基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体和应用的制作方法

文档序号:3546659阅读:240来源:国知局
专利名称:基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体和应用的制作方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体及其在体外制备庚型肝炎病毒中的应用。
背景技术
庚型肝炎病毒(GB virus C,GBV-C)发现于二十世纪九十年代中期,属于黄病毒科、单股正链RNA病毒,基因组全长约9.4kb。庚型肝炎病毒最大的特点在于其本身没有致病性,但是和HIV共感染患者中,GBV-C的存在有益于HIV患者的疾病进程,即延缓HIV患者的病程、延长HIV患者的寿命和降低死亡率,具体表现为GBV-C和HIV共感染患者与HIV单感染患者相比,⑶4细胞数目明显增加且HIV的病毒载量明显下降。然而,研究报道,不同基因型的GBV-C对HIV的影响存在差异,其中2型和5型的GBV-C对HIV-1的作用更为明显。根据基因序列同源性,目前GBV-C可分为六种基因型,各基因型具有典型的地域分布特征。其中GBV-C I型主要流行于非洲的西部,GBV-C 2型主要流行于欧洲和北美洲,GBV-C 3型流行于亚洲的中国和日本,GBV-C 4型流行于东南亚的緬甸和越南等地,GBV-C5型流行于非洲的南部和中部,于2006年新发现的GBV-C 6型主要流行于东南亚的印度尼西亚等地。云南省地处我国西南边陲,与东南亚多国接壤,Btt邻全球最大的毒品生产地一一金三角地区,是毒品运输的重要途径。研究表明,毒品的运输与病毒的传播和基因型的演变直接相关。此外,多项研究已经证实,血缘性病毒的传播途径和毒品运输路径直接相关,云南省因此成为HIV-1和HCV传入我国,并向其他省份传播的源头地区。近期我们研究结果发现,云南地区存在着又一种新的GBV-C基因型,并命名为7型。经临床指标比较分析发现,7型GBV-C可以明显的降低HIV患者的病毒载量和提高其⑶4细胞。到目前为止 ,就GBV-C于HIV之间的相互作用机制不清楚,其研究手段多采用GBV-C部分短肽在细胞水平进行研究,该方法局限性较大且研究价值不明显。其主要瓶颈在于没有较好的GBV-C体外培养体系。鉴于本课题新发现的7型GBV-C及临床指标分析的结果,结合成熟的HCV体外培养体系的构建方法和经验。本发明旨在构建7型GBV-C的感染性克隆载体,进而构建GBV-C的体外培养体系,为进一步研究GBV-C与HIV-1之间的作用机制,提供必备的工具,对今后GBV-C和HIV-1共感染情况下的疾病慢性化机制研究具有较大的科学意义和潜在应用价值。

发明内容
本发明目的在于提供一种基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体,该载体含有基因型7型庚型肝炎病毒基因,基因型7型庚型肝炎病毒基因来源于基因型7型庚型肝炎病毒,其在GenBank登录号为HQ331233,该载体中7型庚型肝炎病毒基因5’端具有T7启动子区基因,3’端具有T7终止子区基因。本发明另一目的是将基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体应用在体外制备庚型肝炎病毒中,利用构建好的基因型7型庚型肝炎病毒感染性克隆载体,在正常人的PBMC细胞中验证了庚型肝炎病毒的产毒能力,并绘制了不同时间产毒的动力学曲线。本发明通过如下技术方案实现本发明目的:
1、根据7型GBV-C全基因组序列设计巢式PCR扩增引物,其扩增片段共计13段,每一扩增片段的引物序列及扩增片段大小如下:
片段一:
OlFl:CTGAATTC GACGTGGGGGGGTTGATCOlRl:CCACTGGTCCTTGTCAACTCG01R2: CAAGAGAGACATTGAAGGGCGAC扩增片段大小为:229bp ;
片段二:
02F1: GGTTGGTAGGTCGTAAATCCCG02R1:AATGCCACCCGCCCTCA02F2:GTAGGTCGTAAATCCCGGTCA02R2:CGAAGGTTCTTGGGCTACC扩增片段大小为:378bp;
片段三:
03F1: TCCACGTCGCCCTTCAATGT 03R1:GGAAGCAAACCAAGACACGGATC03F2:CGTCGCCCTTCAATGTCTCTCTT03R2:CCACTGATTTTGTCCGTGGCTC扩增片段大小为:1061bp;
片段四:
04F1:GCGTCCTCACTGTGGGAGTTG04R1 =GGATCATACTSACGACGGGffAGG04F2:TGGGAGAGTGAGTTTTGGAGATGG04R2:GGAGRAGTATAAGCGGGACCAAC扩增片段大小为:1300bp;
