的互作蛋白入手研究植物病毒的运动，致病性以及寄主对病毒的敏感性。通过分离与病毒组分互作的植物蛋白因子是研究病毒侵染和抗性的有效手段。迄今，寄主中与TMV MP相互作用的蛋白因子已陆续发现，其功能也得到了分析和鉴定。其中包括与细胞壁结合的蛋白因子:果胶甲酯酶(pectin methylesterase, PME), I丐网织蛋白(calreticulin)和ANKl (Chen et al., 2000;Chen et al., 2005;Ueki et al., 2010);胞质蛋白:DnaJ类热激蛋白MPIPl (Shimizu et al.，2009)。还包括细胞骨架及其辅助因子如:肌动蛋白微丝，微管及其单体微管蛋白，以及微管结合蛋白MPB2C，EBla等(Heinlein etal., 1995;McLean et al., 1995; Kragler et al., 2003; Brandner et al.，2008),这些通过与TMV MP互作的蛋白因子或参与TMV的细胞间运动，或功能不清楚，而直接与病毒侵染力和症状相关的蛋白因 子仍有待深入探索，仍需要分离新的与TMV MP互作的新因子。
发明内容
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人采用酵母双杂交系统，以烟草花叶病毒移动蛋白MP为钓饵，筛选番茄cDNA文库，获得了可以与MP蛋白相互作用的新蛋白，被命名为MIPl (MP-1nteractingproteinDo发明人发现,通过下调MIPl在植物中的表达,能够有效地提高植物抵抗病毒感染的能力。为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的蛋白质。根据本发明的实施例，所述蛋白质具有下列氨基酸序列:MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKTASPEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYE VLSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGGGHDPFDIFSSFFGGSPFGGGMGGGSSRGRRQK RGEDVVHPLKVSLDDLYNGTSKKLSLSRNVLCPKCKGKGSKSGASMKCSGCQGSGMKVT IRQLGPSMIQQMQHACNECKGTGETISDKDRCGQCKGEKVVQEKKVLEVVVEKGMQNG QKITFPGEADEAPDTITCDIVFVLQQKEHPKFKRKGDDLFVEHTLNLTEALCGFQFILTHLD SRQLLIKSQPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPETLSPEQCKNLEA VLPPKPKTQMTDMELDECEETTLHDVNIEEEMRRKQQQAQEAYDEDEDMHGGAQRVQC AQQ (SEQ ID NO:1)所示。发明人发现，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质(在本文中也称为“MIP1”)能够与烟草花叶病毒移动蛋白MP相互作用，并且发现MIPl在植物病毒尤其是烟草花叶病毒的侵染过程中发挥了重要作用。另外，发明人发现，通过下调MIPl在细胞内的表达，可以有效地赋予植物尤其是烟草抵抗病毒尤其是烟草花叶病毒的侵染，从而为植物尤其是烟草赋予抗病能力。具体的，MIPl基因的沉默大大削弱了病毒的细胞与细胞扩散的速率,病毒的系统扩散变慢。在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的寡核苷酸，其包含编码前面所述蛋白质的核苷酸序列。由此，利用该寡核苷酸可以有效地编码MIPl蛋白。根据本发明的实施例，所述寡核苷酸具有下列核苷酸序列:ATGTTTGGAAGGGCACCGAAGAAGAGCGACAACACAAAGTATTATGAGATCTTAGGTG TTCCTAAGACGGCTTCACCTGAAGATCTCAAAAAAGCTTACCGTAAAGCTGCTATTAAG AATCATCCTGATAAGGGAGGTGATCCTGAAAAGTTTAAAGAGCTTGCACAAGCTTATGA GGTTTTGAGTGATCCCGAGAAGCGTGAGATATATGACCAGTACGGTGAAGATGCTCTCA AGGAAGGGATGGGTGGTGGAGGTGGTGGACACGACCCATTCGACATTTTCTCGTCTTT CTTTGGTGGCAGCCCGTTTGGTGGTGGTATGGGTGGTGGAAGCAGCAGAGGAAGAAG ACAGAAAAGAGGAGAGGATGTTGTCCACCCTCTTAAAGTTTCTCTGGATGATCTGTAC