一种抗杂色曲霉素的单克隆抗体的制作方法

文档序号:3546917阅读:261来源:国知局
专利名称:一种抗杂色曲霉素的单克隆抗体的制作方法
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体,具体而言涉及抗杂色曲霉素单克隆抗体ASH,还涉及该单克隆抗体在制备杂色曲霉素检测试剂盒中的应用。
背景技术
目前已知污染谷物的霉菌毒素约有100种,霉菌毒素是霉菌的代谢次生物。饲料中的霉菌毒素除了引起动物霉菌毒素中毒,大部分还可抑制动物免疫,降低抵抗力,从而诱发其他疾病。动物试验表明:霉菌毒素能引起心率减慢、呼吸加快、脱毛和流广等症状。霉菌毒素还可在畜产品中残留,间接危害人类健康。杂色曲霉素(Sterigmatocys简称ST)是一种杂环化合物具有很强的肝及肾脏毒素,能诱发多种肿瘤。南非某些地区的肝癌高发可能与ST有关。杂色曲霉素是,可导致胆管癌和肝癌,有致突变 性,但对食品的污染频率较低。ST还可转化成更强烈的致癌物黄曲霉毒素。ST还能引起一些动物疾病。ST可有10多种真菌代谢产生,在人工培养基的产量高达10g/kg。已知可被ST污染的食品包括:大米、小麦、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热,可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准(GB/T5009.25-1996)。该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25 μ g/kg,黄豆、花生为50 μ g/kg。由于ST危害大,分布广,要减少其对人畜的影响,有效而快速的检测食物及饲料中的ST就显得非常重要。确诊ST中毒则更有赖于从患者的组织或分泌物、排泄物中检出。与传统应用的生物学检测法、薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等相比,免疫化学检测法对真菌毒素的检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量检测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学检测ST的前提则是需要具备针对ST的抗体。以食品的天然组分形式存在的天然霉菌毒素则不易被识别,且由于潜在毒性大,从而会对消费者的健康造成很大的威胁。越早进行霉菌毒素检测就越容易将霉菌毒素产生的危害降到最低。如能从源头就发现霉菌毒素,则更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素,以免受霉菌毒素污染的饲料给养殖业带来危害,从而使企业包括食品安全蒙上阴影。实际操作中,如果在饲料原料采购环节就采用快速筛选的方法,查看饲料原料是否含有霉菌毒素,则可以使企业避免使用含霉菌毒素的原料生产饲料。所以,研制对霉菌毒素快速、高灵敏、高特异性的检测方法显得尤为重要。

发明内容
本发明公开了一种抗杂色曲霉素单克隆抗体ASH,所述单克隆抗体包括轻链和重链,其氣基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO:I和SEQ ID NO:2所不。本发明还公开了上述单克隆抗体ASH的制备方法,主要包括如下:1.抗杂色曲霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建I)抗原的制备(BSA-ST)
将ST与稀硫酸在热水浴中回流衍生成ST半缩醛衍生物,ST半缩醛衍生物经过硅胶G层析柱纯化后在中性磷酸盐缓冲液中(PBS)与牛血清白蛋白(BSA)反应5小时,低温下加入NaBH4还原,再用稀盐酸除掉过量的NaBH4,然后兑水透析,备用。由此得到复合抗原BSA-ST,分装冻干,免疫动物。用紫外吸收光谱确定BSA与ST的偶联率。2)动物免疫5只BABLC用BSA-ST进行免疫,200 μ g/只/次,免疫4次,进行小鼠尾血效价测定。最终要求ELISA效价达到1: 25600以上。3)饲养层细胞制备(融合前一天制备完成)将未经免疫的小鼠(BALB/C或昆明小鼠)拉颈处死,摘除眼球取血。将未经免疫的小鼠用75%酒精浸泡消毒,取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中。