片段五:
05F1:GTCCTACACCATGACCAAGATCC05R1: CGACAYTCCGTCCTAGTGAAffG05F2:TGAAATGTCCCACYCCTGCC05R2:TCRCCAGCCATCACACARC扩增片段大小为:1063bp;
片段六:
06F1: CGTGGTGYAARGGRTAYCAGG06R1:GTCTCAATGATGGANGGGTGCTG06F2:GAYGCYGTRATGHTGGTGGTG06R2:GCCTAGGGTTGGCAAGRAAC扩增片段大小为:1273bp;
片段七:
07F1:GAATGCTSGTGTCMGTGCTTCAYTC07R1: CATCCCARTCTGTHACCACCAC07F2:CATGGGSCACAARGTCCTBAT07R2 =GASCCRGTGTAffGACGCRTAGATCAT扩增片段大小为:1302bp;
片段八:
08F1: TGGGTGTTCAGCGGACSATGT08R1:AGRCAGCGRCTYTCCACATG08F2:CCRAATCCTGTCCCRYTACTGC08R2:CARTGCCACAAAGGDAGYGAC扩增片段大小为:1262bp;
片段九:
09F1: TCAGCffAACAACTCffGGCACT09R1: TCTGAGCTGCTCTCCGTAACC09F2:TGYATYCCRGACAGYTAYTTCCAAC09R2:CGAGATAAGTGCAGGCGATGG扩增片段大小为:963bp;
片段十:
IOFl:TCCARGCBATHGAGAATGCTGIORl:TGRTTKGGGGTGTACTGGAAGGC10F2: TGTCATCATGGAGGAYTGYAGTACAC10R2:CCTTCTCCTCCTTffCGGTCT扩增片段大小为:965bp;
片段十一:
IlFl:GAGGAGGCAATAAGGACTGTYAGIlRl:CCACGATGATGTTRGGCAGTT11F2: CAATAAGGACTGTHAGGCCRC11R2:ACTTGTAGTARTTRCCATGHACCTG扩增片段大小为:1047bp;
片段十二:
12F1: CATGTCSAGYGAGTACAGTGAYCC12R1: TTAGTAACCACCATGCCTCCCAAG12F2 =GAGTACAGYGAYCCffATGGCT12R2:GCYACGATGAGCAGGGYTAAG扩增片段大小为:542bp;
片段十二:
13F1: GYCAGGTKCATGGYAAYTACTACAAGT13R1: CGTCTAGAAGTAGAACCCGGCCTTTGG13F2: CGCAGACACAACYAAAACMAAAATG扩增片段大小为:642bp ;
片段一对应病毒基因组-420 -191;片段二对应病毒基因组-414 -37;片段三对应病毒基因组-214 846;片段四对应病毒基因组409 1708;片段五对应病毒基因组1328 2390;片段六对应病毒基因组2245 3517;片段七对应病毒基因组3330 4631;片段八对应病毒基因组4441 5702;片段九对应病毒基因组5467 6429;片段十对应病毒基因组6324 7288;片段i^一对应病毒基因组7100 8146;片段十二对应病毒基因组7978 8519;片段十三对应病毒基因组8120 8844。2、在已确诊的基因型7型GBV-C病人血浆中提取病毒RNA,经逆转录获得其cDNA ;
3、以步骤2中所获得的GBV-C的cDNA为模板,采用步骤I中设计的引物,应用巢式PCR方法,将病毒全基因组分为13个片段分别进行巢式PCR扩增;
4、对13个PCR扩增片段胶回收进行纯化;
5、对已纯化后的PCR产物进行双向测序;
6、将测序结果,利用Blast进行比对,比对结果无误后,对上述获得的13段PCR产物,利用重叠PCR技术进行拼接,其策略如下:
(O以片段一和片段二进行拼接,其拼接产物与片段三进行拼接,片段一、二和三拼接产物与片段四进行拼接获得P(l-2-3-4);以片段五和六拼接获得拼接产物P (5-6);然后将P(l-2-3-4)和P (5-6)进行拼接获得拼接产物P(l-2-3-4-5-6)。
·
(2)以片段七和八进行拼接获得拼接产物P(7_8);以片段九和十进行拼接获得产物P(9-10);以片段十二和十三进行拼接,其拼接产物再与片段十一进行拼接获得拼接产物P(ll-12_13);然后以片段P(9-10)和P(ll_12_13)进行拼接获得拼接产物P(9-10-11-12-13);最后完成P(7-8)和P(9-10-11-12-13)的拼接获得拼接产物P(7-8-9-10-11-12-13)。(3)分别对拼接好的两个大片段P(l-2-3-4-5-6)和P (7-8-9-10-11-12-13)进行测序,经比对分析无误后完成以上两片段的拼接,从而获得GBV-C的全长基因组序列。7、在步骤6中所得GBV-C全基因组序列的5’端和3’段分别引入了 EcoRl和Xbal的酶切位点,分别对载体pBluescript II (SK+)和GBV-C全长基因进行以上两个限制性内切酶的酶切和连接最后获得含基因型7型GBV-C全长基因组的感染性克隆载体。本发明相对于现有技术的优点和技术效果:
目前已有庚型肝炎病毒2型和3型毒株感染性克隆载体构建的相关报道,但是利用以上质粒制备的病毒毒力较差、感染性不强且很难在体外制备大量病毒株,因此未应用于庚型病毒研究中,本发明基于该课题组在云南地区首次发现并命名的基因型7型庚型肝炎病毒的基础上,构建了该感染性克隆质粒,通过验证实验结果显示,该毒株的感染性克隆质粒与已报道的其它质粒相比,通过该质粒经细胞培养后可产生,病毒载量高达106-107COpies/ml的病毒,且该病毒具有较好的感染性,因此利用该质粒构建的庚型肝炎病毒,制备高毒力、高感染力、可重复性和可操作的GBV-C病毒,为今后开展庚型肝炎病毒的研究提供了良好的工具。


图1是本发明中基因型7型GBV-C全基因组13个扩增片段的重组PCR拼接示意 图2是本发明中基因型7型GBV-C全基因组13个PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳检测结果示意 图3本发明中基因型7型GBV-C全基因组9.4kb经重叠PCR拼接后琼脂糖凝胶电泳检测结果示意 图4是本发明中基因型7型GBV-C全基因组克隆入pBluescript II (SK+)质粒,得到重组质粒pBluescript-GBV-C 7的构建示意 图5是本发明中利用7型GBV-C全基因组感染性克隆质粒在人PBMC细胞中进行培养后,利用荧光定量PCR检测方法对产毒能力的检测示意图,图中:M0L=1表示RNA质量:脂质体体积=1:1,M0L=2表示RNA质量:脂质体体积=2:1。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明保护范围不局限于所述内容,实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法,使用的实际如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。实施例1:基因型7型GBV-C感染者血浆中病毒RNA的提取
病毒 RNA 的提取参照 Highpure Viral Nueleie Aeid Kit (Roche, Germany)说明书进行,具体操作步骤如下: (1)在200μ I血浆中加入200 μ I结合缓冲液(已添加poly A载体RNA)和50 μ I蛋白酶K,立即混合均匀,72°C水浴保温10 min后再加入100 μ I结合缓冲液并混合均匀;
(2)将闻纯度提取柱和收集管组装在一起,将如一步处理过的样品加到闻纯度提取柱中,8000g 离心 I min;
(3)弃去收集管和废液,将高纯度提取柱装入新的收集管中,在提取柱中加入500μ I去除抑制子缓冲液,8000g离心I min ;
(4)弃去收集管和废液,将高纯度提取柱装入新的收集管中,在提取柱中加入450μ I洗漆缓冲液,8000g离心I min;
(5)重复上一步操作;
(6)弃去废液13,000离心30s;
(7)弃去收集管和废液,将高纯度提取柱装入新的1.5mL EP管中,在提取柱中加入50 μ I洗脱缓冲液,8000g离心I min,获得的HCV RNA储存-80°C,待用。本实例提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,均能检测到5s、18sRNA和28sRNA三条清晰条带的存在,且分光光度计0D260/280读值为1.82。因此,本实例提取的RNA纯度较好,可进行后续实验。实施例2 =GBV-C cDNA的合成
(1)向PCR 反应管中加入 2 μ I Random Primers (随机引物)(500 μ g/ml,Promega),再加入10 μ I的RNA溶液,混匀后95°C水浴5min,立即冰浴3min ;
(2)向反应管中继续加入4 μ I 的 5XRT Buffer,2 μ I dNTP Mixture (各 10mM)、含有20U的AMV逆转录酶和20U的RNA酶抑制剂的反应液8 μ 1,缓慢混匀;
(3)在PCR仪上进行反转录,其程序为:37°C 60 min,95°C 5 min。通过RNA逆转录反应制备了高质量的cDNA,为后续PCR反应提供了模板。实施例3 =GBV-C的13个片段PCR反应