AATGGGACGTCAAAGAAGCTGTCACTATCTCGCAATGTACTATGCCCCAAGTGCAAGG GGAAAGGATCTAAGTCAGGTGCTTCAATGAAATGTTCTGGCTGTCAAGGGTCCGGGAT GAAAGTCACTATCAGACAACTTGGCCCATCCATGATCCAGCAGATGCAACACGCTTGC AACGAGTGTAAGGGTACTGGTGAGACAATCAGTGATAAAGATAGGTGTGGACAGTGTA AAGGTGAGAAGGTTGTGCAGGAGAAGAAGGTGTTGGAAGTTGTTGTTGAGAAGGGTA TGCAGAACGGACAGAAGATTACGTTCCCGGGCGAGGCTGATGAAGCGCCTGATACTAT CACTGGGGACATAGTTTTTGTCTTGCAACAGAAGGAACATCCCAAGTTCAAGCGAAAG GGAGATGATCTCTTTGTAGAGCACACTTTGAACTTGACTGAGGCCCTATGTGGTTTCCA GTTCATCTTGACTCACCTAGACAGTAGACAGCTACTCATTAAGTCCCAACCTGGAGAAG TTGTCAAGCCTGATCAATTTAAGGCCATAAATGATGAAGGAATGCCAATGTACCAAAGG CCGTTTATGAGAGGAAAACTGTACATTCACTTTACTGTAGATTTCCCAGAGACATTATCC CCGGAGCAGTGCAAGAAC CTTGAAGCGGTGTTGCCACCAAAACCCAAAACGCAAATG ACTGATATGGAATTGGATGAGTGCGAGGAGACCACTTTGCATGATGTTAACATTGAAGA GGAGATGCGTAGGAAGCAGCAACAAGCCCAAGAGGCATATGACGAAGATGAAGACAT GCATGGTGGTGCCCAGAGAGTTCAATGTGCACAGCAGTGA (SEQ ID NO:2)所示。由此，根据本发明的实施例，利用该寡核苷酸，能够进一步提高编码MIPl蛋白的效率。在本发明的第三方面，本发明提出了另一种分离的寡核苷酸，其具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。其中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为:ATGTTTGGAAGGGCACCGAAGAAGAGCGACAACACAAAGTATTATGAGATCTTAGGTG TTCCTAAGACGGCTTCACCTGAAGATCTCAAAAAAGCTTACCGTAAAGCTGCTATTAAG AATCATCCTGATAAGGGAGGTGATCCTGAAAAGTTTAAAGAGCTTGCACAAGCTTATGA GGTTTTGAGTGATCCCGAGAAGCGTGAGATATATGACCAGTACGGTGAAGATGCTCTCA AGGAAGGGATG ；SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为:ATGTTTGGAAGGGCACCGAAGAAGAGCGACAACACAAAGTATTATGAGATCTTAGGTG TTCCTAAGACGGCTTCACCTGAAGATCTCAAAAAAGCTTACCGTAAAGCTGCTATTAAG AATCATCCTGATAAGGGAGGTGATCCTGAAAAGTTTAAAGAGCTTGCACAAGCTTATGA GGTTTTGAGTGATCCCGAGAAGCGTGAGATATATGACCAGTACGGTGAAGATGCTCTCA AGGAAGGGATGGGTGGTGGAGGTGGTGGACACGACCCATTCGACATTTTCTCGTCTTT CTTTGGTGGCAGCCCGTTTGGTGGTGGTATGGGTGGTGGAAGCAGCAGAGGAAGAAG ACAGAAAAGAGGAGAGGATGTTGTCCACCCTCTTAAAGTTTCTCTGGATGATCTGTAC AATGGGACGTCAAAGAAGCTGTCACTATCTCGCAATGTACTATGCCCCAAGTGCAAGG GGAAAGGATCTAAGTCAGGTGCTTCAATGAAATGTTCTGGCTGTCAAGGGTCCGGGAT GAAAGTCACTATCAGACAACTTGGCCCATCCATGATCCAGCAGATGCAACACGCTTGC AACGAGTGTAAGGGTACTGGTGAGACAATCAGTGATAAAGATAGGTGTGGACAGTGTA AAGGTGAGAAGGTTGTGCAGGAGAAGAAGGTGTTGGAAGTTGTTGTTGAGAAGGGTA TGCAGAACGGACAGAAGATTACGTTCCCGGGCGAGGCTGATGAAGCGCCTGATACTAT CACTGGGGACATAGTTTTTGTCTTGCAACAGAAGGAACATCCCAAGTTCAAGCGAAAG GGAGATGATCTCTTTGTAGAGCACACTTTGAACTTGACTGAGGCCCTATGTGGTTTCCA GTTCATCT。