剪开小鼠腹部皮肤(不要损伤腹膜)、沿切口上下撕开皮肤,充分暴露腹部,换剪刀、镊子,剪开腹膜,切口大小可以允许尖吸管随意进出,取一只尖端平整的尖吸管吸一管培养液,加到小鼠腹腔中,涮一涮,吸出,反复几次(一般2 3次),注意不要戳破小鼠消化道,污染细胞。离心收集的饲养层细胞,弃上清,将细胞悬于HAT培养液中,台盼蓝染色计数活细胞,根据活细胞量进行稀释,使每毫升含约40万个活细胞。混匀后倒入灭过菌的排枪槽用排枪将细胞悬液加于96孔培养板的小孔中(或用滴管滴入96孔培养板的小孔)37°C,饱和湿度的培养箱中培养备用。4)免疫脾细胞的制备免疫的BALB/C小鼠,眼球取血,作为阳性对照用。免疫的BALB/C小鼠用75%酒精浸泡消毒,取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中,剪开并充分剥离腹部皮肤,换一套无菌镊子和剪子提起腹膜,剪开一小口,再换一套无菌镊子和剪子,用剪刀分离脾脏,尽量不要带结缔组织,将脾脏转移到培养皿内的细胞筛上,用剪刀剪开脾脏,用20ml玻璃注射器活塞轻轻挤压脾脏,用滴管吸取无血清1640培养基冲洗活塞和钢网,反复几次上边操作,直至脾脏仅剩包膜。将滤液离心用无血清1640培养基悬浮细胞,取少量脾细胞悬液进行台盼蓝细胞计数,检测活细胞比例(应大于80 % ),确定活脾细胞的数量,根据脾细胞的数量,按5: I 10:1准备SP2/0骨髓瘤细胞,(一只小鼠脾细胞大约IO8个,用SP2/0骨髓瘤细胞 2 X IO7 个,融合用 50% PEG40001ml)。5)骨髓瘤细胞悬液在融合前7 10天将冻存在液氮中的骨髓瘤细胞复苏,培养I 2代。选择生长旺盛、形态良好的细胞进行扩大培养。在细胞融合当天收集处于对数生长期的细胞,对收集的细胞进行细胞计数和细胞活力检测。透亮不着色的活细胞应占90%以上。计数后,根据脾细胞的数量,按5:1 10:1吸取相应数量的骨髓瘤细胞悬液注入灭菌的50mL离心管中备用(2 X IO7个骨髓瘤细胞)。6)细胞融合及培育 将装PEG4000的玻璃离心管置于酒精灯上,熔化后稍冷却,加入0.5ml无血清1640,混匀,即为50% PEG4000,37°C水浴平衡温度备用。将准备好的脾细胞、骨髓瘤细胞两种细胞悬液充分混匀后离心。再用RPM1-1640培养液洗一次。将上清倒干(或用滴管吸净残留液体),以免影响PEG的浓度。用手指轻轻弹松沉淀细胞团,使两种细胞混匀成糊状。将离心管置于37°C水浴中,缓慢加入lmL37°C预热的50% PEG4000边加边搅匀,Imin完成。静置lmin,然后将一吸管无血清培养液在Imin内加入细胞中,动作尽量轻柔,边加边搅,最后补液至20ml。离心弃上清液,将细胞轻轻悬于20%进口胎牛RPMI1640HAT培养基中。铺96孔板5块。第二天检查是否污染,第五天计算融合率,第七天换液,以后每隔3 4天换液一次,第十天检测阳性克隆。每天观察每孔克隆生长情况,做好记录,换液时,吸出一半的培养液,加入新的培养基,骨髓瘤细胞完全被杀死后,改用HT培养基。通过上述方法获得可表达抗杂色曲霉素抗体的细胞,其表达的抗杂色曲霉素抗体命名为ASH。2.抗杂色曲霉素抗体ASH的轻、重链基因的钓取通过ELISA的方法检测杂交瘤细胞的上清,筛选出能够和杂色曲霉素结合的细胞株,提取筛选的细胞株的细胞RNA,经RT-PCR,用两对特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体,转化感受态细菌,培养后挑取单个菌落,提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。通过上述步骤,构建了含有抗杂色曲霉素抗体ASH轻、重链基因的载体,经测序得到杂色曲霉素抗体ASH轻、重链基因信息,轻链其氨基酸可变区序列如序列表中SEQ ID NO:1,重链氨基酸可变区序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本发明利用单克隆抗体分型试剂盒对ASH抗体进行鉴定,结果显示本发明所述的ASH抗体为IgG2a。本发明通过ELISA交叉反应检测,结果显示本发明所述的ASH抗体特异性的与杂色曲霉素结合,而不与 BSA结合,Western Blot检测结果同ELISA检测结果一致。