本扩增采用了巢式PCR技术,其特点在于分两轮PCR进行反应,其中第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板,13段扩增片段的引物序列及扩增片段大小如下:
片段一:
OlFl:CTGAATTC GACGTGGGGGGGTTGATCOlRl:CCACTGGTCCTTGTCAACTCG01R2: CAAGAGAGACATTGAAGGGCGAC扩增片段大小为:229bp ;
片段二:
02F1: GGTTGGTAGGTCGTAAATCCCG02R1:AATGCCACCCGCCCTCA02F2:GTAGGTCGTAAATCCCGGTCA02R2:CGAAGGTTCTTGGGCTACC扩增片段大小为:378bp;
片段三:
03F1: TCCACGTCGCCCTTCAATGT03R1:GGAAGCAAACCAAGACACGGATC03F2:CGTCGCCCTTCAATGTCTCTCTT03R2:CCACTGATTTTGTCCGTGGCTC扩增片段大小为:1061bp;
片段四:
04F1:GCGTCCTCACTGTGGGAGTTG04R1 =GGATCATACTSACGACGGGffAGG04F2:TGGGAGAGTGAGTTTTGGAGATGG04R2:GGAGRAGTATAAGCGGGACCAAC扩增片段大小为:1300bp;
片段五:
05F1:GTCCTACACCATGACCAAGATCC05R1: CGACAYTCCGTCCTAGTGAAffG05F2:TGAAATGTCCCACYCCTGCC05R2:TCRCCAGCCATCACACARC扩增片段大小为:1063bp;
片段六:
06F1: CGTGGTGYAARGGRTAYCAGG06R1:GTCTCAATGATGGANGGGTGCTG06F2:GAYGCYGTRATGHTGGTGGTG06R2:GCCTAGGGTTGGCAAGRAAC扩增片段大小为:1273bp;
片段七:
07F1:GAATGCTSGTGTCMGTGCTTCAYTC07R1: CATCCCARTCTGTHACCACCAC07F2:CATGGGSCACAARGTCCTBAT07R2 =GASCCRGTGTAffGACGCRTAGATCAT扩增片段大小为:1302bp;
片段八:
08F1: TGGGTGTTCAGCGGACSATGT08R1:AGRCAGCGRCTYTCCACATG08F2:CCRAATCCTGTCCCRYTACTGC08R2:CARTGCCACAAAGGDAGYGAC扩增片段大小为:1262bp;
片段九:
09F1: TCAGCffAACAACTCffGGCACT09R1: TCTGAGCTGCTCTCCGTAACC09F2:TGYATYCCRGACAGYTAYTTCCAAC09R2:CGAGATAAGTGCAGGCGATGG扩增片段大小为:963bp;
片段十:
IOFl:TCCARGCBATHGAGAATGCTGIORl:TGRTTKGGGGTGTACTGGAAGGC10F2: TGTCATCATGGAGGAYTGYAGTACAC10R2:CCTTCTCCTCCTTffCGGTCT扩增片段大小为:965bp;
片段十一:
IlFl:GAGGAGGCAATAAGGACTGTYAGIlRl:CCACGATGATGTTRGGCAGTT11F2: CAATAAGGACTGTHAGGCCRC11R2:ACTTGTAGTARTTRCCATGHACCTG扩增片段大小为:1047bp;
片段十二:
12F1: CATGTCSAGYGAGTACAGTGAYCC12R1: TTAGTAACCACCATGCCTCCCAAG12F2 =GAGTACAGYGAYCCffATGGCT12R2:GCYACGATGAGCAGGGYTAAG扩增片段大小为:542bp;
片段十二:13F1: GYCAGGTKCATGGYAAYTACTACAAGT13R1: CGTCTAGAAGTAGAACCCGGCCTTTGG13F2: CGCAGACACAACYAAAACMAAAATG扩增片段大小为:642bp ;
(I)第一轮PCR反应
该PCR扩增弓丨物序列如上所示,该轮PCR反应均采用各片段的Fl和Rl引物(外围引物),具体反应试剂和条件如下:
以合成的cDNA为模板进行PCR扩增,体系如下:cDNA 5 μ 1、各GBV-C片段的外围引物(Fl 和 Rl)各 1μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ I, TaqDNA聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1,加入H2O补齐总体积至50 μ I ;PRC扩增条件为:94°C预变性3 min ;94°C变性 30s,50°C退火 30 s,72°C延伸 2min,共 40 个循环;72°C延伸 10 min。(2)第二轮 PCR 反应