将该寡核苷酸连入TRV病毒诱导的基因沉默载体中(Liu et al.，2002)，获得MIPlRNAi克隆。发明人发现，通过农杆菌介导的植物细胞的侵染的方法在细胞内表达该克隆，可以有效地作为RNAiJ^g MIPl蛋白在植物细胞，尤其是烟草细胞中的表达，可以有效地赋予植物尤其是烟草抵抗病毒尤其是烟草花叶病毒的侵染，从而为植物尤其是烟草赋予抗病能力。在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建体，所述构建体包含编码SEQ IDNO:3或SEQ ID N0:4。由此，利用该构建体可以有效地将表达包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列的核酸分子引入到植物细胞中，从而使植物细胞表达该RNA，可以有效地作为RNAi，降低MIPl蛋白在植物细胞， 尤其是烟草细胞中的表达，可以有效地赋予植物尤其是烟草抵抗病毒尤其是烟草花叶病毒的侵染，从而为植物尤其是烟草赋予抗病能力。根据本发明的具体实施例，构建体可以采用包含编码SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并进一步构建转基因植物。在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“寡核苷酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。根据本发明的实施例，构建体中还可以包含其他的元件，从而为构建体赋予额外的有益效果。本领域技术人员可以根据需要，选择这些元件在构建体上与编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的相对位置。即可以设置在编码SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示的核苷酸序列的上游，也可以设置在编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游，只要这些元件能够发挥其相应的功能即可。在本发明中所使用的术语“5’侧”可以与“上游”互换使用，“3’侧”可以与“下游”互换使用。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包含启动子序列，所述启动子序列与所述编码SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列可操作地相连。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过构建体在植物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动编码SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所不的核昔酸序列的转录和表达，由此,可以提闻所获得的重组细胞中编码SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的表达效率。根据本发明的具体实例，采用的启动子可以为2*CaMV的35S启动子。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受构建体的植物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加相应的药物，则相应连同载体接受并表达药物抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为卡拉霉素(Kan+，50mg/L)。由此，能够进一步提高筛选接受外源构建体的重组细胞的效率。当然，本领域技术人员能够理解的，构建体还可以包含其他常规的元件以促进构建体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上，正常发挥功能，例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。在本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建转基因植物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法可以包括以下步骤:将前面所述的构建体导入到植物细胞；以及分离转基因植物细胞。