本发明利用上述方法筛选得到的抗体ASH和本发明人通过噬菌体库筛选得到的抗杂色曲霉素抗体ASPl (ScFv抗体),制备了检测杂色曲霉素试剂盒,其中ASPl轻链和重链的可变区氨基酸序列,分别如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示。所述检测杂色曲霉素试剂盒包括:抗杂色曲霉素ASH抗体、HRP标记的抗杂色曲霉素ASPl抗体(HRP-Sulfo-SMCC-ASPl)、辣根过氧化物酶底物缓冲液、ST标准品(100ug/ml,0.1ml)、阴性对照样品BSA。其中辣根过氧化物酶底物缓冲液:称取10mg3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶于5ml无水乙醇中制备成TMB贮存液。待使用时取0.5ml TMB贮存液加到IOml磷酸柠檬酸底物缓冲液(0.2MNa2HP04,0.1M柠檬酸)中,再加入32 μ 10.75% H2O2混匀,配置成辣根过氧化物酶底物缓冲液。本发明还公开了上述检测杂色曲霉素ELISA试剂盒的使用方法:a)将抗杂色曲霉素ASH抗体(lmg/ml)用包被液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)按I: 320稀释,取稀释后的ASH抗体稀释液,加入酶标板中,每孔100μ 1,4°C过夜;b)洗涤液(PH7.4PBS)清洗酶标板3次,每次在摇床上摇5_8min ;c)取100 μ I待测样品加入到包被的酶标板中,37°C孵育2h,每个样品包被2个孔,同时将标准品进行梯度稀释依次为5pg/ul、10pg/ul、15pg/ul、20pg/ul25pg/ul、30pg/ul,每孔 100 u I ;d)将辣根过氧化酶标记的抗体ASPl (HRP-Sulfo-SMCC-ASPl)按I: 3000 I: 5000 稀释,每孔 100μ 1,37°C孵育 2h ;e)再用洗涤液清洗5次,加辣根过氧化物酶底物缓冲液100 μ 1,显色5min后,力口入终止液100 μ 1,终止显色;
f)用酶标仪检测0D450的值,依据标准品的吸光值制备标准曲线,从而根据吸光值判断所测样品中ST的浓度。通过标准品检测上述ELISA试剂盒的灵敏度,标准品ST的稀释度如下:500pg/μ l、250pg/μ l、125pg/μ 1、62.5pg/μ 1、31.25pg/μ 1、15.625pg/μ 1、7.8125pg/μ 1、
3.90625pg/y 1、1.953125pg/y 1,0.9765625pg/y 1,0.4882812pg/y 1,0.2441406pg/y 1,结果显示,本发明所述的试剂盒能检测的最低限度为lOpg/μ I。本发明的有益效果如下:I)本发明利用了传统小鼠单抗与噬菌体抗体库的技术相结合的方法,使双抗夹心ELISA方法更加灵敏。噬菌体库抗体的制备工艺更加简单,使整个ELSIA检测数据更加稳定,更加方便快捷,传统单抗作为第一抗体包被在ELISA板上,充分发挥传统单抗捕捉抗原的能力。2) ST毒素ELISA检测技术与传统的色谱、质谱等方法相比所需设备简单(ELISA方法只需一台酶标仪或者不需检测设备,加样后直接进行眼观判定即可)。前处理程序简化(不需净化)。检 验快速,检测容量大,检验成本低。由于落方法简单易行,不需特殊设备,故可在生产现场进行检测。谷物等可经过抽提利抽提、浓缩并重新溶于水溶液中却可取样检测。不需净化,其检验操作(不包括前处理)可在几分钟至几个小时内完成。检测容量根据所用固相的不同,每次可同时分析几十个甚至更多样品。


图1ASH抗体与不同抗原结合情况,ST为杂色曲霉素,BSA-ST偶联了 BSA的ST,HAS:人血清白蛋白;图2Westem Blot检测ASH抗体与杂色曲霉素的结合情况,I =BSA-ST泳道,2:纯BSA泳道。