该PCR扩增弓丨物序列如上所示,该轮PCR反应均采用各片段的F2和R2引物(内围引物),具体反应试剂和条件如下:
以合成的第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增,体系如下:第一轮PCR产物5 μ 1、HCV6u 基因型内侧引物各 I μ I (25 pmol/μ I)、10XPCR Bufer 5 μ 1、dNTP (2.5mmol/L) 4 μ 1、Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1,加入 H2O 补齐总体积至 50 μ I。PRC扩增条件为:94°C预变性4 min ;94°C变性45 s,52°C退火40 s,72°C延伸40s,共30个循环;72°C延伸10 min。本实验分十三段PCR片段完成GBV-C全基因组9.4kb序列的扩增,十三个不同片段的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,各片段扩增条带清晰,片段大小与预计一致(如图2所示)。实施例4: PCR产物的纯化
使用DNA Gel Extraction Kit (BBI, USA)完成PCR产物的纯化,按说明书操作进行,具体操作步骤如下:
(1)配制1%琼脂糖凝胶,将上述PCR产物点样,80伏电压电泳45min;
(2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖胶块,放入新的1.5mlEP管中;
(3)按每400μ l/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer,置于50 60°C水浴中IOmin,使胶彻底融化;
(4)将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的纯化柱中,室温放置2min,8000rpm离心Imin ;
(5)取下纯化柱,倒掉收集管中的废液,将纯化柱放入同一个收集管中,加入500μ IWash Solution, 8000rpm 室温离心 Imin ;
(6)重复步骤(5)—次;
(7)取下纯化柱,倒掉收集管中的废液,将纯化柱放入同一个收集管中,12,OOOrpm室温尚心15s ;
(8)将纯化柱放入一个新的1.5ml EP管中,在柱子膜中央加入30 μ I Elution Buffer或水(pH>7.0),室温或37°C放置2min ;
(9)12, OOOrpm室温离心lmin,纯化的PCR产物储存于_70°C,待用。
本实验中扩增的十三PCR产物经胶回收纯化后,去除了部分杂条带,提高了 DNA的浓度和纯度,为后续实验提供了保障。实施例5:核酸序列测定
本发明中所有PCR产物测序,均委托深圳华大基因测序服务有限公司完成,测序结果利用Chromos和BioEdit软件进行序列处理和编辑。核酸序列测定后,与预计的GBV-C 7型序列进行了序列比对,结果显示序列相似度为100%,在PCR扩增中没有任何基因突变的碱基。实施例6:利用重叠PCR技术对庚型肝炎病毒全基因组序列的拼接 1、第一轮片段的拼接
本发明中扩增的13个片 段,每相邻两片段均有近200bp的重叠序列,根据以下重叠方式完成重叠PCR反应。(I)取片段一和片段二的PCR产物等量混合作为模板,以OlFl和02R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P1-2 ;
(2)取片段三和片段四的PCR产物等量混合作为模板,以03F2和04R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P3-4 ;
(3)取片段五和片段六的PCR产物等量混合作为模板,以05F2和06R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P5-6 ;
(4)取片段七和片段八的PCR产物等量混合作为模板,以07F2和08R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P7-8 ;
(5)取片段九和片段十的PCR产物等量混合作为模板,以09F2和10R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P9-10 ;