根据本发明的实施例，可以采用的植物细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，可以采用的植物细胞可以为野生型本生烟叶片组织细胞。所述植物细胞为烟草细胞。由此，可以有效地获得MIPl蛋白表达下降的植物细胞。并且可以进一步基于该植物细胞获得MIPl蛋白表达下降的植物，从而获得抗病能力，尤其是抵抗病毒，如烟草花叶病毒，得到提高的植物。由此，在本发明的第六方面，本发明提出了一种提高植物抗病毒能力的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:降低所述植物中MIPl蛋白的表达。根据本发明的实施例，可以抵抗的病毒为烟草花叶病毒，可以处理的植物类型还可以为其他的茄科植物，例如番茄。根据本发明的实施例，通过RNAi方式，使MIPl蛋白表达水平得到降低，例如，可以是使所述植物表达具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的RNA而实现的，优选地，是通过向所述植物中引入前面所述的构建体实现的。在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备转基因植物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:通过利用携带前面所述构建体的农杆菌对所述植物的叶片进行转化；以及基于经过转化的植物叶片，获得转基因植物。由此，可以有效地获得抗病能力得到提高的植物，例如烟草。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中 部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1显示了根据本发明的一个实施例，NbMIPl与MP蛋白在体外相互作用的验证结果。图2显示了根据本发明的一个实施例，NbMIPl与MP蛋白在体内相互作用的验证结果。图3显示了根据本发明的一个实施例，MIPl基因沉默植物的照片。图4显示了根据本发明的一个实施例，NbMIPl基因沉默的植物接种TMV-GFP病毒后的UV灯检测照片。图5显示了根据本发明的一个实施例，NbMIPl的沉默降低MP蛋白的蛋白水平。图6显示了根据本发明的一个实施例，对照植物与转基因植物转染TMV-GFP病毒后的UV灯检测照片。
具体实施例方式下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施 例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例1:验证MIPl与MP蛋白相互作用发明人在本生烟(Nb)中克隆获得了全长的MIP-lcDNA序列。在本发明的实施例中，将来自Nb的MIPl基因也称为NbMIPl。利用酵母双杂交得到的番茄MIPl基因的序列，采用生物信息学的方法，利用NCBIblast和DFCI blast的结果，我们设计了 NbMIPl基因的特异的引物primer9/10:primer9:CGACGACAAGACCGTGACCATGTTTGGGAGGGCACCGAAG (SEQ ID NO:5)primer10:GAGGAGAAGAGCCGTCACTGTTGTGCACATTGAACTCTC (SEQ ID NO:6)利用实验室的Nb cDNA文库为模版,进行PCR。PCR 条件是:
将获得的PCR产物通过LIC技术连接到相应载体上，我们进行了 3个独立克隆的测序，序列结果非常一致，我们成功克隆了 NbMIPl的全长序列。1、验证MIPl与MP蛋白在体外的相互作用_酵母互作实验(I)酵母AD结构域融合表达LIC载体pSAH20b，酵母BD结构域融合表达LIC载体pYL302-lic为实验室内部保存(2)相关载体的构建:NbMIPl由引物primer7/8扩增获得后，通过LIC技术连接至Ij pSAH20b上，构成35S::AD-NbMIP10 ToMV MP由引物primerl7/30扩增获得，并连至IjpYL302-lic 上，构成 35S::BD-ToMV MP。Pr imer7:CGACGACAAGACCGTGACCATGGCTGAAATTCTTCTTACATCAG (SEQ ID NO:7)Primer8:GAGGAGAAGAGCCGTTAGATAAACAATGATTTGTGCAG (SEQ ID NO:8)Pr imer17: CGACGACAA`GACCGTGACCATGGCTCTAGTTGTTAAAGGTAAGG (SEQ ID NO:9)Primer30:GAGGAGAAGAGCCGTTAATACGAATCAGAATCCGCGACC (SEQ ID NO:10)(3)质粒线性化处理:pYL302-lic 质粒 30 μ L I ( I μ g)IOx Buffer Sac I IOuLSac I (Fermentas) 5 μ L无菌水tolOOyL37度酶切4h，电泳检测酶切是否完全；pSAH20b 质粒30 yL 1( lug)IOx Buffer Apa I IOuLApa I (Fermentas) 5 μ L无菌水tolOOyL37度酶切4h，电泳检测酶切是否完全；(4)线性化质粒LIC处理体系:线性化质粒50 μ L ( 500ng)5x T4polymerase buffer20 μ LIOOmM dTTP5 μ LT4DNA polymerase(5U/μ L, Fermentas) 2 μ L无菌水tolOOyL(5)连接:LIC-质粒5 μ LLIC-PCR 产物5 μ L