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容,这些实施例只是为进一步说明本发明,并不意味着限定本发明的范围。实施例一抗杂色曲霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建一、材料20%胎牛血清:北京元亨圣马生物技术研究所产品;无血清RPMI1640:Gibco公司产品;SP2/0细胞:ATCC引进;福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂,显色试剂TMB =Sigma公司产品;Balb/c以及C57BL/6小鼠;氨基蝶呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷、其余试剂均为市购。二、方法和结果1、准备工作I)氨基蝶呤(A)储存液(100X):1.8mgA溶于90ml三蒸水,滴加ImM NaOH0.5ml磁力搅拌溶解,滴加ImM HCL0.5ml中和,定容到IOOml过滤灭菌,Iml分装,_20°C储存。2)次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)储存液(100X):H136mg, T39mg,加三蒸水100ml,混勻后,50 60°C水浴中促溶,过滤除菌,Iml分装,-20°C储存。3)双抗配制:青霉素钠盐100万单位(0.6gl国际单位青霉素相当于0.60微克结晶青霉素G钠盐),链霉素Ig溶于三蒸水IOOml过滤除菌Iml分装,_20°C储存。4)50% PEG4000:0.5g/管,高压灭菌,_20°C储存,用时酒精灯熔化后稍冷却,加入0.5ml无血清1640,混匀,为 50% PEG。2、动物免疫I)抗原的制备(BSA-ST)免疫抗原:将ST与稀硫酸在热水浴中回流衍生成ST半缩醛衍生物,ST半缩醛衍生物经过硅胶G层析柱纯化后在中性 磷酸盐缓冲液中(PBS)与牛血清白蛋白(BSA)反应5小时,低温下加入NaBH4还原,再用稀盐酸除掉过量的NaBH4,然后兑水透析,备用。由此得到复合抗原BSA-ST,分装冻干,免疫动物。用紫外吸收光谱确定BSA与ST的偶联率。通过SDS-PAGE电泳也能看出ST被偶联到BSA上。2)动物免疫 5只BABLC用BSA-ST进行免疫,200 μ g/只/次,免疫4次,进行小鼠尾血效价测定。最终要求ELISA效价达到1: 25600以上。3、细胞融合I)饲养层细胞制备(融合前一天制备完成)(I)将未经免疫的小鼠(BALB/C或昆明小鼠)拉颈处死,摘除眼球取血。(2)自来水冲洗干净。(3) 75%酒精浸泡消毒lOmin,取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中。(4)取一只50ml离心管,加5 6ml无血清RPMI1640培养液,剪开小鼠腹部皮肤(不要损伤腹膜)、沿切口上下撕开皮肤,充分暴露腹部,换剪刀、镊子,剪开腹膜,切口大小可以允许尖吸管随意进出,取一只尖端平整的尖吸管吸一管培养液,加到小鼠腹腔中,涮一涮,吸出,反复几次(一般2 3次),注意不要戳破小鼠消化道,污染细胞。(5)离心50ml离心管中的饲养层细胞,1000rpm,5min,弃上清,将细胞悬于IOmLHAT培养液中,台盼蓝染色计数活细胞,根据活细胞量进行稀释,使每毫升含约40万个活细胞。混匀后倒入灭过菌的排枪槽用排枪将细胞悬液加于96孔培养板的小孔中(或用滴管滴入96孔培养板的小孔),每孔0.1mL约2 4万/孔,放置5 % 7%的CO2培养箱中,37°C,饱和湿度的培养箱中培养备用。(6)观察细胞生长状况。(7)根据第二天细胞融合后所铺96孔板数,制备足够的饲养层细胞。2)免疫脾细胞的制备(I)免疫的BALB/C小鼠,眼球取血,作为阳性对照用。(2)自来水冲洗干净。(3) 75%酒精浸泡消毒lOmin,取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中。(4)剪开并充分剥离腹部皮肤,换一套无菌镊子和剪子提起腹膜,剪开一小口
(5)再换一套无菌镊子和剪子,用剪刀分离脾脏,尽量不要带结缔组织。(6)将脾脏转移到培养皿内的细胞筛上,用剪刀剪开脾脏,用20ml玻璃注射器活塞轻轻挤压脾脏,用滴管吸取无血清1640培养基冲洗活塞和钢网,反复几次上边操作,直至脾脏仅剩包膜。将滤液吸入50ml离心管中,最后冲洗培养皿,一并转入50血离心管中,室温静止IOmin。(7) 1000r/min, 5min,用IOmL无血清1640培养基悬浮细胞,吸出明显的组织块。(8)取少量脾细胞悬液进行台盼蓝细胞计数,检测活细胞比例(应大于80% ),确定活脾细胞的数量,根据脾细胞的数量,按5:1 10:1准备SP2/0骨髓瘤细胞,(一只小鼠脾细胞大约IO8个,用SP2/0骨髓瘤细胞2 X IO7个,融合用50% PEG40001ml)。