专利名称：一种安来霉素a与b分离方法
技术领域：
本发明属于分离工程技术领域，具体涉及的是一种安来霉素A与B分离方法。
背景技术：
安来霉素(Enramycin)是一种多肤类抗生素，首次由日本武田药品工业株式会社从土壤中分离的放线菌Streptomyces fungicidious N0.B5477的发酵液中提取得到。初步发现该物质在需氧和厌氧条件下对主要的革兰氏阳性菌产生强大的杀菌作用，因此被命名为Enramy-cin。饲料中添加微量就可以起到显著的促进生长和改善饲料利用率的作用。同时，恩拉霉素具有稳定性高，低毒低药物残留，广谱抗革兰氏阳性菌活性以及不产生耐药性等优点，是一种全新的饲料添加剂。安来 霉素的盐酸盐为白色或微黄色结晶性粉末，分子量约为2500，融点为225 240°C，在234 238°C分解，易溶于稀盐酸、二甲基甲酰胺，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于醋酸、苯、氯仿。安来霉素分子是由13种氨基酸的17个单体组成的巨大内酯环，脂肪酸侧链通过酰胺键与内酯环连接。根据其末端脂肪酸种类不同，分为安来霉素A(Cltl7H138C12N26O31)和安来霉素B(Cltl8H14tlC12N26O31)。安来霉素的抗菌机理是抑制细菌细胞壁的合成，主要是通过阻止粘肽的合成，使细胞壁缺损，导致细胞内渗透压升高，细胞外液渗入菌体，使细菌变形肿大，破裂而死亡，主要作用于细菌的裂殖阶段。粘肽是原核生物所特有的组织，所以恩来霉素对真核细胞几乎没有作用，不会在动物人体内残留，已成为抗菌促生长饲料添加剂的一线产品。目前安来霉素A与B的分离技术鲜有报道，中国专利CN102675427A公开了恩拉霉素标准品的高压液相制备方法，该方法将发酵菌丝体萃取后收集上清液，控制上清浓度有2000ug/ml范围内后过反相高压液相色谱柱制得纯度90%以上的恩拉霉素标准品。该方法使用反相高效液相色谱仪制备恩拉霉素，设备要求高，处理量小，纯度相对不高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而公开了一种简单易行的安来霉素A与B的分离纯化方法，降低了生产成本、仪器设备的要求低，分离纯度高，有利于工业化生产。本发明的技术方案为:一种安来霉素A与B的分离方法，其具体步骤如下:(I)将安来霉素发酵液抽滤，用蒸馏水冲洗滤饼，收集滤饼；(2)将滤饼加入到有机溶剂中搅拌均匀后全部转移到珠磨机中珠磨，收集流出浆液；(3)将流出浆液通过超滤膜浓缩6 10倍体积后过滤，收集得滤液；(4)将滤液通过平衡好的大孔吸附树脂柱进行洗脱:先用盐溶液洗脱，再用有机溶剂A洗脱，收集得A液，当液相检测A液在5.0 5.2min无吸收峰时换有机溶剂B洗脱，收集得B液，当液相检测B液在7.3 7.5min无吸收峰后停止洗脱；(5)将收集的A液和B液分别浓缩干燥，分别得到安来霉素A和B。
优选步骤(I)中加入的蒸馏水与发酵液的体积比为I 2:1。优选步骤(2)中有机溶剂为盐酸的丙酮水溶液或者是盐酸的乙醇水溶液，其中有机溶剂中盐酸的摩尔浓度均为0.04 0.08mol/L,丙酮和乙醇的体积分数均为70% 95% ；有机溶剂的加入量为有机溶剂与发酵液的体积比为I 3:1 ;珠磨条件为:珠磨温度30 500C，转速 5000 7000rpm，珠磨时间 10 30min。优选步骤(3)中超滤膜的截留分子量为2000 2400Da ;超滤过程的压力为
0.04 0.06Mpa ;温度为 30 50°C ;流速为 1.0 2.0mL/s。优选步骤(4)中的大孔吸附树脂为AB-8、HPD400或HPD500;盐溶液为NaCl或KCl水溶液，盐溶液为质量分数0.5%-1.0%;有机溶剂A为甲醇的NaCl水溶液，其中NaCl水溶液的质量分数为0.5%-1.0%，甲醇与NaCl溶液的体积比为5 7:3;有机溶液B为体积分数90%-98%的乙醇或者是盐酸的甲醇水溶液，其中盐酸水溶液的摩尔浓度为0.004