70 度 IOmin, 22 度 IOmin ;(6)转化及鉴定:将连接产物转化E.coli ToplO感受态细胞。转化子按照常规分子克隆方法进行鉴定，包括菌落PCR，酶切以及测序等，得到35S-BD-ToMV MP及35S-AD-NbMIPl融合表达载体；(7)酵母转化与鉴定:酵母转化使用常规醋酸锂转化方法(参照clontech《YeastProtocols Handbook)), Protocol N0.PT3040-1 )。SKY48 (pLac ⑶S)培养在 SD-Ura平板上。质粒 AD-NbMIPl/BD-ToMV MP 以及阴性对照 AD/BD，AD/BD-ToMV MP, AD-NbMIPl/BD 共转化SKY48 (pLac⑶S)，转化子在SD-Ura-Leu-His平板上进行筛选。28°C培养2天后，挑取单克隆，进行菌落PCR鉴定。(8)酵母印记实验:将鉴定的完毕的克隆在SD-Ura-Leu-His平板上划线生长后，依次印记以下五种平板:A:SC-Glu-UTH-X-GALB:SC-Gal/Raf-UTH-X-GALC:SC-Glu-UTHLD:SC-Gal/Raf-UTHLE:SC-Glu-UTH28 °C培养箱进行培养，观察。结论:将克隆得到的NbMIPl全长基因连入酵母双杂交载体中，进行其与MP相互作用的验证实验，结果见图1A。实验发现，NbMIPl可以特异的与MP蛋白互作，即转有AD-NbMIPl/BD-ToMV MP的酵母克隆能够在Gal/Raf-X-gal的UTH缺陷型培养基上变蓝，而在Glu-X-gal上不变蓝，在Gal/Raf的UTHL缺陷型培养基上生长，而在含Glu的UTHL缺陷型培养基上不能生长。说明NbMIPl可以特异的与MP蛋白在酵母中相互作用。2、验证MIPl与MP蛋白在体外的相互作用-Pulldown实验(I)GST融合蛋白LIC系统表达载体pPGH-liclO，Flag融合蛋白LIC系统表达载体pET28a-l ic 10-6H64为本实验内部保存。蛋白表达菌株BL21 (DE3) -RIL购自北京全式金公司。GST-beads 购自 Sigma 公司，抗 Flag 抗体为 Santa Cruz Biotechnology 公司产品，抗兔的HRP偶联的抗体为Jackson Immuno Research公司产品。(2)相关载体的构建:NbMIPl由引物primer9/10扩增获得，并通过LIC技术连到 pPGH-liclO 上，构成 35S-GST-NbMIPl;ToMV MP 由引物 primerl7/18 扩增获得，并通过 LIC 技术连至Ij pET28a-liclO-6H64 上，构成 35S-MP_Flag-His.同时，以 35S-GST 以及35S-cLUC-Flag-His 作为对照。Pr imer18:GAGGAGAAGAGCCGTCG ATACGAATCAGAATCCGCGACC (SEQ ID NO:11)(3)将构建好的克隆转化E.coli BL21(DE3)-RIL感受态细胞。转化子采用菌落PCR方法进行进行鉴定；
(4)蛋白的诱导表达:挑取单克隆进行液体摇床培养过夜；第二天按照1:100的比例转接到IOOmL液体培养基中，37°C摇2_3小时，至菌浓度OD约为0.3-0.4 ;转入28°C摇床进行降温培养30min，加入终浓度为0.4mM IPTG，在28°C摇床上诱导表达4小时以上，收集菌体提取蛋白；
(5)蛋白的提取:4°C,5000g离心5min,收集菌体。每IOmL菌液加入2mL含有终浓度为lmg/mL的溶菌酶以及5mM的PMSF的提取液(GST融合蛋白的提取液为:50mMTri s-HCl (PH=8.0), 200mM NaCl，0.l%Triton_X100; Flag 融合蛋白的提取液为:含有0.l%Triton-X100的PBS溶液)；超声破碎菌体后，加入Dnase和Rnase，4°C放置40分钟后，采用4°C，12000g离心20min，吸取上清，_20°C保存蛋白；吸取20 μ L蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳后，进行考马斯亮蓝染色，初测蛋白的浓度；(6)GST蛋白的纯化:在200yL蛋白提取液中加入5yL GST beads，室温摇床孵育I小时；4000g离心5min,小心吸取上清，在加入500 