3)骨髓瘤细胞悬液(I)在融合前7 10天将冻存在液氮中的骨髓瘤细胞复苏,培养I 2代。(2)选择生长旺盛、形态良好的细胞进行扩大培养。融合前48h,将细胞接种于IOOmL培养瓶中,约4 6瓶,每瓶加完全培养液15mL,含细胞数为5 X IO4 5 X IO5个/mL。放置于5% 7% C02,37°C,饱和湿度的培养箱中培养备用。(3)在细胞融合当天收集处于对数生长期的细胞于50mL离心管中,1000r/min离心5min。细胞培养瓶,补充培养液继续培养。(4)将细胞悬于20mL RPM1-1640培养液中。(5)台盼蓝进行细胞计数和细胞活力检测。透亮不着色的活细胞应占90%以上。计数后,根据脾细胞的数量,按5:1 10:1吸取相应数量的骨髓瘤细胞悬液注入灭菌的50mL离心管中备用(2 X IO7个骨髓瘤细胞)。

4)细胞融合及培育(I)将装PEG4000的玻璃离心管置于酒精灯上,熔化后稍冷却,加入0.5ml无血清1640,混匀,即为50% PEG4000,37°C水浴平衡温度备用。(2)准备好的脾细胞、骨髓瘤细胞分别1000r/min,5min20ml无血清1640洗两次。(3)将脾细胞与骨髓瘤细胞混合于50mL离心管内。(4)将两种细胞悬液充分混勻后离心,1000r/min, 5min,弃上清液。再用RPM1-1640培养液洗一次。将上清倒干(或用滴管吸净残留液体),以免影响PEG的浓度。用手指轻轻弹松沉淀细胞团,使两种细胞混匀成糊状。(5)将离心管置于37°C水浴中,缓慢加入lmL37°C预热的50% PEG4000边加边搅勻,Imin完成。静置Imin (夏天时间为lmin,冬天时间为1.5min),然后将一吸管无血清培养液在Imin内加入细胞中,动作尽量轻柔,边加边搅(此时,细胞在PEG作用下已变形皱缩,加液太快,动作过粗,会引起细胞破裂死亡),随后,不用计时,但仍要慢慢滴加培养液,最后补液至20ml ο(6) 1000r/min离心5min,弃上清液,将细胞轻轻悬于50mL20 %进口胎牛RPMI1640HAT培养基中。铺96孔板5块。第二天检查是否污染,第五天计算融合率,第七天换液,以后每隔3 4天换液一次,第十天检测阳性克隆。(7)每天观察每孔克隆生长情况,做好记录,换液时,吸出一半的培养液,加入新的培养基,骨髓瘤细胞完全被杀死后,改用HT培养基。通过上述方法获得可表达抗杂色曲霉素抗体的细胞。
实施例二分泌抗杂色曲霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选和鉴定一、材料20%胎牛血清:北京元亨圣马生物技术研究所产品;无血清RPMI1640 =Gibco公司产品;SP2/0细胞:ATCC引进;显色试剂TMB:Sigma公司产品;二抗:羊抗小鼠-HRP ;其余试剂均为市购。二、方法和结果
1、杂交瘤细胞筛选:(I)融合后当杂交细胞集落生长到一定大小,便可开始筛选抗体活性(在每次换液的时候进行检测)。(2) ELISA检测,取上层清液IOOmL进行测定。通过2次检测后确定有阳性,就立即进行亚克隆(细胞生长约占孔底面积的1/4-1/3),有限稀释法进行亚克隆。将培养板置于37°C的5% CO2孵箱中培养,约5天后在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液,检测,取阳性单克隆细胞株进行扩大培养,及时冻存细胞株。通过上述方法,最终得到一株分泌抗ST高亲和力的细胞株,其分泌的抗体命名为ASH。2、抗体ASH的交叉反应检测:对细胞株分泌上清进行了抗原、不同载体间的交叉检测,实验设计:A1-A4为阴性空即ELISA板未包被任何抗原;Bl-Hl 包被纯的 ST;B2-H2包被BST-ST免疫抗原;B3-H3包被纯BSA蛋白;B4-H4包被纯的HAS蛋白(人血清白蛋白);B1-B4 一抗未加目的分泌液而是加入空细胞SP2/0细胞培养液;H1-H4 二抗加入空白 PBS。C、D、E、F、G为重复试验,一抗加入目的分泌液,二抗加入羊抗小鼠-HRP ;具体检测步骤如下:a)按上述设计分别,在酶标板中分别包被ST、BST_ST、BSA、HAS,每孔100 μ 1,其中Α1-Α4为阴性空白对照即ELISA板未包被任何抗原;4°C过夜。b)洗涤液清洗酶标板3次,每次在摇床上摇5_8min,37°C下用样品稀释液封闭酶标板4h以上。