(6)取片段十二和片段十三的PCR产物等量混合作为模板,以12F2和13R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P12-13。上述PCR反应体系如下:PCR产物等量混合物(含两种PCR产物各5ng) 5 μ 1、引物各 I μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ l.dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ l.pfu DNA 聚合酶(2.5υ/μ1) I μ 1,加入H2O补齐总体积至50 μ I。PRC扩增条件为:94°C预变性4 min ;94°C变性45 s,50°C退火lmin,72°C延伸3min,共35个循环;72°C延伸10 min。2、第二轮片段的拼接
(1)取P1-2和P3-4的PCR产物等量混合作为模板,以OlFl和04R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P1-2-3-4 ;
(2)取P7-8和P9-10的PCR产物等量混合作为模板,以07F2和10R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P7-8-9-10 ;
(3)取片段i^一和P12-13的PCR产物等量混合作为模板,以11F2和13R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P11-12-13 ;
上述PCR反应体系如下:PCR产物等量混合物(含两种PCR产物各5ng) 5 μ 1、引物各I μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ 1、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ l.pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1,加入H2O补齐总体积至50 μ I。PRC扩增条件为:94°C预变性4 min ;94°C变性45 s,50°C退火lmin,72°C延伸4min,共35个循环;72°C延伸10 min。3、第三轮片段的拼接
(I)取P1-2-3-4和P5-6的PCR产物等量混合作为模板,以OlFl和06R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P1-2-3-4-5-6。(2)取P7-8-9-10和P11-12-13的PCR产物等量混合作为模板,以07F21和13R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段P7-8-9-10-11-12-13。上述PCR反应体系如下:PCR产物等量混合物(含两种PCR产物各5ng) 5 μ 1、引物各 I μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ l.dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ l.pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1,加入H2O补齐总体积至50 μ I。PRC扩增条件为:94°C预变性4 min ;94°C变性45s,50°C退火lmin,72°C延伸5min,共35个循环;72°C延伸10 min
4、测序鉴定
将拼接后获得的P1-2-3-4-5-6和P7-8-9-10-11-12-13全长测序,测序结果经Blast比对无误后进行后续实验操作。5、第四轮片段的拼接
取P1-2-3-4-5-6和P7-8-9-10-11-12-13的PCR产物等量混合作为模板,以OlFl和13R2为引物,通过重叠PCR反应获取两片段的拼接产物,经胶回收纯化后获得片段GBV-C全基因组序列的拼接片段(见图1)。 上述PCR反应体系如下:PCR产物等量混合物5 μ I (各5ng)、引物各I μ I (25pmol/ μ I) UOXPCR Bufer 5 μ l.dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ \、pfu DNA聚合酶(2.5 U/μ I)I μ I,加入H2O补齐总体积至50 μ I。PRC扩增条件为:94°C预变性4 min ;94°C变性45s,50°C退火 lmin,72°C延伸 7min,共 35 个循环;72°C延伸 10 min。经重叠PCR反应后,本实验中的13个片段两两拼接,最终拼接成长度为9.4kb的GBV-C全基因组的大片段,拼接后PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,条带清晰,片段大小一致(图3所示),说明本次重叠PCR反应成功。实施例7:基因型7型庚型肝炎病毒克隆载体的构建 1、拼接产物和载体的酶切连接反应