μ L洗涤液(50mM Tris-HCl (PH=8.0)，200mM NaCl,0.l%Triton-X100),洗漆 beads,4000g 离心 5min,小心吸取上清，重复洗涤步骤4-5次，最后加入上述洗涤液40-50 μ L到beads中；取5 μ L上述样品，加入1adingbuffer,煮样进行蛋白电泳检测，估计蛋白的纯化效果和浓度；(7)加入约Iyg的GST融合蛋白与Flag融合表达的目标蛋白，在室温孵育I小时，加入洗漆液洗漆beads4-5次后,将最终样品加入loading buffer煮样,进行SDS-PAGE电泳，进行用抗Flag抗体(Santa Cruz Biotechnology)进行western blot杂交实验,检测蛋白是否互作。结论:将NbMIPl与GST的融合表达载体、MP与Flag的融合表达载体在大肠杆菌中进行蛋白表达，然后进行pull-down体外互作实验。通过采用抗Flag的抗体进行westernblot检测，检测结果见图1B。我们发现NbMIPl可以特异的直接与ToMV MP-Flag蛋白在体外互作，而对照组GST/ToMV MP-Flag,GST-NbMIPl/Flag则无相互作用。这表明，NbMIPl可以特异的与ToMV MP蛋白直接在体外互作。3、验证MIPl与MP蛋白在体内的相互作用-LCI与COIP实验(I)相关载体的构建:LIC cLUC/nLUC融合表达载体pXGY12 (目标蛋白-cLUC)，PDYM006 (nLUC-目标蛋白)为本实验室保存。COIP HA/Myc融合表达载体pJGlOO (目标蛋白-Myc), pXGY15 (目标蛋白-HA) NbMIPl由引物primer9/10扩增得到并采用LIC连接到PDYM006以表达nLUC -NbMIPl;NbMIPl由引物primer9/20扩增得到并采用LIC连接到pJGlOO以表达NbMIPl-Myc ；ToMV MP由引物primerl7/18扩增得到并采用LIC连接到PXGY15 和 pXGY12 以表达 ToMV MP-HA, ToMV MP-cLUC 的融合表达克隆。Primer20:GAGGAGAAGAGCCGTCGCTGTTGTGCACATTGAACTCTC (SEQ ID NO:22)(2)采用冻融法，将载体转化农杆菌GV3101，用于注射烟草共表达；(3)农杆菌侵染:在含有 Kan(50mg/L)/Rif (30mgL)/Gen(50mg/L)的 LB 平板上活化农杆菌 35S-MP-cLUC 与 35S-nLUC-NbMIPl，接种至含有 Kan (50mg/l)/Rif (30mg/l) /Gen(50mg/1)LB 液体培养基中过夜培养；将 35S_MP_cLUC 与 35S_nLUC_NbMIPl，室温 2500g离心5min，用注射缓冲液(IOmM MES, IOmM MgC12，200 μ M乙酰丁香酮)调至0D600=1.0 ;室温放置3-4hr，用无针头的注射器注射烟草；(4)注射烟草48-72小时后喷洒ImM光素酶的底物,进行拍照观察(iXon, AndorTechnology)。(5)COIP实验:将含有NbMIPl-Myc表达载体的农杆菌分别与含有MP-HA、nLUC_HA表达载体的农杆菌等量混合，二者共注射后48小时后取样，提取蛋白样品，进行COIP实验。收取大约Ig的组织叶片，采用预冷的IP buffer (GTEN(10%[v/v]甘油，25mM TrispH7.5, ImM EDTA, 150mM NaCl,), IOmM DTT, 2%(w/v)PVPP(polyvinylpolypyrolidone), IXprotease inhibitor cocktail, ImM PMSF, 0.15%(v/v)NP_40)提取植物总蛋白；之后的操作均在4°C环境或者冰上进行，在蛋白提取液中加入25 μ L预先洗涤过的蛋白A/G交联的琼脂糖beads，在4°C的旋转混合器上孵育30min后，4°C，2600g离心lmin，小心地上清转移至另一个新管中，加入终浓度为I μ g/mL的抗HA(Abcam)抗体，4°C旋转孵育2小时，再加入40 μ L预先洗涤过的蛋白A/G交联的琼脂糖beads，在4°C的旋转混合器上孵育I小时；再用预冷的IP buffer洗漆beads4次,最终得到的样品，经过SDS-PAGE电泳以及用抗Myc或抗HA的抗体进行western blot杂交实验；结果分析:采用农杆菌介导的蛋白表达的方法，将含有nLUC-NbMIPl与MP_cLUC的农杆菌混合，共注射烟草叶片，48-72小时后摘取叶片进行荧光拍照。在加入底物后，nLUC-NbMIPl/MP-cLUC,能够产生荧光，而对照组合 nLUC-NbMIPl/35S_cLUC，35S_nLUC/MP-cLUC均不能产生荧光见图2A。说明NbMIPl可与MP在烟草叶片内互作。NbMIPl -Myc/MP-HA 的农杆菌共注射烟草叶片，同时以 NbMIPl-Myc/35S-HA_nLUC作为对照。