c)加入细胞分泌液,其中B1-B4 —抗未加目的分泌液而是加入空细胞SP2/0细胞培养液每孔100 μ 1,其余加入分泌抗ST高亲和力的细胞株分泌液每孔ΙΟΟμ 1,37°C孵育2h,再用洗涤液清洗3次。d)将二抗:羊抗小鼠-HRP按1: 3000-1: 5000稀释,分别加入孔中,每孔100μ 1,37°C孵育2h,再用洗涤液清洗3次,其中H1-H4不加羊抗小鼠-HRP 二抗,只加入100 μ1PBS。e)加辣根过氧化物酶底物缓冲液100 μ 1,显色5min后,加入终止液100 μ 1,终止显色,用酶标仪检测0D450的值。实验结果如表I所示:表I抗体ASH的交叉反应检测结果
权利要求
1.一种抗杂色曲霉素单克隆抗体,包括轻链和重链,其特征在于,所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示;所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。
2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测杂色曲霉素的试剂、药剂或试剂盒中的应用。
3.—种检测杂色曲霉素试剂盒包括:权利要求1所述的抗体、抗杂色曲霉素ASPl抗体,其中所述ASPl抗体其轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示;所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
4.根据权利要求3所述的检测杂色曲霉素试剂盒,其特征在于,所述的抗杂色曲霉素ASPl抗体带有生物标记或化学标记,所述生物标记或化学标记为突光标记、放射性标记或酶标记。
5.根据权利要求3所述的检测杂色曲霉素试剂盒,其特征在于,所述的抗杂色曲霉素ASPl抗体为辣根过氧化酶标记。
6.权利要求5所述的检测杂色曲霉素试剂盒还包括:辣根过氧化物酶底物缓冲液、ST标准品(100ug/ml,0.1ml)、阴性对照样品BSA。
7.—种检测杂色曲霉素的方法,包括以下步骤: a)将权利要求1所述的抗杂色曲霉素抗体,浓度为lmg/ml,用包被液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)按1: 320稀释,取稀释后的抗体稀释液,加入酶标板中,每孔100μ1,4 过夜; b)洗涤液(PH7.4PBS)清洗酶标板3次,每次在摇床上摇5_8min ; c)取100μ I待测样品加入到包被的酶标板中,37°C孵育2h,每个样品包被2个孔,同时将标准品进行梯度稀释依次为 5pg/ul、10pg/ul、15pg/ul、20pg/ul25pg/ul、30pg/ul,每孔 100 μ I ; d)将辣根过氧化酶标记的抗体ASPl按1: 3000 1: 5000稀释,每孔100μ 1,37°C孵育2h。
e)再用洗涤液清洗5次,加辣根过氧化物酶底物缓冲液100μ 1,显色5min后,加入终止液100 μ I,终止显色; f)用酶标仪检测0D450的值,依据标准品的吸光值制备标准曲线,从而根据吸光值判断所测样品中ST的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种抗杂色曲霉素的单克隆抗体,所述抗体包括轻链和重链,其中轻链可变区氨基酸如序列表SEQ ID NO.1所示,重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示,本发明公开了制备上述抗体的方法。利用本发明所述的抗体制备了检测杂色去霉素的检测试剂盒,所述试剂盒的灵敏度达10pg/μl,可有效检测样品中杂色曲霉素的含量。本发明所述的试剂盒使用方便,不需贵重仪器,便于大范围推广使用。
文档编号C07K16/14GK103214572SQ201310136959
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月19日 优先权日2013年4月19日
发明者江飞剑, 王海彬, 杨承刚, 韦国栋 申请人:中国人民共和国台州出入境检验检疫局
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