分别取实施例6中所获得的GBV-C全长DNA和pBluescript II (SK+)质粒各15uL(lug),加入酶切缓冲液2uL、EcoRI和XbaI各2uL,37°C条件下酶切4h,经胶回收纯化后,分别取 GBV-C 全长 DNAIOuL (15ng)和 pBluescript II (SK+)质粒 2uL(3ng)混合均匀后,加入2uL连接缓冲液和1.5uL连接酶混合均匀后16°C连接12h。2、连接产物转化感受态细胞DH5a
在IOOuL感受态细胞中,加入与载体连接好的DNA 5uL,冰浴30min,42°C热休克90s,再冰浴2min,然后加入400 uL 37°C预热的LB液体培养基,于37°C摇床振荡培养45min。离心取沉淀或不离心取培养液均匀涂布于含100 ug/ml Amp的LB平皿上;将平皿放置于37°C培养12h,挑取20个左右的单菌落进行PCR快速鉴定。3、阳性的筛选、鉴定
(I)挑取在含Amp选择培养基上长出的菌落,先于含100 ug/ml Amp的LB液体培养基中培养2 mL,然后在37°C振荡培养过夜;
(2)取500uL菌悬液,离心沉淀,倒掉上清,加入170uL STET裂解液重悬;
(3)将菌体煮沸裂解45s,12000rpm离心10min,取上清I uL作为PCR鉴定用的模板;
(4)用对应的内引物进行PCR鉴定,有预期正确扩增条带者为阳性克隆。4、阳性克隆质粒的提取
(1)取4mL培养的阳性克隆菌液到E P管中,12000r/min离心lmin,弃去上清,尽可能吸干培养液;
(2)在菌体沉淀中加入250μ I的DNA结合液,剧烈振荡充分悬浮菌体;
(3)加入250μ I裂解液,上下颠倒混匀,室温放置不超过5 min ;
(4)加入350μ I结合液,上下颠倒混合,冰浴5 min, 12 000 r/min,离心10 min ;
(5)吸取离心后的上清,加入吸附柱中,10000r/min离心I min,弃去滤液;
(6)于吸附柱中加入500μ I去蛋白缓冲液10000 r/min离心I min,弃去滤液;
(7)于吸附柱中加入700μ I洗漆缓冲液Wash Buffer 10000 r/min离心I min,弃去滤液,重复该步骤一次;
(8)10000r/min离心2 min后,取出吸附柱芯,放入新的EP管中,在吸附柱中央滴入60°C预热的洗脱缓冲液洗脱液40 μ 1,室温静置5 min, 10000 r/min离心2min ;
(9)取5μI提取质粒进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳,检测质粒提取效果。本实验构建好的质粒分别通过菌落PCR检测、质粒酶切鉴定、序列测定和比对,序列测定结果如SEQ ID NO:1所示,表明该质粒构建成功(见图4)。实施例8:基因型7型庚型肝炎病毒的体外培养和检测
1、质粒的纯化
Cl)取实例6中提取的7型庚型肝炎病毒的感染性克隆载体200μ1 JpATE Buffer200μ1,加入苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 200μ1混合均匀,高速震荡5min, 12000g离心15min ;
(2)吸取上清与一新Eppendorf管中加入ΙΟΟμΙ氯仿混合均勻后12000g离心15min,吸取上清与一新EP管中加入0.1倍3M NaHAc, 2.5倍无水乙醇混合均匀,放入_80°C 2h ;
(3)在4°C条件下,13000rpm离心15min弃去上清,加入75%乙醇500μ1,上下颠倒6次;
(4)在4°C条件下,13000rpm离心5min弃去上清,室温放置IOmin加入50μ1DEPC水混合均匀备用;
(5)用紫外分光光度计分别测定260nm、280nm波长时的OD值,计算待测样品的浓度与纯度。2、质粒线性化
(1)吸取GBV-C 7 质粒 16μδ(2.5μ1),分别加入 IOXM Bufferl2Pl、0.l%BSA12Pl、XbaI内切酶6μ1、无菌水67.5μ1,共计ΙΟΟμΙ体系,在37°C条件下进行6h酶切;
(2)利用本实例I中质粒纯化的方法对线性化的质粒进行纯化。3、质粒单链化
(1)吸取2中纯化后的线性化质粒43μ1加入Mungbean nuclease buffer (IOX)5M-1> Mung bean nuclease 2μ1 混合均勻,在 37°C条件下放置 20min ;
(2)吸取上述(I)中单链化后的质粒50μ1加入10%SDS(wt/vol) 10Pl、Proteinase Ksolution (20M-g/M-l) 2M-1> Nuc I ease-free water I38Ml,共计 200μ1 体系在 5CTC 条件下放置Ih ;