0.006mol/L,甲醇与HCl水溶液的体积比为I 3:1。优选步骤(4)中盐溶液的用量为2 4柱体积。有益效果:(I)所用的设备均为实验常规设备，没有太高要求，成本低，适合放大生产。(2)制得的安来霉素A与B纯度达到96%以上，国内外均处于领先水平。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1将150ml安来霉素发酵液抽滤，用300ml蒸馏水冲洗滤饼，收集滤饼。将滤饼加入到450ml体积分数70%的盐酸(0.04mol/L)丙酮水溶液中搅拌均匀后全部转移到珠磨机中于30°C，转速5000rpm下珠磨lOmin，收集流出浆液。将流出浆液通过截留分子量为2000Da的超滤膜，于0.04Mpa,温度为30°C，流速为1.0mL/s条件下浓缩10倍体积后过滤，收集得滤液40ml。将滤液通过平衡好的AB-8树脂柱进行洗脱，用质量分数0.5%的NaCl水溶液洗脱2柱体积，改用V (甲醇):V (质量分数0.5%NaCl溶液)=7:3的有机溶剂A洗脱，收集得A液，液相检测A液，当5.0 5.2min无吸收峰时换V (甲醇):V (0.006mol/L HCl溶液)=1:1的有机溶剂B洗脱，收集得B液，液相检测B液，当7.3 7.5min无吸收峰后停止洗脱。将收集的A液和B液分别浓缩干燥,得安来霉素A与B的纯品。分别取安来霉素纯品A与B溶解后经HPLC检测，其纯度分别为98.2%和97.5%。实施例2将200ml安来霉素发酵液抽滤，用300ml蒸馏水冲洗滤饼，收集滤饼。将滤饼加入到400ml体积分数85%的盐酸(0.06mol/L)乙醇水溶液中搅拌均匀后全部转移到珠磨机中于40°C，转速6000rpm下珠磨20min，收集流出浆液。将流出浆液通过截留分子量为2200Da的超滤膜，于0.05Mpa,温度为40°C，流速为1.5mL/s条件下浓缩8倍体积后过滤，收集得滤液40ml。将滤液通过平衡好的HPD400树脂柱进行洗脱，用质量分数0.8%的KCl水溶液洗脱3柱体积，改用V (甲醇):V (质量分数1.0%NaCl溶液)=6:3的有机溶剂A洗脱，收集得A液，液相检测A液，当5.0 5.2min无吸收峰时换体积分数90%乙醇即有机溶剂B洗脱，收集得B液，液相检测B液，当7.3 7.5min无吸收峰后停止洗脱。将收集的A液和B液分别浓缩干燥，得安来霉素A与B的纯品。分别取安来霉素纯品A与B溶解后经HPLC检测，其纯度分别为99.1%和96.4%。实施例3将250ml安来霉素发酵液抽滤，用250ml蒸馏水冲洗滤饼，收集滤饼。将滤饼加入到250ml体积分数95%的盐酸(0.08mol/L)丙酮水溶液中搅拌均匀后全部转移到珠磨机中于50°C，转速7000rpm下珠磨30min，收集流出浆液；将流出浆液通过截留分子量为2400Da的超滤膜，于0.06Mpa,温度为50°C，流速为2.0mL/s条件下浓缩6倍体积后过滤，收集得滤液35ml。将滤液通过平衡好的HPD500树脂柱进行洗脱，用质量分数1.0%的NaCl水溶液洗脱4柱体积，改用V(甲醇):V(质量分数0.75%NaCl溶液)=5:3的有机溶剂A洗脱，收集得A液，液相检测A液，当5.0 5.2min无吸收峰时换V(甲醇):V(0.004mol/L HCl溶液)=3:1的有机溶剂B洗脱，收集得B液，液相检测B液，当7.3 7.5min无吸收峰后停止洗脱。将收集的A液和B液分别浓缩干燥，得安来霉素A与B的纯品。分别取安来霉素纯品A与B溶解后经HPLC检测，其纯度分别为96.8%和96.5%。实施例4将IOOml安来霉素发酵液抽滤，用150ml蒸馏水冲洗滤饼，收集滤饼。