在注射烟草叶片48小时后收样提取总蛋白。加入抗HA抗体对MP-HA进行免疫共沉淀实验，获得的免疫复合体采用SDS-PAGE电泳进行分离，结果见图2B，用抗Myc的抗体检测互作的NbMIPl蛋白。NbMIPl可以特异的与MP在烟草体内互作，而不与对照35S-HA_nLUC互作。实施例2:构建NbMIPl基因沉默的植物(I) VIGS载体的构建:NbMIPl片段I (1-880核苷酸)，片段2 (1-246核苷酸)分别由引物Primer9/29，Primer9/ll,以35S_AD_NbMIPl载体为模板扩增，通过LIC技术连接到 TRV-based 烟草 VIGS 载体 TRV2-LIC 上(Dong et al.，2007)，形成 TRV2_NbMIPl_l 和TRV2-NbMIPl-2 载体；Primer11:GAGGAGAAGAGCCGTCACTGGTCATATATCTCACGCTTCTCG (SEQ ID NO:12)Pr imer 29:GAGGAGAAGAGCCGTCAACCACATAGGGCTTCGGTCAAG (SEQ ID NO:13)(2) VIGS:将 TRV1，TRV2 (空载体做负对照)，TRV2_NbMIPl_l，TRV2_NbMIPl_2 转化农杆菌GV3101。鉴定后挑取单克隆进行液体培养，将TRV2、TRV2-NbMIPl-l、TRV2-NbMIPl-2分别同TRVl过夜培养菌液等体积混合，使用农杆菌侵染液悬浮，室温放置4hr后注射野生型本生烟草植物；(3)植物表型观察:14天后，观察并照相记录植物发育表型；并收取上部叶片，使用Trizol试剂提取植物总RNA，反转后，进行RT-PCR实验；(4) TMV-GFP病毒的接种:将含有TMV-GFP病毒载体的农杆菌，使用无针头的ImL无菌注射器，将菌液混合物注入植物叶片背面。待TMV完全侵染后，整株植物出现GFP荧光。此时，采集植物叶片用少量金刚砂和适量水于研钵内研磨。用干净的棉花蘸取少量研磨液轻轻涂于受试植物叶片上。(5) TMV-GFP病毒的观察:在接种病毒3天后，可在UV灯照射下，观察到TMV-GFP荧光。(6)植物总RNA提取:将叶片去除主脉后剪碎置于液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨，称取相同重量的粉末(约0.2g)，加入ImL Trizol (天根，DP432)，样品可保存-80度；提取方法参见该产品说明书；提取的RNA可通过低浓度(W/V0.6%)琼脂糖凝胶电泳检测，恒压200v电泳5min,放入EB中染色Imin即可观察RNA质量,一般会有三条明显条带出现；(7) DNaseI 处理(Fermentas)
权利要求
1.一种分尚的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列。
2.一种分离的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸具有SEQID N0:2所示的核苷酸序列。
4.一种分离的寡核苷酸，其特征在于，具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.一种构建转基因植物细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: 将权利要求5所述的构建体导入到植物细胞；以及 分离转基因植物细胞， 任选地，所述植物细胞为烟草细胞。
7.一种提高植物抗病毒能力的方法，其特征在于，包括:降低所述植物中权利要求1所述蛋白质的表达， 任选地，所述病毒为TMV， 任选地，所述植物为烟草。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降低植物中权利要求1所述蛋白质的表达，是通过使所述植物表达权利要求4所述的寡核苷酸而实现的， 优选地，是通过向所述植物中引入权利要求5所述的构建体实现的。
9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤: 通过利用携带权利要求4所述构建体的农杆菌对所述植物的叶片进行转化；以及 基于经过转化的植物叶片，获得转基因植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为烟草。
全文摘要
本发明提供了MIP1基因及其应用。MIP1基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。通过下调该蛋白的表达量，可以提高对病毒侵染的抵抗力。
文档编号C07K14/415GK103204914SQ201310069679
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者刘玉乐, 赵晋平, 杜玉梅 申请人:清华大学