(3)利用本实施例1中质粒纯化的方法对单链化的质粒进行纯化。4、体外转录
(1)利用Τ7体外转录试剂盒进行体外转录实验,分别吸取10ΧΤ7RNA PolymeraseBuffer 3μ1、DTT (50mm) 3μ1、NTP mixture (each2.5mm) 6ul、RNase Inhibitor 5μ1、T7RNA Polymerase 3μ1、Template DNA 10μ1、DEPC 水 20μ1,共计 50μ1 体系在 37°C条件下放置Ih ;
(2)利用DNaseI酶除去转录后的RNA中可能的DNA污染,分别吸取10XDNase I Buffer 5μ1、DNase I 3μ1、RNase Inhibitor 2μ1。5、RNA 纯化
(1)吸取经体外转录后的RNA200μ1,加入TE Buffer 200μ1,加入苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 200μ1 混合均匀,高速震荡 5min, 12000g 离心 15min ;
(2)吸取上清与一新EPPEND0RF管中加入ΙΟΟμΙ氯仿混合均匀后12000g离心15min;
(3)吸取上清与一新EPPEND0RF管中加入0.1倍3M NaHAc, 2.5倍无水乙醇混合均匀,放入-80°C 2h ;
(4)在4°C条件下,13000rpm离心15min弃去上清,加入75%乙醇500μ1,上下颠倒6次;
(5)在4°C条件下,13000rpm离心5min弃去上清,室温放置IOmin加入50μ1DEPC水混合均匀备用;·
(6)用紫外分光光度计分别测定260nm、280nm波长时的OD值,计算待测样品的浓度与纯度:RNA样品的浓度(μ g/μ I):0D260X稀释倍数X40/1000。6、庚型肝炎病毒的细胞培养和检测
(1)利用上述5中得到的RNA,根据混合比例分别为1:1和1:2(脂质体体积:RNA质量)来转染正常人的I X IO5密度的PBMC细胞;
(2)在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基,将混合液在室温放置IOmin;
(3)吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次;
(4)加入混合液,将细胞放回培养箱中培养lh,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养48h,培养13天时收取上清检测病毒拷贝数(见图5)。通过该质粒经细胞培养后可产生,病毒载量高达6.03X 106COpieS/ml的病毒,且该病毒具有较好的感染性,因此利用该质粒构建的庚型肝炎病毒,制备高毒力、高感染力、可重复性和可操作的GBV-C病毒。
权利要求
1.一种基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体,其特征在于其含有基因型7型庚型肝炎病毒基因,7型庚型肝炎病毒基因5’端具有T7启动子区基因,3’端具有T7终止子区基因。
2.根据权利要求I所述的基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体,其特征在于基因型7型庚型肝炎病毒基因来源于基因型7型庚型肝炎病毒,其在GenBank登录号为HQ331233。
3.权利要求2所述基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体在体外制备庚型肝炎病毒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆载体,本发明通过巢式PCR,获取GBV-C基因型7型全基因组13条PCR扩增片段;采用重叠PCR技术经4轮重叠PCR反应,将13个片段依次进行了片段的拼接,获取GBV-C基因型7全基因组克隆,将该全长克隆经EcoRI与XbaI双酶切后连入噬菌粒载体pBluescriptII(SK+)中相应酶切位点中,获得含有GBV-C基因型7全基因组克隆的重组质粒PGBV-C7,利用该感染性克隆质粒,可以在正常人的PBMC细胞中产生庚型肝炎病毒,进而绘制了该病毒动力学增长曲线,该发明为研究GBV-C7型的生物学特性奠定了基础,为进一步研究GBV-C与HIV-1之间的作用机制,提供必备的工具。
文档编号C12R1/93GK103255157SQ20131007255
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者冯悦, 夏雪山, 赵文华, 刘丽, 张阿梅 申请人:昆明理工大学
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