将滤饼加入到250ml体积分数70%的盐酸(0.05mol/L)乙醇水溶液中搅拌均匀后全部转移到珠磨机中于50°C，转速5000rpm下珠磨20min，收集流出浆液；将流出浆液通过截留分子量为2000Da的超滤膜，于0.06Mpa，温度为50°C，流速为2.0mL/s条件下浓缩6倍体积后过滤，收集得滤液35ml。将滤液通过平衡好的AB-8树脂柱进行洗脱，用质量分数0.5%的KCl水溶液洗脱3柱体积，改用V (甲醇):V (质量分数0.6%NaCl溶液)=5:3的有机溶剂A洗脱，收集得A液，液相检测A液，当5.0 5.2min无吸收峰时换98%乙醇即有机溶剂B洗脱，收集得B液，液相检测B液，当7.3 7.5min无吸收峰后停止洗脱。将收集的A液和B液分别浓缩干燥，得安来霉素A与B的纯品。分别取安来霉素纯品A与B溶解后经HPLC检测，其纯度分别为96.9%和97.2%ο`
权利要求
1.一种安来霉素A与B的分离方法，其具体步骤如下: (1)将安来霉素发酵液抽滤，用蒸馏水冲洗滤饼，收集滤饼； (2)将滤饼加入到有机溶剂中搅拌均匀后全部转移到珠磨机中珠磨，收集流出浆液； (3)将流出浆液通过超滤膜浓缩6 10倍体积后过滤，收集得滤液； (4)将滤液通过平衡好的大孔吸附树脂柱进行洗脱:先用盐溶液洗脱，再用有机溶剂A洗脱，收集得A液，当液相检测A液在5.0 5.2min无吸收峰时换有机溶剂B洗脱，收集得B液，当液相检测B液在7.3 7.5min无吸收峰后停止洗脱； (5)将收集的A液和B液分别浓缩干燥，分别得到安来霉素A和B。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(I)中加入的蒸馏水与发酵液的体积比为I 2:1。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(2)中有机溶剂为盐酸的丙酮水溶液或者是盐酸的乙醇水溶液，其中有机溶剂中盐酸的摩尔浓度均为0.04 0.08mol/L，丙酮和乙醇的体积分数均为70% 95% ;有机溶剂的加入量为有机溶剂与发酵液的体积比为I 3:1 ;珠磨条件为:珠磨温度30 50°C，转速5000 7000rpm，珠磨时间10 30mino
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(3)中超滤膜的截留分子量为2000 2400Da ;超滤过 程的压力为0.04 0.06Mpa ;温度为30 50°C ;流速为1.0 2.0mL/s。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(4)中的大孔吸附树脂为AB-8、HPD400或HPD500;盐溶液为NaCl或KCl水溶液，盐溶液为质量分数0.5%-1.0% ;有机溶剂A为甲醇的NaCl水溶液，其中NaCl水溶液的质量分数为0.5%-1.0%，甲醇与NaCl溶液的体积比为5 7:3 ;有机溶液B为体积分数90%-98%的乙醇或者是盐酸的甲醇水溶液，其中盐酸水溶液的摩尔浓度为0.004 0.006mol/L,甲醇与HCl水溶液的体积比为I 3:1。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(4)中盐溶液的用量为2 4柱体积。
全文摘要
本发明公开了一种安来霉素A与B的分离方法。主要包括菌丝体的珠磨破碎、超滤浓缩、大孔树脂柱的吸附洗脱、浓缩干燥等。本方法通过加入有机溶剂进行珠磨，将细胞破碎与萃取集成到一步完成，同时选择了合适的大孔树脂及洗脱方法，能有效的将安来霉素A与B分离，且其纯度达到96%以上，该方法仪器设备要求低、工艺简单、易操作、适合工业化生产。
文档编号C07K7/08GK103232530SQ20131013534
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者胡永红, 杨文革, 李佼佼, 管珺, 开玉美, 曹峥 申请人:南京工业大学